一个可鉴别西方猪种断奶仔猪F4腹泻易感性/抗性的MUC4分子标记及应用

技术领域

本发明涉及一个可鉴别西方猪种断奶仔猪F4腹泻易感性/抗性、可用于种猪遗传改良的MUC4分子标记及其MUC4分子标记在选育改良种猪抗腹泻病性状中的应用。

背景技术

仔猪腹泻是养猪生产中的常见传染病，给世界养猪业造成了巨大经济损失。丹麦养猪业大规模的场间调查表明:6％-7％的新生仔猪患有腹泻病，使断奶前仔猪的死亡率达2.7％，占此期间整个死亡率的11.9％。即使是病愈个体，也会严重影响生长发育，有的形成僵猪，导致饲养成本增加，销售收入下降。

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)F4是引发新生和断奶前仔猪腹泻病的最主要致病菌，以我国和丹麦为例，分别有约35％和40％的仔猪腹泻病是因ETEC F4侵染而引起的。在我国，其致死率在10％---30％之间，在个别地方甚至比这个比例更高。

ETEC F4根据免疫学特征分为ab，ac和ad三种亚型，其中F4ac是最主要的致病原，在美国、西班牙和韩国，ETEC仔猪腹泻病例中只分离到F4ac亚型。ETEC F4入侵猪肠道后，通过其特异性黏附素附着于小肠上皮细胞表面的受体，大量繁殖产生肠毒素，致使肠上皮细胞分泌功能亢进，大量水和电解质进入肠腔，造成肠腔中大量液体积蓄，超过了肠壁重吸收能力而引起腹泻。由此可见，仔猪小肠上皮细胞有无ETEC F4受体，特别是有无F4ac受体是仔猪被ETEC F4感染时是否发病的关键。无受体猪表现为抵抗型，有受体猪则表现为易感型。分离和鉴别猪ETEC F4ac受体基因及其抗性位点因而成为猪ETEC F4ac腹泻抗病育种的关键。

Grange等对F4受体的性质做了一系列详细的研究，在猪小肠上皮细胞分离到两种粘液型唾液酸糖蛋白(Intestine mucus glycoprotein，IMTGP)，分子量分别为210kDa(IMTGP-1)和240kDa(IMTGP-2)，这两种蛋白被认为是猪对F4ac易感性和抗性重要的决定因子。瑞典/丹麦的Anderson研究小组及瑞士Vogeli研究小组先后将ETEC F4ac受体基因定位于猪13号染色体q41区域。最近，Joller等通过精细定位进一步将ETEC F4ac受体基因定位于q41区域SW207与S0283之间。申请人通过利用大规模白色杜洛克×二花脸资源家系群体在13号染色体上采用高密度微卫星标记将F4ac受体基因精细定位于S0283邻近区域。MUC4基因位于该区域，结合其生理生化功能分析，认为MUC4基因极有可能是肠毒素大肠杆菌F4ac受体的一个重要候选基因。

鉴于以上背景情况，申请人深入开展了猪MUC4基因多态性的搜寻、鉴别及其影响仔猪ETEC F4腹泻病性状的研究，以期建立标记辅助选择技术开展断奶仔猪腹泻病的抗病育种工作。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一个可鉴别西方猪种断奶仔猪F4腹泻易感性/抗性的MUC4分子标记，通过现代分子生物学技术检测该标记，利用该标记辅助选择(MAS)选择有利的个体留种，以显著提高种群断奶仔猪的抗腹泻病能力，大大降低仔猪死亡率。

本发明的第二个目的是MUC4分子标记在选育改良种猪抗腹泻病性状中的应用。

本发明的第一个目的是这样实现的:

(1)多态性位点(SNP)的鉴别:

依据猪的MUC4基因部分全基因组序列(DQ848681)，大致每隔6kb左右用公用的Primer 5.0或Oligo 6.0软件设计一对引物开发一个特异性标签序列(STS)，共设计4对引物:STS13383 FP/RP；STS15580 FP/RP；STS21208FP/RP和STS26002 FP/RP(详见表1)。扩增猪基因组DNA(脱氧核糖核酸)。

       表1 MUC4特异性STS开发与多态位点基因分型引物

注：以上引物设计主要参照猪MUC4基因序列(GenBank收录号为DQ848681)

25μL的聚合酶链式反应(PCR)反应体系中，包括40ng猪基因组DNA，1.0mM MgCl₂，100mM dNTP，正反向引物各10pmol，3单位DNA聚合酶(Taq酶)及1×PCR buffer(缓冲液)(上海博采公司)；扩增条件为:95℃3min；94℃ 60s，53-63℃ 30s，72℃ 45-90s，共35个循环；最后在72℃延伸10min；PCR扩增产物采用QIAquick DNA纯化试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)纯化合后委托上海生工生物工程有限公司直接测序，测序结果利用BLAST Search(http://w.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST1)在线比对验证，然后使用公用的DNAStar的SeqMan软件分析测序结果，发现4个STS上分别存在一个多态位点(SNP):g.13383C>T，g.15580A>G，g.21208A>G和g.26002A>C；

(2)位于猪MUC4序列的第13383、15580、21208和26002等4个核苷酸位点为:

