β2微球蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用

具体实施方式

本发明的融合蛋白β2M-ZsGreen，其氨基酸序列包括与SEQ ID No.1所示序列具有至少85％相同性的第一区和与SEQ ID No.2所示序列具有至少85％相同性的第二区；其中：SEQ ID No.1所示序列是由102个氨基酸组成的β2M的氨基酸序列，SEQ ID No.2所示序列是由242个氨基酸组成的ZsGreen的氨基酸序列；在本领域中，至少有85％序列相同性的蛋白，通常不会改变天然蛋白的生物学活性；因此，本发明的融合蛋白β2M-ZsGreen，包括由β2M或其衍生蛋白组成的第一区和由ZsGreen或其衍生蛋白组成的第二区；这些衍生蛋白包括但不限于：(1)有一个或几个氨基酸残基被取代、缺失或/和插入的蛋白，取代或插入的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；(2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白；(3)附加的氨基酸序列(如前导序列、分泌序列、用于纯化该蛋白的序列等)融合到天然蛋白序列而形成的蛋白。

在本发明的融合蛋白β2M-ZsGreen中，可以是第一区和第二区直接连接，也可以是第一区和第二区通过连接肽连接。连接肽在物理上将第一区和第二区分隔开来，有利于β2M和ZsGreen折叠成相互独立的结构域，消除二者之间可能存在的相互干扰，使各自更好地发挥生理作用；还有利于β2M最大可能地与抗原肽和MHC-I类分子结合，不受空间位阻的影响等。通常，连接肽不影响或较少影响β2M的氨基酸序列和ZsGreen的氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。优选的连接肽包括但不限于由SEQ ID No.3所示氨基酸序列组成的短肽。

本发明涉及编码所述融合蛋白β2M-ZsGreen的基因，包括但不限于由SEQID No.4所示核苷酸序列组成的多核苷酸。核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的基因由1101个核苷酸组成，编码由第一区(如SEQ ID No.1所示)的羧基端与第二区(如SEQ ID No.2所示)的氨基端通过连接肽(如SEQ ID No.3所示)连接且蛋白羧基端具有组氨酸标签(His6)的融合蛋白β2M-ZsGreen，其中：第1位至第306位核苷酸为β2M的编码序列，第307位至第354位核苷酸为连接肽的编码序列，第355位至第1080位核苷酸为ZsGreen的编码序列，第1081位至第1098位核苷酸为His6的编码序列，第1099位至第1101位核苷酸编码丝氨酸(其密码子agc可与终止密码子tag以及碱基c构成Nhe I酶切位点gctagc，便于酶切、连接及鉴定)。编码本发明的融合蛋白β2M-ZsGreen的基因，可以全部人工合成，也可用PCR方法或RT-PCR方法分别获得β2M或ZsGreen的编码序列，再将其拼接在一起。

本发明涉及含有所述基因的重组表达载体。在制备重组蛋白时，表达产物可以存在于宿主细胞内，也可以从宿主细胞中分泌出来，优选的表达方式是从宿主细胞中分泌出来，以简化表达产物的纯化过程。信号肽可使细胞有效地将外源蛋白分泌至细胞外，在蛋白翻译时，将信号肽加在融合蛋白的氨基端，即可达到使融合蛋白分泌至胞外的目的。常用的信号肽包括果胶酶(pel B)信号肽等。此外，在制备重组蛋白时，还通常在重组蛋白的羧基端引入标签蛋白，如精氨酸标签、C-MYC标签和组氨酸标签等，这些标签有助于表达产物的纯化和检测。因此，在构建重组表达载体时，优选带有信号肽或/和标签蛋白的编码序列的表达载体。

本发明涉及含有所述重组表达载体的转化体。用于构建所述转化体的宿主没有特别限制，可以是细菌、酵母、动物或植物细胞等。本领域技术人员可按照常规方法选择表达载体和相应的宿主。