1    gctactcatg gtacttctga ttggggttcc tctgataatc aggatgttga ccatatattc

61   atgagctggt tgtccatctg tatctctttc ttgaggaaat gtctattcag gtcctttgcc

121  catttttcac ttgggttgtt ggctgttgag ttgtaaaagt tgcttatata ttctagagat

181  taagccctta tcagctgcat catttcaaac tattttctcc cattctgtaa gttgcctttt

241  tgtttatttt tggtttcctg tgctgtgcaa aagcttgtca gttcgattag gtgtcattgg

301  tttacttttg cttttatttc tgttgctttc ggaggctgac ctgagaaaac atttgtaagg

361  ttgatgtcag agaatgtttt gcctatgtta tcttccagga gtttgattgt gtcttgtctt

421  atacttaact ctttaagcca ttttgagttt attttcatga tttgcatgca gctgtccaca

481  tttcccagca attcctgctt aataaaaatt tgtgtatgta ttgcttgaaa ggacagtctg

541  tgtattttaa ttaaaaaact gttttgagac tgaagctctt gtatcttgcc ttccatatat

601  ggcttatatg gagagagtag gagtgttctg ggtccatttc cattatacca cacaatgaat

661  gacactgaaa acatattagc acaaagatat tcactgaagt attatttatg atgaggttac

721  acagtggccg tagaaatatt agacaggggt aatcctgcag ccacttattc tgacccacca

781  tgatatacag tggtacacgc gggaaaaaat tgtgttcttt tttttgtttg ttttgttttg

841  tttttttttt gtttgtttgt ttgtttttgt ctntttgcca tttcttgggc cactcccatg

901  gcatatggag gttcccgggc taggggtcta accggagctg tagctgccag cctacaccag

961  agccacagca acgcgggatc caagccgagt ctgcaaccta caccacagct cacggcaacg

1021 ccagatcctt aacccactga gcaaggccag gcatcgaacc cgcaacctca tgcttcctag

1081 tcggattcgt taagcactgc gccacgatgg gaactccaaa atactgtttt ttttgttttg

1141 ttttgtttat ttgtttttgt ttttgttttt ttccttttct agggccgctc cctcggcata

1201 tggagtttcc caggttagaa gtcaaattgg agctgcagct gccggcctac accagagcca

1261 cagcaacatg ggatctgagc cacatctacg acctacacca cagctcacgg caacgccgga

1321 tccttaaccc actgagcgag gccagggatc gaacccacaa cctcatggtt cctagtcagg

1381 ttcattaacc actgtgccac agtgggaact ccaaaattgt gttcttaatg ctacaacttc

1441 acagaaggaa cctgtcttgt caacgagtcc ttgtatctta tatttaacgg cactattgaa

1501 acatatgcat catcatatct ttaatcctct acaggtggaa acactatgac aactactatt

1561 actgaggaga aatacccatc gaatatcagc tacataactc ccacaaaaga aaacctctca

1621 aaagaagtaa catcaacaaa caaaactgaa agaaaaaaga gggaaacttc aaattctggt

1681 acttacaaat caactatggt gagttcatca gtctcagcga caactggacc agggccccag

1741 tcaacctcac cctcttccac cacctctgct gaggggacag cagcatcttc tctggtccac

1801 cagactcaga gcatggagac caccagagaa acccacagca gcgccatcgc agctgtgagc

1861 tcctcgacac ctttatcttc cacaagtgga caccctctta cagaaggcgc ttcccgggag

1921 acatcccctt cgggggaccc aacctcttca tccgcgtcca gacccacccc cacacctgca

1981 acaacatcag ccgtgtcgac agcacctgct tctacagatg gcacttcccc cacttccagc

2041 ctaagcaaca cacccccaac aacatcacgg gtggtcacatccccagttac aaccgacacc

2101 actgtgggag gcccagggga cacgtcccca cccggcacaa gaaccatcac tccaggcacc

2161 tcatcagtct caacgacaac tggaccaggg ccccagtcaa cctcaccctc ttccaccacc

2221 tctgctgagg ggacagcagc atcttctctg gtccaccaga ctcagagcat ggagaccacc

2281 agagaaaccc acagcagcgc catcgcagct gtgagctcct cgacaccttt atcttccaca

2341 agtggacacc ctcttacaga aggcgcttcc cgggagacat ccccttcagg tgaaacaagc

2401 tcttcagcca catttagacc gacccccata tctgtgtcgt gtttccatac ataaaccagt

2461 atttcttctt tttctgcatc agctcctggc cacaaagtca ccttgagctc cactgcccta

2521 ttcacaggtc accccacttc tctgtctctc atgagccctt ttcccttatc cactgtgtct

2581 tcaagatcca cagtgaaggc tgggacatca ggtaggtcgt aaccctgggg tcttagtctc

2641 ttgcacttgc ccagttggct caattcagtg cagaagagtg cttgagagag gacattcaat

2701 tagcactgcc aggctggagg tcaggtccag aaggttatga aatcagttgg ggtttggtgg

2761 gtgatagcct caccatcctc tttaccccag gtggcagctg cttctcctca ggcagtggtt

2821 ttggtgtgac tagaagacag ttttctagct gtctcttcca ggttctaaag tctatgactc

2881 tgtttaactc tgctaccccc tgactgttag actcactcct gtcttctctc cctgcctgcc

2941 taggaacaatcaccaccttg cagaagacag acagcaagacaagcacagca gcatctctac

3001 cctcaaccac ctcccaggct cttacaacttccactgctca cacttccaca ggcactcgct

3061 caacagctgc cccagtccct cccaagccga agaaaggtga gtgaatccat agagctgggt

3121 cctcttcacc ctgggtcaaa gaggatggag ctatatgtgg aggttatagt tgtggcagct

3181 ggactggatc taccaatgag gatctttgtg gggaggtagg gggaccagtt ctgtggatcg

3241 ctccactgcc ctgggtgtgg caagtccagc tgctctctgt gtccccttga taggggtggt

3301 gtaactgagt gctttgtctc agcctgcttg cttacagact ctcgagtcag aaaggcctta

3361 cagtgaacaa tgtgacatca tcagtgttgg gtgctgaggg ctgactttgc acatggtgct

3421 aggctaagag ctggagataa aaaaatgatt gagtcactgt ttagtgagac agccttgctg

3481 cctcagtagg tgcgattaga ggcataaacc cagggtatta ggtacacaca atggaaggcc

3541 ccaagggaat attggggtgt gggttcaagg tgaaaaggag tctccctgga aagggtgaat

3601 aggatctgcg gggaggggaa gtgccccaag caggcaggag ggcctgaata gctagaataa

3661 aggctcggac aggaagagca gtcctagtat tgcatgggac agagatcccc atagcatttg

3721 gggctgccag cagtaaggtg aaaggtgttg agaagcaagg ttgttatgtg aaggaatctt

3781 gtagatgaca ggaaccaggg agaatgtggc tagatttgca tttaggaaca gtgtcctcat

3841 ggctgggatg gaggatgaac ttgcaggagg ccagggcagc agggtagata tcactgaggt

3901 tttccaagca agaccaggtg aaggctgcca gtatggaaag gaggaggccc ctttgagaaa

3961 tgtttgggac aaagtttctc aaaccggagc ccaagggcct cggtagggga tcttatgaca

4021 aattctagca gggggcagtg tgtgtgtgtg gcgggggcgg tcttcaagtt tacctagaga

4081 cataacatct taggaaacaa gtctcattct gtgaaacgat cttgcaatta ctttactgca

4141 ttagaggcat tttgtctttt aacatttcac agaattgtga gtaccgtaat aggtgcagaa

4201 taatgtgggg gtgttctgat agctgttttt cttcaaactg gggaaggcgg agagtaccat

4261 gtaagggagt gaaagaggag atgggttaaa tgcaagtgga gagggggaga gagaagtcct

4321 tgacggctct tgcttaagcg aacaggtcca agggtggagg agcagcttgg ggacactctt

4381 gcgggacccc tgccagccct aatgacatca gggcccatga gaacttcctg cttctctttg

4441 tactggccca ggcgttcccc tcttccccta cgggccgcag gctggagact ggcagtttgt

4501 gagaaggacg gtggacttca cctcgccact cttcaagccc cagattggct tccccctcgg

4561 ttcctctctc cgggattgcc tctacgtgag tccttggctg cagcccgaag gcggggggcg

4621 gggggcatga cctgcattcc tcaggccttt cttctccctc cagggctcag agatggccct

4681 gtgatcatgg ccataactgt gactgtgatt gacagggaga acggaagcaa cgcttgtcag

4741 gcacctgctg tgccccagtt gctgcctcag tttgcaccat ctttaacgat gggcaccagc

4801 tgaggaagac agggagctag gcgaggcccc ttacccacgt ggacagaagt gtggccacct

4861 cagtagagag gtcctggggc ccagtaagct ctccactgtt ttcatgggtc cttttttaca

4921 agtaggaagc tctgctgggg aaacctgtat gatgctgttc acacggtctc tcattgtttc

4981 ctggttccct agtccaagta gcccatgtct ctggggggag agcagaacag cagtcgtggc

5041 cctcgagagg gctggtcagg acacactaca aaagggtgac tcagcaatgg ggtcagggta

5101 tcctttagcc ctaattgatg tggcacaagc ttcagggtgg gctgagaggc tttactctgc

5161 tctgggatgg gctggtctct agacgggtgc cactgagaca ggacaaaact accaccttag

5221 gaaagactca ggacataaaa aaaatgtgct gagggtgaag agtatttgtg tgagaactat

5281 atacagaggc tgtcccagca tgcagggaga tggatgagac cttccagagg ttgttggcat

5341 ctctctggtt ctacccagca gggcccttca gggtcttgca tcagtccagg agctggcccc

5401 aagccgaggc tccttcccca cctcccgccc tgaatgctaa ccaggagaac ctttgtgttc

5461 agttcacaga taatggccaa atcattttcc cagagtcaga gtaccagatt ttctcctact

5521 ccaaccctcc cctcagaggc tttacaggcc aggaccctgt ggccctggtg gctccattct

5581 gggatgatgc tgatttctcc aggcaaggaa ccacgtttta ccaggtgggc ctttcaaagc

5641 tcagcattca gggtcctcca gcagccagca aggacagaca gagggctgtg tggagggcct

5701 tgcaagtgtt actgctgtca gagcctaggctcagtgtggg cagggactaa aacttaaatg

5761 tgaggatgag gaggaagcag atgaggacaa aatcatggga agactgaagg tgccagggat

5821 ggggattggg gatccatcgt ttgattttag gatgaggttg tagcagggtc cctcctaata

5881 aggctgagtt aagcaaggcc cctgcattgg gctgatgatt ccattcagtg ggagctattg

5941 tgtaatgaaa gctaccacag gcaaaggtac gtcgtgcccc tgccaaggac caggcactat

6001 agaaggtcca aagatggaga aacatgtgcc tgtcctcaag gagcctccag tgggacacag

6061 ggcgatacag atgggcacag gtggctgcac aatccaagcc agtctgtgct aagcgaggca

6121 caagttcaag tccagaagtt actggcctcg actctccact ccacataccc caggtttccc

6181 tgcagcccga acctgatttg atcttaaggt cagaggtgct aactgtgaaa atgtgggcct

6241 gggacggggg aggatggaag atatgggcag actcaaatga gcaggatcac catgcagaaa

6301 gtggggggtc gcccaggagt gttgagctgg gatccttgtt tcttgtctga atctgccttc

6361 ttttctagga gtatgagacg ctctatgatg aatacaacca gctagtgtgg gaggtggagt

6421 attggattaa aatgttaaca aacacctgga actacaaagc caggtggaca ctaaaggtca

6481 cgtgggtcca cgcccctgcc tatcctgccc agaagaccct cagggtgagt ggaccagtgg

6541 gcagctccct gggaaccatc tggaagtcag acatcctaga atcctaggca ggggccactc

6601 ttctaaaatc ctttcggact cttacagaac ctcacactag cccagagcac tgggtattag

6661 gaggttgaaa catagaacgt ggaatgtcca taagtcaaaa atggctggca attggcaatt

6721 ctatatggct caacctaata tttttatcca catattagaa acgaggagtg ccctggtggc

6781 tcagcaggtt aaggatctgg cattgtcact gctgtggctc tggttgctgc cgtggcacag

6841 gttcgatccc tgatctgaca attttctgaa tgccaagggt acaacctaaa taaataaata

6901 gaaatagaaa gaaaatagcc agaaaatata actgtgaatc aggtagtcaa aatacatatt

6961 tttttaaaag aacgaaatga ggaagatgat ggttagaaaa gttaagtgac ttgcttcaag

7021 gtcacccagc tagcaaatga caaagccagg cctgaaacag aggtttttct gactctgcac

7081 tccagctctt gaccaaaacg catccactgg aagcaggcac accacatgtc cccccctatc

7141 tggggcctca ccaccctgat agtcacaaag ttcttccttg tgtctggtct aaagtcactc

7201 atttcttcat tggctcaaca agctcattgc ttacctactt tgcacaagca cagtgctggc

7261 cccggccttc agagaacctc cactctcacc tgtgtggtcc tccacgccat ccaggtggag

7321 gggacatttg gacaatatcc ttaaatatcc ctgaggaagt tccttaggcc tcccccagct

7381 ctccaacgtc cgctgatcac tcaggttgct gaagctttct catacaaacc ctcttctcac

7441 tgaattctgg cctagagtcc tttggctccc ttcctgggga agaagtccca aagaaggcaa

7501 atccaccatg gcaggtgctt ggacagtcag agtgaaatct ctgcataatt ccaaatttgc

7561 ccatatttta agcccacacc ttagctctgg gtaggccagg aaacagtgat atgggtgtca

7621 tgcccaggct gtgtgacagg taatgggaca taccagatct ctcacgggca tccctatgct

7681 tgtctccaac caatccccag accaacacct accaggccat cctttccacg gatgggagca

7741 ggtcctacgc cttgtttctc taccaaagcg gtggcatgca gtgggatgtg acccaacacc

7801 taggcaaccc cgtcgtcatg ggcttctcca ggtaggacag agtggggctg tctgcattga

7861  gtagacagca ggaggcggtg caaagcaggg cttgcagctg cacacgaact ccattcccca

7921  aggatacgcc aaaatcctcc ctgcccatgc ttctgattca cgctgactcc agttcccact

7981  tcttgctgtt tcaaattaaa agacccctat tcactctgcc gttctctttc ctatcaaggt

8041  ctccgtgcat gtgataataa tccccagagc cttgacttct aggacttcca ctgacagtag

8101  ctgacctcac ttgacttttc agagcttaac aataacagcc aacatttatt ataccagcac

8161  tcagtatgca ttattttgta tattacaaca accccatgaa ggagatctat tttattaccc

8221  attctacaga tacagaaact gaggtacaaa tagataagtc attgcccaaa gtcacagagc

8281  tgggatgtgg caaagtggga agctgaaccc aaatataagg ttgaaatctg ccttcctgac

8341  tttcgattgg ctggaaatta acctctcacc caaggcacca gcagcgtctg tcagtggcaa

8401  agatggagaa cagagagatg gatggggacg tgggttccca agggaggagg tggctcagtc

8461  tctgacacaa cagttctcaa ccttgccatg tgcgccactg gctgtgaagg tcgcatgtaa

8521  tttgttactg ctaattgcta caaatgtttt tctcttagag tgtattcagg attgcgcctg

8581  taattacatt gctttcactt gcttagtgat gagccctgaa ggaaaaagaa gtagaattat

8641  ccgaccagct aggaatttca caccattctg agtgcaccca cggaaggtgt cacacccaag

8701  tgcgtcatct gtcctgtgtc agagaggaga aaagatcagg agtggctgct ctgaggcgtg

8761  caccctgagg ctgtgggctt tgctccttcc ttccaggggt gggggtgggg cacacccatt

8821  gcctggtcct cactcggtgc tgagggattt accagtgtta ctgctttgaa tcttcacaat

8881  actgtcaccc ctttgacaca gaggtgaaaa ctaagaatca aagaggttaa attaacttgc

8941  ccatgatcac caagctacta agtagtggaa ctgggggttg aatccatgac cgagagactg

9001  gcttttaacc ctcacagcca gctgtgccct gcagcacccc ttctccaatt cctagttgaa

9061  gggaaactaa caggaagggg gcctgacctg ttgttctcac acccctgtct catgacccgt

9121  ttcctacagt tcaccatcag atgtggaatc aattagagtc tcctattcct gccccaagcc

9181  tcccttcccc actcctgctt ggcaccgggt ctatgattct ggctggctga cgaaacgact

9241  gaacagctga taactaatga ctggctggac tgagtgggtg accagctgac tgaccagctg

9301  tatgaatgag taacttgctg actgagagga aaaactgtgt gacagtggct gaagattctt

9361  ccttttgcct acagtggaga tgggtatttc aaaaacagcc aactgacatt gcagccagtg

9421  tgggagaagt atcgtccaga ccagttcctg gatcccacat caggtaaaag caccacctta

9481  tcacacttga gggacccaag tccccttctg tcctcccctc catgtgccat gacagtccca

9541  gagggcagct cccttgcatc tccaccatcc caaagggtgt ttccagcaca actgacttcc

9601  catggtgcaa tccagatgtg gcactgccca gggagtggtt acctcccgtg ccctcacaca

9661  gcacaaagtc atttgaggct gcttctcctc cctgggcgga gccaaacaca ggagagctat

9721  gagtgggggc cctgatcctg gaagtgagga caggggcatg gcaggaggtg aggaatgaat

9781  gggcagctag gacaattctc caagtgtcct gtcccagaac agtaatgaga cttcattctt

9841  caatggaatc taccaagagg agctccaggg gatctgacat ctattcagtc ttcgtttatt

9901  gagtacctgc tgggtgtagg acactgtgct aagagccaga agtatgagaa atgaaaaaga

9961  ctatgtttgc tgtcaaagag ctccccctct ggtaagaagg ccagtactct aggccccacg

10021 ggcctcctcc atgatttgat tactgtccgg tgacccctaa agaaaagaaa tttcagtttc

10081 caaatgtgac agaacaaagg atattctggc attaaaaatc tgccatgtaa agtatgaagc

10141 attaatccag ttctgattgc tctgtggcaa caacttctga taaacagaag ttaagtcaaa

10201 tcatgggtgc catcttgtgg agaaagctgt cctattagac tagggccctt ctatccagtt

10261 tgtgcttgta gggggcgcaa taggatagtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg

10321 cgtgtgcatg agcgtgcatg taaggcccct ctatccagat gcatctgctt gtgacgtggg

10381 gatgcaatag gagtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgttg ggggagagta tctggtgtgt

10441 ttcccctgat accaggccac agtggagaca atgcacagat gatcataaac aatgattact

10501 cttttccaaa cctcatcaaa actgtagtta gcttgatact ttcttttaca cggggtcagg

10561 gtcaaaatca aatacattat atcctattgt attttactgg actctggagc ccacactcag

10621 ggtttggctc tgagttggat tacaggtgag gccctcctgc ccagcacttg tctcaaggtt

10681 tcgctgtaag atccaaactc ttgaggtttt ggaggtcaca tcaaagggcc tttggggagg

10741 cactactgcc agtctgactg ggtccattcc tagaagagct gtccagggca gggggagtga

10801 catacagagg gtgcatttat gagttttgtt tgttcccaaa actaaagcag agcctgtggc

10861 ccaggccctg agatcacccc cttttcctct gctccccagg cctccggggg ctgcagatct

10921 ataagctaca caaggaagac aagcccaact atcgtctctg gtgcctgcgg tggttgaaga

10981 gacagtctca ctggtccggc tggggctgga accaggtctc ctgcccctgc tcctggcagc

11041 agggactatg ggacttaaga tttcagccca tcaacatagg tgacacctcc ttcatagtat

11101 cctgtggtgc cccactgtcc ctcacaagcc tgcccaccct ccctttggcc ttgcctgacc

11161 cgtctcttcc agggcaccct cagttcctcc ccagaagcac cccctaccgt tgatgcacac

11221 accaaaggca tcctgggcct gagtgtgtct ggcttgttgc aggctggtgg ggcatcgtca

11281 acaggcagct gtgcagcttc tcctcctggc gtgggagtgt gtgctgcagc tacgggccct

11341 ggggagagct tcttgaaggc tggagattgc agagtccttg gcagtttggt atgtgtgtcc

11401 acagagaact tgagcccagc ttttctggag ctttctgttcttccctgtca gagaccagcc

11461 agcagtgaga cccacagaag gaaggctctt gtcccatttc ctcccagcta ccttccccct

11521 ctggccttca atttcctgat ctggtaacat gaggaaattt ccaacatccc ttccagctga

11581 caccctaggg atttatgatg gagtccctct tgtcccatct ccacttcgcc aaaagcccca

11641 gcccagagtc gggcatcttc tagggaagag aggggcctgg tctggccctg tccatcggaa

11701 cccagattag cagctgtgca ggggaagact tggagtcgcc tcctgcagag accctccaaa

11761 gcagctagag aggacagcgt tggggggcca gggtcatgcg tgtccttctc acctcctcct

11821 tgtaatcaca gcctccttag tccccacacc accagccatg ccctcctgct cccacagcac

11881 tttgagactc agcaccccac ccttcaagaa aggaagggcc ctgggagttc ccactgtggt

11941 tcagtggtaa tgaacctgac tagtatccat gaggacacag gttcaatccc tggcctcact

12001 cagtgggtta acaatctggt gttgctgtaa gctgtggtgt aggtcgcaga cacgacttgg

12061 atctggtgtt gctgtggctg tggtgtagac ctgcagctgc agctccgatt tgacccccag

12121 cctgggaacc tctatatgcc gcaggtgcgg ctctaaaaag acaacaacaa cgacaacaaa

12181 gaaagaaaga aaggaagggt cctgtgcctg gcccactagg ggctttgcta cacatggctc

12241 caaataccca caagggagac agtcactggt caatggcttc aggtcattga gcagggtggg

12301 ttctgaactg aggtgtgccc gattcctaaa ccataccctt gccaccgttt catcctgcca

12361 gaactgccca gtgctacttc ctgcaggttc tccatctccc ccaacacgct gctcttcttc

12421 acagaccaag aactggagcc ccagaactgg tgctgccgct tcaatgacaa gccctccttc

12481 tgtgccctgt atgagctaat gcggccccga atcggctgca gtgggtacca gcccccgagg

12541 cctggtgagc tgctggagcc tggctccagg acagggcaga gacagagcat caggggaagg

12601 gtagcctctc aggacctgac caaggcagca caagcttcct ggggcagggc tgtggccaca

12661 cgggaggatg gagatgggtc cagtgtgtgg agatggcaaa cgagaaattt tatatgtggc

12721 cttgggggag gggaggtgtt gggggtggga aaatgaagat gcggtggggcgcccaagggc

12781 aggaggaatt ctggggaggg gtctgtgctc catgagcacc tccccaggct ggagtctcct

12841 gagcaaacat cctgtctggg gccagtaagg aatcccaggc ccttccctgg tccactctgc

12901 caatgtggta tctcctcttt tccagcctgg atgtttgggg acccccacat caccaccttg

12961 gatggtgcca attacacctt caatgggctg ggggacttcc tgctggtccg ggcccaggac

13021 agaaactcct ccttccagct gcagggtcga actgcccaga ccctctcagc ccgggccacc

13081 aacttcattg cctttgctgc atattacagc tccagcagcc tggaccccat cacggtgagc

13141 cttcagctgg caattgagtc ccaggaggag aaagagaagg aagaagggca gggggcagag

13201 gtgagggagg atgcatcctg ctggcacagc agttccagag tcaaccctgg aaacatagga

13261 ttagggtctt ggctccacca gctgtgagac tgaagaaagg acctactttt cagtgcctcc

13321 cagtttttct tagggtaaaa tggggacgat actactacct acacacgggg ctgttgtgag

13381 atctaaaagc taatctaaga acccgtgcca agggcctctt acacagtggc tagcatcacc

13441 tcatcgtcac actcccagtc accttcgctt tcatccaagc cccaggctct aagctctcgg

13501 aagccttctt ccttggcctc tggacccacc tgcaggtcgg gcttaggcct ctgccaattc

13561 ccttccaggt tcaatggctc cttgagccca atgacacaat ccaggttctg ctcaataacc

13621 agactgtaac atttgagact aaccatgcag gtgccgaagg taggctgggg atggccgtca

13681 gctgccctct cctgcttccc tgggtcgggt cactggggag cagggtgctg gggtggagag

13741 gcagcagcat cgggcagagc agagtggtcg ccacccctgc tgtccttcca gcagctgtgc

13801 ctgagcagct tcttcactgg agccgagcat tgagcttttc ctccgcactt ctctccttcc

13861 tccagggctg tgacggcctc tctgggcaat gccagggaga actggttggg ggggcgggtg

13921 ccatgagggt gtcctgtgag cttggtttgc ggctactggt gtaggacctg gcagggcatc

13981 tcccagctgc tctcagcctc ctctccacat cttgaacctt cactactgcc aagtcttggg

14041 cctctaggac tccaacactg gctgtttcat catctgtctc cccaccttct aggccaggag

14101 atgttcaaca cctctggagt cataatgatc cgcaatggct ccacggtgtc agccagcttt

14161 gatggggcgg tgaccatctc agtgatcgct ctcgcccaaa tcctccatgc ctcctgcggc