在成功构建转化体后，可在适合条件下大量培养该转化体以大量制备所述重组表达载体；或在适合表达本发明融合蛋白β2M-ZsGreen的条件下培养该转化体，诱导其表达融合蛋白。可利用融合蛋白的物理、化学或其它特性通过各种方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于：复性处理、用蛋白沉淀剂处理、离心、渗透破菌、超声处理、分子筛层析、离子交换层析、高效液相层析、亲和层析等方法及这些方法的结合。

本发明的融合蛋白β2M-ZsGreen可用于制备抗原肽与MHC-I类分子的亲和力检测试剂，应用于CTL表位的鉴定。检测方法原理如下：采用HLA-A2.1分子(人类的MHC-I类分子)表达阳性但抗原处理相关转运因子(Transportersassociated with antigen processing，TAP)缺陷的T2细胞，未与内源性抗原肽结合的空载HLA-A2.1分子在T2细胞膜上的表达极不稳定，很快降解；而当HLA-A2.1分子与外源性抗原肽结合形成多肽-MHC复合物(peptide-MHCcomplex，pMHC)后可以在T2细胞膜上稳定表达，表达量与外源性抗原肽和HLA-A2.1分子的亲和力呈正相关；β2M可促进HLA-A2.1分子重链与外源性抗原肽的结合，是pMHC保持稳定性的重要因素；在检测过程中加入本发明的融合蛋白β2M-ZsGreen，阳性抗原肽可与融合蛋白中的β2M和HLA-A2.1分子结合，在T2细胞膜上形成稳定的ZsGreen标记的pMHC，而阴性抗原肽不能与融合蛋白中的β2M和HLA-A2.1分子结合，不能在T2细胞膜上形成稳定的ZsGreen标记的pMHC；因此，用FACS检测ZsGreen标记的T2细胞的比例，即可鉴定抗原肽是否为CTL表位。

下面将参照附图对本发明的优选实施例作详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、重组表达载体的制备

1、β2M基因的扩增与纯化

根据β2M的基因序列(GenBank登录号为BC032589)，设计1对引物，在每条引物的5′端加上保护碱基，再在其后分别引入BamHI或Acc65I限制性内切酶识别序列；设计的引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成；引物序列如下：上游引物：5′-tcaggatccatgatccagcgtactccaaagat-3′(SEQ ID No.5)，下划线部分为BamH I酶切位点；下游引物：5′-cgcggtacccatgtctcgatcccacttaa-3′(SEQ ID No.6)，下划线部分为Acc65I酶切位点；

以β2M cDNA(武汉三鹰生物技术有限公司)为模板，采用上述上下游引物，进行β2M基因的PCR扩增，反应体系为：模板1μL、浓度为10μmol/L的上、下游引物各1μL、2×Premix ExTaq(TaKaRa公司)25μL、双蒸水补充至总体积为50μL；反应条件为：温度95℃预变性2分钟，然后温度94℃变性50秒、56℃退火1分钟、72℃延伸30秒，共35个循环，最后温度72℃延伸10分钟；

PCR产物用质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图1所示，其中1泳道为DNA分子量标准，2泳道为PCR产物，从图可知，PCR产物在约324bp的位置出现一条特异性DNA条带，与目的片段预期大小相符；

按照上述方法重复进行5次PCR扩增，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选择约324bp的目的片段切胶，采用胶回收试剂盒(Omega公司)回收纯化目的片段(按照试剂盒说明书操作)，即得纯化的β2M基因；

2、重组表达载体Puc18β2MDsRedGGGS的构建和鉴定

将步骤1所得纯化的β2M基因用BamH I和Acc65 I(NEB公司)进行双酶切，双酶切方法为：浓度为20ng/μL的β2M基因30μL、浓度为15U/μL的BamHI3μL、浓度为15U/μL的Acc65 I 3μL、10×缓冲液5μL、双蒸水补充至总体积为50μL，于温度37℃孵育20小时，双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，选择约324bp片段进行切胶回收，获得纯化的β2M基因片段I；将真核表达载体Puc18sKbDsRedGGGS按照上述同样方法用BamH I和BsrG I进行双酶切，双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，选择约3425bp片段进行切胶回收，获得纯化的Puc18DsRedGGGS片段；将上述纯化的β2M基因片段I与Puc18DsRedGGGS片段进行连接，连接方法为：浓度为30ng/μL的β2M基因片段I5μL、浓度为50ng/μL的Puc18DsRedGGGS片段1μL、浓度为5U/μL的T4 DNA连接酶(NEB公司)1μL、10×T4DNA连接酶反应缓冲液2μL、双蒸水补充至总体积为20μL，于温度16℃孵育16小时；