14221 ctcccaaagg agtatcagaa ccacacagag ggcctcatgg gtaaggagcg ggcaggcccc

14281 tgcctctgca gcaccagctc agacccccgg cctacaggca gctccccctc ccgtgggtct

14341 gcggatactc cgggtggagt ttcctttttc ggcctcctgg gagcagagcc ctgagggtac

14401 agagcagcag ggagggaggg gggacccctt cagctacctt tgaggctcac ttcccatcct

14461 tctgaagctc tggttccagg gcagccaaga aggaatcaat agtgggctct gggagttccc

14521 attgtggctc agcagtttaa ggacccagtg ttgtctttgt gagaatgcgg gtttgaaccc

14581 tggcctcact cagtgagtta aggactggca ttgccacaag cagctgcagc gcctattcta

14641 ttcaacccct agcctgggaa cttccatata ctgcaggtgt ggccataaaa agagaaaaaa

14701 aaaagaatgg gctctgactg ccttgggtgg cggggggggg gggaggaaag gggactgatg

14761 gagagtttga gttggtaggt gtaaactatc acattcagaa tggataagcc ggggggtcct

14821 tttttccccc cccgggaact atatcccatt ttttggggta gaccatgatg gaagattttt

14881 ttagaaaaaa ctttttttaa gtaagggggg ggggggccct tttggggggc cgccgaaatt

14941 gccccccccc cgtaaatcaa ctatatgcta attttaaaaa aaaaaaaaaa aagaatgggc

15001 tctgggaatc atgggaccag cagccacccc accccccact ctggctttat acctcccacc

15061 ctccctccat cctccgcatt ccctcccttctttctccttt cctccttcat ttccttcttt

15121 cctgaagcgg aggggtgggt tctgaggtga cagcccgttc ccctcctcct ggaggactga

15181 atggagaaga gatacaatgg acggaggccc cctactcctg cacgcatctc catgtgacca

15241 gccggatgct cccagggaag ggcaaagcca cagtcccagg atggctgact cctgctctgt

15301 ccctcagggt tctggaacgg caacccagat gatgacttca ggatgcccaa tggctctact

15361 ctttccccac ggagctccga ggagaccctt tttcagtatg gaatgacctg tgagtctggt

15421 cctcagagtc ctcgggtaga tgggcagggc tgctgcatgg tctccctcag gcctgtggga

15481 accagacctc tgtcctttgt gagagagggg tagaaaggaa gagatctaaa gatgctggtg

15541 ctacccccag atttgtcccc tctgtcccca acccacctgc gcctctctac ctgggagagg

15601 ggacaaggga ggtgggtggc cctcagtcac tagagtgagg atttccagac tcagaagctg

15661 gaagtcactc tgtctctcca catcccctgc cccaacccca aaccatataa gggtaagggg

15721 tggacacaac agaaatacag ccagaggccc accctggtaa caccaccatc atgccttgtg

15781 tgttttaggg gagatcaacg gaaccagcct ccttggcaag aggaatgacc atgtgtctta

15841 taacttcacc cctgtcttcc tttcacaact tcggggaaac aagtccttga ataaaagttt

15901 gacttccagg tgtaatggag atgaacaatg catctatgat gccctggcca cagaaaatgc

15961 aaaccttgga gagcacacta tgcggctctt tcgaagctac cagcaaatga atgctacctt

16021 gagtgagtgg cgtgaggctc ggggaggtgt gtgcagagtt agggggcaga tgaggagccc

16081 ctcttccaag acacccctta agctacacat ttttttccta aagttattca acattttaat

16141 cccctcctaa acataacata aatttttggg gggccacacc catggcatgt ggaagttccc

16201 aagcggggaa tcgaacctgc cccacagcag tgacccaagc tgctgcagtg acaatgcagg

16261 atccttaacc tgttgcacca ccaagagaac tcctaagcta cacatttttt aatttagccg

16321 attattttgc tcatgttgtc cctctgctca aatcctcccc tgactcccca gctcactcta

16381 tccttatgac aaccttcaaa tcaaagccct gtgcactcca gccccactgc ctctccacac

16441 tcttctccta gaacttctag aacctcgctc cctccactgc atccccactg cttcttcatg

16501 ttcttcaaac acgccaggct cgcccccgac tctgagactc tgcacatgtt ctgttctctt

16561 tgcctagaat accttccccc agacacccac aggtcgctcc tcacctcctt caagtctcta

16621 ttaaatgcca ccctctcagc agtgcctttc ttggctaact tgtctaaagt ttcaccttca

16681 ctcacacttc ctatttgcct tccctgattt attttttctc tttagcatct ataactatct

16741 aatgtatttt ctaattgtag caggtctttt tattatttgt tcattgctat gcccttacga

16801 cctagaacaa tgccagccat agagtaggtg ctcaataaat atttgctaag tgactaactg

16861 aatgaatgaa tgaacaacag aatggaaata ccagggctcc aaatccagag accagtggaa

16921 aacttttact ctctcattct acttcctgac aatgtaatat ccacctagat ataaccctca

16981 gtgtttccag ctctcctcca aaggtaaaat tccacaatgg cctgaacagc tctgtcctct

17041 gatcacttca taccatgccc tgcataactt tctcaccagg aaagaacctg aaatgaatct

17101 tgtttgggga gaaaataaag agagagtaaa gatttggctg ggtgggcaat acaacaatga

17161 cctgctctgc atagatgcaa gagcaggtgc atagattatt tcctgcttct ggaggtgggt

17221 cccagccctg ggaatgcctc acacaagcga gaagactaga gagagagaaa ggaggcccag

17281 aaggcaggaa atatcctgcc ccagaccctg accccttctt tgtgtctcag atcagtaccc

17341 gccctccatc aagggtcctg atgtggtgaa aacctatatg ggacaggcca gccttgttaa

17401 ttacaccagc agctctgaga acgtcacatt cactctcaga cacaactgca ctgacttcaa

17461 gctctctggt aagaatgctc ggctggggca gttagtggtt gaggtctgag tcaagctttg

17521 ggtaattttg cgttattata ctctgtgcaa cttcatgtca cctttcattg gaatatctag

17581 gaccaacatt acccaggaat gatccatata aatcaaatag attcccccca gagattaata

17641 gtgatctggc cagctagctc gactgactcc aggctgattc aaagatcatt tcttctcatt

17701 cttgtaatat tgcaaaatca tctttatgca atcaccaagt tattagaata aatttttttt

17761 tgtctttttg tctttttagg actgcactgg tggcatatgg aggtttccag gctaggggtc

17821 aaatcagagc tgtagctgcc aacctacacc acagccacag caacatggga tccttaaccc

17881 actgagcaag gccagggatc taacccacaa cctcatggtt cctagttgga ttcgtttcca

17941 ctgcgccaca acgggaactc ctagaataaa tatagcaatt aaaaagtact aatttaaaat

18001 atttgcacat ctattaaaag aaggatatca tatggaacaa gatttaaaga aatacaaata

18061 ccttcatttg gtaactttct cacaattttg atgtttgtca accatgttta cctaactttg

18121 cccctccttg cctgcttttc tgtactgggc ccaagcagtt tcactttccc tctcagtaat

18181 ggtgtggaga ccccatttca gaacgggaac catgatctgg gtcaagagtc aaagcacaca

18241 ggttacagct tgccttttag ggccagccct aattaagctg gtgactgctc tttgctaagc

18301 cagagccctt agggaccttg ctctgagcac ctctctgcct ctctttctct gtgcataaga

18361 agagacagca ttgtctgcac cctgtgctcc atgtggcatg ctccctagtg cctaatcaat

18421 ggcatcagga gactcactcc tccactgggc tcctatcctg aagagggagg tcctggaagt

18481 gactctcatc tgctcccacc catcagctct tttcaatcca ctgttttaag gagacttccc

18541 tattttcttg aaaaacataa gacaggttga atcagaagag tccttattga tacacagcag

18601 tatttccctg tagcctgggg tctggtcaaa ggtccaggaa atgagagcaa gtgggtgagg

18661 gatgaggctg ctgtgaagct gaggtcagtc tggcctgaag tgtagcctga gtaagtgttg

18721 ggaagatcct ggccttcacc ctccatggct ccccgccccc catatcccat cctagtgcag

18781 gtccaggcag ggttaccctt tgggggcttt ggggaggtgg ggggcaacca ccttcatctc

18841 atggagttct accctagaat cacttagttg ggctggtgcc acctccaggt tggagtgtga

18901 tccaacagaa actagaaacc agccttgctc aaggaaatgc ctagtaagat tggaggggtg

18961 gtctgacagg ggtgggggac gtccagcatc agcacttggg gtattagatg ccaggatgtg

19021 tcaggcagca gaggagatga ggctcccagc tctcaaaatg atctgtcttc cctgggggca

19081 gagaatggga cgttgctatg gacaccacag tcactgaaac catgtcctct ggagattctg

19141 gcaagaagtg ccaaggatga cttgtcatct gtactcaagc caagaatggt ggtctgcact

19201 tgccaggcag agagccagtg tttatataac cagaacgatc gggtgggcaa ttcctccctg

19261 gaggtgagtg tgggagaggg tgggaggtcg gtctctgtgt tgagggaagg gaagtgggaa

19321 ttgaagggat gttgtcattc agcccctctg tcctaatgtg tgtgttggga ggtgggtgga

19381 gctgtggtag gtgagtaggg cagataccaa ttttgggcca caaacataag aaataggact

19441 ttctttagtg cttataggtc aactgaattt ttacctccca gctcccatcc agccaagc ta

19501 gcaggaaact tccacctcag cctttctttg agttgctcag tggtttctag ctccatggtt

19561 ctggaacgag acaatgaagt gtggggtggg aggaggtcca tgtggcccct ggggggcctg

19621 agtctccatg gatcacagct tcttcatccc atcagatgta gggagatgct ctgtggcttc

19681 tgggccttac ttggatacag gaaacctcct ttaaagtggc ttagggtccc atgtgcctag

19741 aagcagtgca cagccatttc tttggggcct catcgtcatc ttgggaagag aggtacaggc

19801 cccctctgat tttaacacct gtaaaatcct atttttcctt tttgctctct tccaactaaa

19861 cgaagcatct ctttggcagt ttagagaaaa tccttctcca ttcaagtttc tagccaagat

19921 acttggccta agtccatgaa tctggcccta tctgcctttt tttttttaat ggccatgccc

19981 acagtgtatg ggtgtgacca ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa acacttctgg gccagggatt

20041 gaatctgagc cacagctccg gcaataccaa atcctttaac tcactgtgcc tgtctggaga

20101 ttgaacccac acctctgcag tgacccaagc tgctgcagcc agattcttat ctcactgcac

20161 tacagcagga actcccccta cctgcttctt aaaaaaaaaa aaaaatgttg ttgttgtgaa

20221 aggggagctg gaaaagacag gttttgactg gcaatactgc accccattct tcaacccctt

20281 acatacacac acaccctcct tatgaaacat gaacacagaa ttctgacttg aaagggacag

20341 aggtggggga gtccaggagg cagaaaaaga aaaaaaaaaa tcagaatgga gaaaggaggg

20401 attaaaatca atacattatt ttggatttcc caagatatcc cttcttggca gtaggaagtg

20461 ttgaagggct ccatttcagg gagctttcca gagccgtctc agtagaggag ttagagagac

20521 ccggagcttg gtaaagtttc cgaagggttt ccctccctgt gcccttgctc tggtggccat

20581 gtgctctttc agaaggttct atcttggagt tcccattgtg gctcagcaga aacgagtctg

20641 actagcattc aagaggacac agcttcgatc cctggccttg ttcaatgggg ttaaagatcc

20701 agcattgccc tgagctgtgg tgtaggtcgc agctgtagct ctgattggat ccctagcctg

20761 ggaacctcca tatgtcacag atgcagccct aaaaagacga aaaaaaaaaa agaaaagaaa

20821 agaaacaaac aaacaaacac aagaagaaga aggcggctct gtcttcttcg aagtcagcaa

20881 ggccagggag agcaggacac tacagcttgt gtgggataca gctctccaga aagaatagaa

20941 tatttattta tttcgcccct gccttattct agaaaggaatt cagtccagg agagaaggtg

21001 tgagagggaa gaggcttgag gtcccagggc aggggccagg cagagggctc cggggaaatg

21061 atggcccagg gaggccaccc agcttggagg atgatcggcc tttgggcagg gatgtggagg

21121 cccagggtct gatccaaaag gtgctcagtg atactgacag aagacaagga cctgagtcca

21181 tgggttctca gaccagagga gttggtacag ctacacccag aagcccttga tggttcggct

21241 tcctggcggc ccagtgatca gcaacccatt ccagatggcc ggctgcaagt gtgacgggaa

21301 cacctttggc cgctactgca accactccaa ggacccctgt gatgagccgt gcttcccgaa

21361 tgtgaagtgc atttccggga agggctgcga ggcctgcccg acaaccctga ctggggatgg

21421 acgtcactgt gcacgtgagc tggggacagg gccttggcag gaggaggttc tggggatggg

21481 gcctaaacag ccaggaaaaa ccatttctcc cccctttcca gcaagtcttt agaatgttcg

21541 ataaaggggg ctatggtaag gaggtaaaca ggggagggga gggtgtgagg ccaaaggagg

21601 agagatggtc caggcatggg ggaggggcca gagtacagca gtcccaaggc aacgatgggg

21661 gaaaccaggg caaaagactg gagacaggga gtttccgtcg tggcgcagtg gttaacgaat

21721 ccgactagga accatgaggt tgcgggttcg atccctgtcc ttgctcagtg ggttaaggat

21781 ccagcgttgc cgtgagctgt ggtgtaggtt gcagacgcgg ctcggatcct gcgttgctgt

21841 ggctctggcg taggccagtg gctgcagctc cgattcgacc cctagcctgg gaacctccat

21901 atgccgcgag agcagcccaa agaaatagca aaaagaccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