将连接产物转化入大肠杆菌DH-5α感受态细胞，转化方法为：将连接产物10μL加至DH-5α感受态细胞100μL中，冰浴30分钟，温度42℃热休克90秒，立即冰浴2分钟，再转移至预热至温度37℃的LB液体培养基350μL中，在温度37℃、振摇速度225转/分钟的条件下振摇培养1小时；

取转化产物涂布于含有氨苄青霉素(AMP)的LB平板上，于温度37℃孵育18小时，从平板上挑取单个菌落，接种于含有AMP的LB液体培养基4mL中，在温度37℃、振摇速度225转/分钟的条件下振摇培养16小时，用质粒抽提试剂盒(OMEGA公司)小量抽提重组质粒(按照试剂盒说明书操作)；

将所得重组质粒用BamH I和BsrG I进行双酶切鉴定，鉴定为阳性的重组质粒委托invitrogen公司对插入片段进行测序，结果重组质粒中插入片段的核苷酸序列和开放阅读框架与GenBank登录的β2M基因序列完全一致，无碱基错配、移位、缺失等发生，表明重组表达载体Puc18β2MDsRedGGGS构建成功；

3、重组表达载体FUβ2MZsGreenGGGS的构建和鉴定

将步骤2所得重组表达载体Puc18β2MDsRedGGGS用BamH I和Age I(NEB公司)进行双酶切，双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，选择约359bp片段进行切胶回收，获得纯化的β2M基因片段II；将包含ZsGreen编码基因的真核表达载体FUsKbZsGreenGGGS同样用BamH I和Age I进行双酶切，双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，选择约9922bp片段进行切胶回收，获得纯化的FUZsGreenGGGS片段；将上述纯化的β2M基因片段II与FUZsGreenGGGS片段进行连接，连接产物转化入大肠杆菌DH-5α感受态细胞，转化产物用含有AMP的LB平板进行阳性克隆的筛选，所得阳性克隆用含有AMP的LB液体培养基在温度37℃条件下振摇培养16小时，用质粒抽提试剂盒小量抽提重组质粒；

将所得重组质粒用EcoR I进行酶切鉴定，取双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，其中1泳道为DNA分子量标准，2泳道为双酶切产物，从图可知，双酶切产物在约898bp的位置出现一条特异性DNA条带，与融合蛋白β2M-ZsGreen编码基因的预期大小一致；将双酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序，结果重组质粒中插入片段的核苷酸序列和开放阅读框架与融合蛋白β2M-ZsGreen编码基因的预期序列(如SEQ ID No.4所示)完全一致，表明重组表达载体FUβ2MZsGreenGGGS构建成功；

4、重组表达载体FUβ2MZsGreenGGGS的大量制备

取步骤3所得含有FUβ2MZsGreenGGGS的大肠杆菌DH-5α，接种于含有AMP的LB液体培养基中，在温度37℃、振摇速度225转/分钟的条件下振摇培养至490nm波长处的OD值达到1～1.5，采用质粒抽提试剂盒大量抽提重组质粒(按照试剂盒说明书操作)，所得重组质粒用双蒸水溶解，紫外分光光度法测定纯度和浓度，置温度-20℃保存，备用。