21961 aaagactgga gacaggaggg gacttccagc agcacccagg ggaccagagg taagctggct

22021 cctggaggtt tccagagatg caaggcccag ggcctctgca ttctccagtc aggacactgg

22081 cggcagggtg gggtgggggg gtctgccatg ggcatctagc agcaggaatg ccttgtcttc

22141 cctttgagtc ctccatccac catctgttcc ttgacctctg agccactgga gtcatgggtg

22201 gcatcatggt gacatcttca ctgagccccc taaaacactc aaatgaaatc tagaaaccac

22261 tgcatcttct gagcacagcc cagattggag aagcacagcc ttataaaggc caaaaagggg

22321 atggaagtga ggaaagcagg ctggtgggcc tttctcctcc cagccttttg ggtcctttcc

22381 tgatggggag ggtctaacaa cactccattc cctcagcaga agtgggagaa cccctacctg

22441 gcagaggaaa aagggttgtc tggcaaagaa atgtctggaa aagggagaaa gatggtttgg

22501 ggttcagagt ggcccacccg cagaacacag tttaagtgag ctttgcaggg aaaaagccaa

22561 ccctgtcctg ggagcagctt tctctggctg gcggctgcca gtgtggtgta gcagactgtc

22621 tgttccctct gcagctctca acagcttttt caactgttgg aacaagacct gtcctgagaa

22681 ttactgctac aaccagggtc gctgctacat ctcccagtct ctgacctgcg agcccgcctg

22741 cacctgcccc ccagccttca tggaagacac ccgctgcttc ctggctggaa aaaatttcac

22801 tccaaccatc cttccaggta cagccagatg ccctgccatc cccactccac acgtctctta

22861 acttggggga agatggggga ctctgggggc caggctcagt ccctcaaact cacaggacag

22921 aactccaaat ctctctcgtg tgctcgtaag ttgtaggctg tgggagtgag tggggggcag

22981 ctgtcacacc acaaaccaca ggtctgagca gtctgctgag aaaagactga aggggacctc

23041 acagctcagc gagacaagag tcaggccagc cttgatcaca gggtgaggtc agcagacctg

23101 gccatttctg attcttctgg tgaccttcta tgactgtaga agagggcagt cttcttgggc

23161 tgtcctcctt ggctaagtct gggtaaacct gtgaggtgac tatgaatctg cttcttccct

23221 ctccagagct tcccccaagg ctcatccagc tcttgctcag tgaaaaagaa aatgcctccc

23281 aagcagatgt caatgccacg gtcagtgctg caggctagctctgggtgggg aggcggttct

23341 tggcagattc ttatccatgg cttgtacatt ctgcatctca tcatccatct agactcaact

23401 gccagaggtg gctagagcct cctgccccag gggggtgggg gtgagggagg cagggaggcg

23461 caggacagag acctccaaag ggctgtgaat gaccatctca caatgaacag aatctggggg

23521 cagggagagg ggggcaagtc aacacagcct cgcctctcct tctgagcatc cctcgagacc

23581 tgctcttggg cactatatgg aagaaacaca agagggcatt tcacctccag gaagccttcc

23641 ctgaattccc caagagaact gggggctcct tcttcttggc tcccacaccc ctgttgattc

23701 tgcagtcaca ggcaaagtag cacaattgtt gagttactga ggctctagaa tcctacctgg

23761 gttcacatcc tggcagtacc actcactaga gcaggtatga tcattagaca aattatttga

23821 tctcccatat ataaaaacag aagtaataat agtactcatg tcaatgggtt gtgtcaaagt

23881 tgaaatgata atatatgtaa agcacttagc acagtgcctg aaacacaata cattcaaaaa

23941 ttaccaaaat aactattgtt tctgctgcta ctgctactac tactacaaca gcagcattct

24001 gggatctcta tggtaaaggc tgttgacatg gatctttgag tatgggcagc attctgggat

24061 ctctatggta aaggctgttg acatggatct ttgagtatgg gctgtttcta actcacactg

24121 acacacacac cccccccacc ccaacgcaca catctgacca tcccccaggt ctggctaaat

24181 ataattgatg ttcattcaga tatggggaga gggtgagtgg gtgagtcagg gatcagaggc

24241 aaggtagggg ctgttcattt catattctcg ctttgtgagt ggaactgggg tgaggttatg

24301 taaagtccta cactcaccaa caaacttcta ttaagtaggg acccatgcca gtcaccagtc

24361 gaggcttgtg gggcggggat gcagaaatag ataagaaaca ttctgagatt tcccatcatg

24421 gctcagtggt taacaagtcc gactaagaac catggggttg tgggtttgat ccctggcctt

24481 gctcagtggg ttaaggatcc ggcattgccg tgagctgtgg tgtaggttgc agacatggct

24541 cgggtcccac gttgctgtgg ctctagcgta ggccagtggc tacagctccc attcgacccc

24601 tagcctggga acctccatat gctgcgggag cagcccaaga aatggcaaaa agacgaacaa

24661 aaaaaaaatt ctggtggtcc tggggctcac attcaaagaa agaaactggg gtggaggggt

24721 gttcccattg tggctcagtg gtaacgaact gaactagtat ccataaggat gcgagtttga

24781 tccctggccc tcctcagtgg gttaaggatc tggcgttgcc gtgagctgta gtgtagactg

24841 acagctgcag ctccgattca acccctagcc tgggaacttt ctatatgcca tgggtgtggc

24901 cctaaaaaaa aagacaaaaa aaaaagaaga ataagaagga ggaggaggaa acacggatga

24961 atacatgcac aaaagtggga aaggtctcct ctctggactg gacctcaccc ccatttccac

25021 ccccacccca acccccaccc tctgccctag gtggcttata gactggggaa cctggatgtg

25081 cgggcctttc tccggaacag acaagtggaa cgagtgtaag tgggactgcc cccacctggg

25141 ccccggtcct tacctacacc cctcacccct cggcccctca ctgtgcccct ctcacacagt

25201 gaactcccag caataccggc ctcaggaaac ttccttcaat actggaaagt catctcggag

25261 ttccagtacc gccctggggg ccctgtcatt gacttcctga ataccaggct gctggacgca

25321 gtggtggagg cattcttatc ccaggcctca cagaggaggt ggaagagaag tgaggagccc

25381 aggaacaatg tggtcttcca acccatctcc aggagagatg tgctcagtgt gatggctggt

25441 gagtcactat ctcttggaca gcagcaagga tagctgaggg agcgggtaag cagagggagc

25501 ctgccacaga tctcaggccc acacaaaccc atggctgaag tgtattctac agcaggccac

25561 agacaagaag gaagtaaatt taggggggtt ttgtttgtca tttttaagag aaattgggaa

25621 ccttttaccc accagccttc tagattcagg aacaggagca caaagtactg cttgatgaat

25681 ccccacgtgt acagtttcac agagcaactg ctccaactgc tgctttcctg accattgctg

25741 ctaatggttt tctttctata aaattgttaa tgatttggtt aacatttatt ttataaatat

25801 aaacaaggac attgtttttg cctttgcctt cgcctccacc tggagatata aagttgaagg

25861 ctggagacct ggcccagggg cagaactatc acctccttga aagagcgtga ccctgtgcaa

25921 aagtccatcc ccagtcaagg cctcaacacg ctcatctgga aaaggaggtg ggatgtctga

25981 ggtccctttc agctctgaca gactctaatt atcccagaag gggaatgagg taggttggca

26041 aacttgccag cgaaggaaag gaatagccca ccctgtctta tgagtggggc agagaacagg

26101 acagtggcca tgccaaatgc cacagaaggt gctgtgttac ctgagcctag ggccaagcaa

26161 gagcttcttc tagaatccag gctaagctcc ctcccttcca ggggcaacaa tgagaaatcc

26221 tccaaactac tatggtatgt gtggtaggga ggcagtgttg gggataaggg aataaatact