二、融合蛋白的制备

1、融合蛋白β2M-ZsGreen的表达

取浓度为1mol/L、pH值为7.3的HEPES缓冲液1095μL，加入浓度为625ng/μL的FUβ2MZsGreenGGGS溶液32μL和浓度为2mol/L的CaCl₂溶液155μL，再缓慢加入2×HeBS缓冲液(由浓度为0.05mol/L的HEPES缓冲液、浓度为0.28mol/L的NaCl和浓度为1.5mmol/L的Na₂HPO₄组成，调节溶液pH至7.0)1250μL，剧烈震荡2分钟，制得重组质粒转染液；在10cm×10cm细胞培养平皿中，接种4×10⁶个293FT细胞，用含有浓度为100mL/L的小牛血清(成都哈里公司)的DMEM高糖培养液(invitrogen公司)，在温度37℃、CO₂气体浓度为50mL/m³的条件下培养过夜，待细胞密度达到60～70％时，加入重组质粒转染液，转染10小时(转染时间在7～12小时之间，均可达到本发明目的)后更换培养液，继续培养48小时(培养时间在36～60小时之间，均可达到本发明目的)后弃上清，收集细胞(在荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光，如图3所示，表明转染FUβ2MZsGreenGGGS的293FT细胞成功表达了融合蛋白β2M-ZsGreen)，用NPI-10缓冲液(由浓度为50mmol/L的NaH₂PO₄、浓度为300mmol/L的NaCl和浓度为10mmol/L的咪唑组成，调节溶液pH至8.0)与蛋白酶抑制剂cocktail(Roche公司)按体积比为9∶1混合制得的溶液进行重悬，超声裂解细胞，离心，收集上清液(即细胞裂解上清)；同时设正常293FT细胞对照组(未加入重组质粒转染液)；

2、融合蛋白β2M-ZsGreen的纯化

利用重组原核表达载体FUβ2MZsGreenGGGS使融合蛋白β2M-ZsGreen的羧基端带有组氨酸标签(His6)，而组氨酸可与多种过渡金属离子如Cu²⁺，Zn²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Fe³⁺等发生特殊的相互作用的性质，采用Ni-NTA Superflow(QIAGEN公司)亲和层析柱纯化融合蛋白(按照说明书操作)：层析柱用10倍柱体积的NPI-10缓冲液清洗后，加入步骤1收集的上清液，先用10倍柱体积的NPI-20缓冲液(由浓度为50mmol/L的NaH₂PO₄、浓度为300mmol/L的NaCl和浓度为20mmol/L的咪唑组成，调节溶液pH至8.0)清洗去除杂蛋白，再用NPI-250缓冲液(由浓度为50mmol/L的NaH₂PO₄、浓度为300mmol/L的NaCl和浓度为250mmol/L的咪唑组成，调节溶液pH至8.0)洗脱获得融合蛋白，收集洗脱液，用浓度为0.01mol/L的PBS(由浓度为135mmol/L的NaCl、浓度为2.7mmol/L的KCl、浓度为1.5mmol/L的KH₂PO₄和浓度为8mmol/L的K₂HPO₄组成，调节溶液pH至7.2)在温度4℃条件下透析脱盐，透析2小时后更换PBS再透析过夜，最后用聚乙二醇-8000在温度4℃条件下浓缩20分钟，浓缩后的融合蛋白溶液用BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术研究所)测定浓度(按照试剂盒说明书操作)，置温度4℃保存，备用；

取纯化的融合蛋白β2M-ZsGreen进行SDS-PAGE鉴定，结果见图4，其中1泳道为蛋白质分子量标准，2泳道为正常293FT细胞裂解上清，3泳道为转染FUβ2MZsGreenGGGS的293FT细胞裂解上清，4泳道为纯化的融合蛋白β2M-ZsGreen，从图可知，纯化的融合蛋白β2M-ZsGreen在分子量约80kD的位置出现一条特异性蛋白条带，与β2M-ZsGreen二聚体的分子量相符，因ZsGreen为四聚体，故认为融合蛋白β2M-ZsGreen可能在SDS-PAGE过程中由四聚体变性为二聚体。