26281 ccagacttga ctgtgccttt tcttagagaa aacaaatcaa caaaaccccc acaattttta

26341 ttatgcaagt acaatatgtt ttgtgtttag gacacagaag ttaacagaaa aaaaatcacc

26401 tgtattctaa tccccagaga caaatcccct ttgcacatac tctgctaaat tctcttttat

26461 gcataggaca cttcatatat caataaaggg atcaaatcat acctaatgtt tgataacctc

26521 tccattactt taactgtgaa catattacct tgtacattgt attcacattc tgatttgata

26581 tattatttta tgtcttaaat agtgtgtttt aatatatttt aaatagaatg tttttaaata

26641 tttttaaata ttttaaatag aatagtgact gttaaactga aggcttacta tgtcaggcac

26701 tgtgctaaat actgtgcata tattacctca tttaaacttt acagtaaggt agtttccttt

26761 taaaaataag gaaggaagtt cccgttgtgg ctcagcagta acaagcccaa ctagtatcca

26821 tgaggatgca ggttgaattc ctggcctcca tcagtgggttaaggatctgg tgttgccatg

26881 agctgtggtg taggtcgcag acacgtttgg atcctgtgtt gctgtggctg tggctgtagc

26941 atagactgcc agctatagct cctattcaac ccctagccag ggaacttcca tatgccacag

27001 gtgtgaccct aaaaagcaaa ataaataaat aaaataaaag gaaatataaa ataaaaaata

27061 taaggaaact tataaaataa cgtaaaatataaaataaaga aataaagaaa ctgaaggaat

27121 tctcttgtgg cacagcaggt gaaggatcca gtgtagtcac tgtagaggct taggttgctg

27181 ctgtggtgca ggttcaatcc ctggcctagg aacttccaca tgctataggc agaccaaaat

27241 ttaaacaaaa aaattttttt ttctttttgc catttgggcc gctccctcgg catatgtagg

27301 ttcccaggct aggggttgaa tcagagctgt aactgccggc ctacaccaga gccacagcaa

27361 tgcaggatcc gagccgtgtc tgcaatctac accacagctc acagcaatgc cgaatcctta

27421 acccactgag caaggccagg gatcgaaccc gaaaccccat cgttcccagt cggattcatt

27481 aaccactgag ccaccacagg aactccaata aagattttta ataaaaaaat aaggaaattg

27541 aggctgaaag agttaagaaa cttccccaaa ataacacaac tagttagtag tagagtttga

27601 atttcaactc aggtctagta gagttcaaag catatgctct taaccaatgc acttttcata

27661 ctgtggtcct catccattgc acaatattct ttatttaaca aaaccacttc tgggagctct

27721 cgttgtggct cagcgtgtta agaacctgac tagtatccaa aaggtttcgg ggtctatccc

27781 tggcctcgcc cagtgggttg gggatccagt attgcagcaa gctgtggtat aggttgcaga

27841 tgcagctcag atctggcatt gctgtggctg tggctgtggc tttggctggc agctgcagct

27901 ccaattcaac ccctagcctg ggaacttcca tatgccacta gtgtggccct aaaaaacaaa

27961 caaagccact tctgcttatt gttgctctta taaaccatgc tgctacagat ttccgtgaat

28021 atatgtagtt tttgtgtgtt tccaactatt tctcaggatg agtgcctaaa atggaattct

28081 tgacagaaaa ggtatagatt tggtgtaaat ccattggttt ccattttgct tgtgtcctat

28141 ctgacagtga atgtgagcac actgaaaaat tacttccaat gtaacggcta caaggactac

28201 aacctggttt tcagcccgga gagaggcttc acctgtgtgt ccccgtgcag caggggctac

28261 tgtgagaatg gaggccagtg ccagcaccta cccgaggggc cccaatgcag gtgagcaggg

28321 tgggggcagg aggtggaggg cagtgccaga gaatccaagctgcaaggagt ctggaaatgc

28381 catggtacct cacagcgcct gaaaatgtag ggtggttccc tctgtaatcg agagaaaggg

28441 gatcagagaa aaagggacag aggaaaagaa gatatgagtg cctacatttg tggagaataa

28501 agatgctata taacctttgc acctcaaacc agcaaatgga tagatagata tgaccatttt

28561 aaaacgcaac ttagaaatga taaggaatct gactacggta cccagtaatt taagttacag

28621 gatagtgggt tccaaagcca aactcttcca cctgattttg cttctcgggt catggacagc

28681 ctactatctc cttgtggaaa aggaacccac tgtcctgtat ctaggccttg tcctggccca

28741 ccttaagatt cccagaaagg ggaggccctc tcaaactggt gccctctgtc cccttggttc

28801 atcaactggt ctgaggggct ccggtgagtg gagggcacta agttctgggc atgctaagga

28861 gaagcgcagt gcctcctggc gctcttgtca catcggtgcc ctccgtctac catggccct

28921 actacagtcg cagatgggct cagccctctc acctcccagg tctaagaagg cagcgggtgg

28981 agcacagcgt tgggggctgg gtgcagcttt ctgggagcta ggtgtgctca cctgcggcca

29041 actccgcctc cacctccacc ccccatccat gccctgctgt aggggtggag ctgaccccaa

29101 gtgaattcac taccagccca cctaggttgc tcagtggcct cggtttagca ccgcttgctg

29161 cctgcctgcc tgcaggggga ctgaccccat cccttcccca gagagggacc cagcctgttg

29221 tagaaaaatc tcctctggct gggctgagag caggggtggg gaggctaagg gccagcctcc

29281 ccatccccac accccgctgc tgaccggtcc tctctctctc tgtctccagc tgtgtgccct

29341 tttcatccct acgccctggg agcagcgct；

(3)多态性位点的判型:

4个多态位点:g.13383C>T，g.15580A>G，g.21208A>G和g.26002A>C均采用PCR-RFLP(Restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性，RFLP)技术进行基因型检测，这4个多态位点扩增引物分别为SNP 13383 FP/RP；SNP 15580 FP/RP；SNP21208 FP/RP和SNP26002FP/RP(详见表1)；聚合酶链式反应(PCR)反应体系为25μL，其中包括40ng猪基因组DNA，1.0mM MgCl₂，100mM dNTP，正反向引物各10pmol，2单位DNA聚合酶(Taq酶)及1×PCR buffer(缓冲液)(上海博采公司)；扩增条件为:95℃ 3min；94℃ 30s，56-61℃ 30s，72℃ 45s，共35个循环；最后在72℃延伸10min。

PCR-RFLP中涉及的限制性内切酶详细情况见表1，限制性内切酶均购自NEB公司(英国)。酶切反应体系为10μl，其中包含5μl PCR产物，限制内切酶0.1μl(20U/μl)，10×缓冲液1μl。酶切反应温度均为37℃，酶切反应时间为4h。酶切反应后向每管产物中加入2μL内切酶试剂盒附带的10×loading buffer(上样缓冲液)，混匀，经2.5％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色后，于凝胶成像系统中观测。

具体判型方法如附图2所示。

通过公用的2LD软件计算4个多态位点之间的标准连锁不平衡程度(D’值)，这些位点之间的D’值处于0.94-1.00之间，由此表明这4个位点紧密连锁，处于同一连锁相。然后采用公用HAPLORE软件构建单倍型。

本发明的第二个目的是这样实现的:本发明利用这4个多态位点及侧翼DNA序列信息，采用分子生物技术鉴别个体基因型，然后构建单倍型，针对抗腹泻病性状选育种猪。

本发明鉴别了一个影响断奶仔猪抗腹泻病性状的MUC4分子标记-单倍型(haplotype)，通过现代分子生物学技术检测该单倍型，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的单倍型对个体留种，可以显著提高种群断奶仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。

附图说明

图1为4个多态位点的PCR-RFLP判型图，其中(a)g.13383C>T位点:泳道13为50bp分子标记；泳道1、5、6和8为CT型；泳道2、3、4、9、10、11和12为CC型；泳道7为TT型；(b)g.15580A>G位点:泳道13为50bp分子标记；泳道2和3为AA型；泳道1、4和9为AG型；泳道5、6、7、8、10、11和12为GG型。(c)g.21208A>G位点:泳道13为50bp分子标记；泳道5为AA型；泳道3、6和7为GG型；泳道1、2、4、5、8、9、10和11为AG型；(d)g.26002A>C位点:泳道13为50bp分子标记；泳道1、2、5和6为AA型；泳道7、8和12为CC型；泳道3、4、9、10和11为AC型。

图2为ETEC F4ac与刷状缘的黏附检测结果，(a)为不黏附型，(b)为黏附型。