三、融合蛋白的应用

1、在不同浓度的融合蛋白β2M-ZsGreen存在下检测HBVc18-27肽与MHC-I类分子的亲和力

方法：T2细胞用含有浓度为100mL/L的胎牛血清的RPMI1640培养液重悬至细胞密度为3×10⁵/mL，接种于2块6孔板的8孔中，每孔1mL，再在(1)～(8)号孔中分别加入：(1)终浓度为50μmol/mL的二甲基亚砜(DMSO)，(2)终浓度为50μmol/mL的DMSO和终浓度为6.25μmol/mL的融合蛋白β2M-ZsGreen(因融合蛋白β2M-ZsGreen为四聚体，故换算成β2M的浓度为25μmol/mL)，(3)终浓度为50μmol/mL的SMCY肽(已知阴性抗原肽)和终浓度为2.5μmol/mL的融合蛋白β2M-ZsGreen，(4)终浓度为50μmol/mL的SMCY肽和终浓度为6.25

μmol/mL的融合蛋白β2M-ZsGreen，(5)终浓度为50μmol/mL的HBVc18-27肽(已知阳性抗原肽)和终浓度为0.25μmol/mL的融合蛋白β2M-ZsGreen，(6)终浓度为50μmol/mL的HBVc18-27肽和终浓度为2.5μmol/mL的融合蛋白β2M-ZsGreen，(7)终浓度为50μmol/mL的HBVc18-27肽和终浓度为6.25μmol/mL的融合蛋白β2M-ZsGreen，(8)终浓度为50μmol/mL的HBVc18-27肽和终浓度为12.5μmol/mL的融合蛋白β2M-ZsGreen(上述加入的SMCY肽溶液和HBVc18-27肽溶液均由DMSO溶解制得，DMSO的终浓度为50μmol/mL)；在温度37℃、CO₂气体浓度为50mL/m³的条件下培养17小时(培养时间在15～24小时之间，均可达到本发明目的)，收集T2细胞培养液，1200r/min离心5分钟，细胞沉淀用PBSA(即含有浓度为2mg/mL的牛血清白蛋白的PBS)洗涤两次后，用浓度为10mg/mL的多聚甲醛(PFA)溶液150μL重悬，用FACS检测ZsGreen标记的T2细胞的比例；

结果：见图4，其中A～H分别为(1)～(8)号样品检测结果，从图4E～H[(5)～(8)号样品]可知，随着融合蛋白β2M-ZsGreen浓度的提高，HBVc18-27肽与β2M和MHC-I类分子形成的ZsGreen标记的pMHC逐渐增加，ZsGreen标记的T2细胞的比例逐渐升高；对比图4B[(2)号样品]与图4D[(4)号样品]可知，在相同浓度的融合蛋白β2M-ZsGreen存在下，阴性抗原肽SMCY的ZsGreen标记的T2细胞的比例与阴性对照相同，而对比图4C[(3)号样品]与图4F[(6)号样品]、图4D[(4)号样品]与图4G[(7)号样品]可知，在相同浓度的融合蛋白β2M-ZsGreen存在下，阳性抗原肽HBVc18-27的ZsGreen标记的T2细胞的比例显著高于阴性抗原肽SMCY。

2、在相同浓度的融合蛋白β2M-ZsGreen存在下检测不同抗原肽与MHC-I类分子的亲和力

方法：T2细胞用含有浓度为100mL/L的胎牛血清的RPMI1640培养液重悬至细胞密度为1×10⁵/mL，接种于U型底96孔板的5孔中，每孔100μL，再在(1)～(5)号孔中分别加入：(1)终浓度为100μmol/mL的DMSO，(2)终浓度为100

μmol/mL的DMSO和终浓度为5μmol/mL的融合蛋白β2M-ZsGreen，(3)终浓度为100μmol/mL的P3肽(已知阳性抗原肽)和终浓度为5μmol/mL的融合蛋白β2M-ZsGreen，(4)终浓度为100μmol/mL的P12肽(已知阳性抗原肽)和终浓度为5μmol/mL的融合蛋白β2M-ZsGreen，(5)终浓度为100μmol/mL的HBVc18-27肽和终浓度为5μmol/mL的融合蛋白β2M-ZsGreen(上述加入的P3、P12和HBVc18-27肽溶液均由DMSO溶解制得，DMSO的终浓度为50μmol/mL)；在温度37℃、CO₂气体浓度为50mL/m³的条件下培养17小时(培养时间在15～24小时之间，均可达到本发明目的)，收集T2细胞培养液，1200r/min离心5分钟，细胞沉淀用PBSA洗涤两次后，用浓度为10mg/mL的PFA溶液150μL重悬，用FACS检测ZsGreen标记的T2细胞的比例；

结果：见图5，其中A～E分别为(1)～(5)号样品检测结果，从图5C～E[(3)～(5)号样品]可知，在相同浓度的融合蛋白β2M-ZsGreen存在下，阳性抗原肽P3、P12和HBVc18-27的ZsGreen标记的T2细胞的比例分别为72.7％、59.0％和57.3％，均显著高于阴性对照[图5B，(2)号样品，46.0％]。

3、对比实验：采用间接免疫荧光法(常规方法)检测不同抗原肽与MHC-I类分子的亲和力

方法：T2细胞用含有浓度为100mL/L的胎牛血清的RPMI1640培养液重悬至细胞密度为1×10⁵/mL，接种于U型底96孔板的6孔中，每孔100μL，再在(1)～(6)号孔中分别加入：(1)终浓度为100μmol/mL的DMSO，(2)终浓度为100μmol/mL的DMSO，(3)终浓度为100μmol/mL的P2肽(已知阴性抗原肽)，(4)终浓度为100μmol/mL的P3肽，(5)终浓度为100μmol/mL的P12肽，(6)终浓度为100μmol/mL的HBVc18-27肽(上述加入的P2、P3、P12和HBVc18-27肽溶液均由DMSO溶解制得，DMSO的终浓度为100μmol/mL)；在温度37℃、CO₂气体浓度为50mL/m³的条件下培养17小时，收集T2细胞培养液，1200r/min离心5分钟，细胞沉淀用PBSA洗涤两次后，(1)号样品用1∶50(体积比)PBSA稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)溶液100μL重悬，在温度4℃条件下避光反应30分钟，再用PBSA洗涤两次后，用浓度为10mg/mL的PFA溶液150μL重悬，用FACS检测荧光强度；(2)～(6)号样品用饱和浓度的BB7.2单克隆抗体100μL重悬，在温度4℃条件下避光反应30分钟，用PBSA洗涤两次后，加入1∶50(体积比)PBSA稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗溶液100μL重悬，在温度4℃条件下避光反应30分钟，再用PBSA洗涤两次后，用浓度为10mg/mL的PFA溶液150μL重悬，用FACS检测荧光强度；

结果：见图6，其中A～F分别为(1)～(6)号样品检测结果，从图6D～F[(4)～(6)号样品]可知，阳性抗原肽P3、P12和HBVc18-27的荧光强度分别为10141、5692、4476，均显著高于阴性对照[图6B，(2)号样品，3347]，而阴性抗原肽P2的荧光强度为3253，与阴性对照无显著差异。

对比图5和图6可知，采用本发明的融合蛋白β2M-ZsGreen检测不同抗原肽与MHC-I类分子的亲和力，所得结果与采用间接免疫荧光法检测所得结果一致，表明本发明的融合蛋白β2M-ZsGreen可用于抗原肽与MHC-I类分子的亲和力检测，应用于CTL表位的鉴定。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>β2微球蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用

<160>6

<210>1

<211>102

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

<210>2

<211>242

<212>PRT

<213>珊瑚虫类(Anthozoa)

<400>2

<210>3

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：连接肽

<400>3

<210>4

<211>1101

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1101)

<220>

<223>人工序列的描述：β2微球蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白的编码基因

<400>4

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：β2微球蛋白基因的PCR上游引物

<400>5

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：β2微球蛋白基因的PCR下游引物

<400>6