机械操作或灭菌后具有高度生物学活性的固定的生物活性实体

发明领域

本发明涉及固定有生物活性实体的基材，该生物活性实体在接触高温、 高湿度、抗菌素制剂和/或机械应力的条件后仍能保持其生物学活性。本发 明特别适用于医疗器件领域。

发明背景

在医疗器件领域，玻璃、聚合物和/或金属材料是常见的基材。这些材 料可用于诊断器件或体外器件。除玻璃外，许多材料均可用于植入式器件。

使生物活性实体以生物活性形式固定在基材上包括对这些实体和基材 的化学特性的了解。常常需要改变基材的化学组成以使生物活性实体固定 在基材上。通常可通过处理基材表面以产生一群化学活性元素或基团，然 后用合适的方法固定这些生物活性实体。对于其它基材，用其中掺有反应 性化学基团的材料覆盖或涂布基材表面。然后通过被覆材料的反应性化学 基团将生物活性实体固定在基材上。已经记载过各种被覆或涂布基材的方 案。通过被覆或涂布材料固定在基材上的生物活性实体的代表性例子参见 美国专利4,810,784；5,213,898；5,897,955；5,914,182；5,916,585；和 6,461,665。

固定生物活性化合物、组合物或实体时，固定过程可能对这些“生物制 剂”的生物活性造成负面影响。许多生物制剂的生物学活性取决于该生物制 剂在固定状态的构象(即伯、仲、叔等)。除了仔细选择固定过程外，可能还 需要对生物制剂进行化学改变才能将生物制剂以使其生物学活性足够高以 便实现所需功能的构象掺入被覆材料中。

尽管是优化的被覆和固定方案，但其它处理如灭菌可能降低固定的生 物制剂的生物学活性。在可植入医疗器件中，需要在临用前进行灭菌。也 可能需要对污染物敏感的体外诊断器件进行灭菌。这类器件的灭菌通常需 要使器件接触升高的温度、压力和湿度，通常是若干循环。在一些情况下， 灭菌过程中包括抗菌素制剂，如环氧乙烷气体(EtO)或过氧化氢蒸汽。除灭 菌外，机械压缩和膨胀，或长期储存固定的生物制剂会降低该生物制剂的 活性。

需要其上固定有生物活性实体的医疗器件，可以在不显著降低其生物 学活性的前提下对该生物活性实体进行灭菌、机械压缩和膨胀和/或储存。 这类医疗器件包括生物相容性组合物或化合物与固定的生物实体，以便最 大程度减少灭菌、机械压缩和膨胀和/或储存期间该实体生物学活性的降低。 在一些情况下，额外的生物相容性组合物或化合物可提高一些生物活性实 体在灭菌后的生物学活性。

发明概述

本发明涉及基材上固定有生物活性实体与附加生物相容性有机化学组 合物的医疗器件，这些有机化学组合物使得生物活性实体在接触本来能降 低该实体生物学活性的加工和储存条件后保持重要的生物学活性。

合适的基材可以是表面含有反应性化学基团的任何材料，这些化学基 团能够将生物活性形式的生物活性实体连接、限定或固定在所述基材的一 个或多个表面上。基材也可具有通过将一种或多种被覆组合物或材料施加 于表面而加到材料表面上的多种反应性化学基团。至少一部分被覆材料含 有能与生物活性实体发生反应，并用于将生物活性形式的生物活性实体连 接、限定或固定于被覆材料的化学元素、基团、化合物或组分。在一些实 施方式中，可以可逆地固定生物活性实体。

至少一种类型的生物活性实体被化学连接、限定或固定于基材和/或被 覆材料上合适的反应性化学基团。将多个生物活性实体固定于基材和/或被 覆材料上存在的多个反应性化学基团的至少一部分后，附加生物相容性有 机组合物与生物活性实体、基材和/或聚合物被覆材料共价或非共价结合。 生物相容性有机组合物能与生物活性实体和基材和/或被覆材料的反应性化 学基团相互作用，以防止生物活性实体在显著降低其生物学活性的条件下 丧失其生物学活性。这些条件包括灭菌和储存。例如，对于膨胀型腔内医 疗器件时，这类器件的机械压缩和膨胀也可显著降低该实体的生物学活性。

在一些情况下，所述附加生物相容性有机组合物似乎能在灭菌、储存 和/或机械操作期间通过限制对该实体的不良改变而维持该实体的生物学活 性，而灭菌、储存和/或机械操作过程通常会诱导这种不良改变。活性降低 性改变可包括掩蔽生物活性实体的活性位点的构象改变。活性降低性改变 也可包括相邻生物活性实体之间的相互作用。生物活性实体相对于聚合物 被覆材料的重排也是导致该实体发生活性降低性改变的另一种可能方式。 生物活性实体的简单变性或其它降解也可以是使该实体丧失其生物学活性 的另一种方式。如本文进一步详述，在附加生物相容性有机组合物存在下 进行灭菌、储存和/或机械操作的固定的生物活性实体保持的生物学活性水 平明显高于在相同条件下但不存在附加生物相容性有机组合物时进行加工 的固定的相似生物活性实体的活性水平。

可在灭菌后处理期间去除灭菌医疗器件中的附加生物相容性有机组合 物，或将灭菌医疗器件应用于植入位点后通过植入物接受者的生理过程去 除该组合物。

优选的生物活性实体能降低或抑制在基材和/或被覆材料表面上形成 血栓。糖胺聚糖是本发明所用的优选抗血栓药，特别优选肝素、肝素类似 物和衍生物。其它优选的生物活性物质能降低植入本发明的组织的不良细 胞生长。本发明所用的优选抗增殖剂包括但不限于地塞米松、雷帕霉素和 紫杉醇。

因此，本发明一个实施方式涉及一种医疗器件，其包含基材，粘附于 所述基材表面的至少一部分的聚合物被覆材料，共价连接于所述聚合物被 覆材料的至少一部分的具有抗-凝血酶III结合活性的多个生物活性实体， 以及与所述聚合物被覆材料结合的生物相容性组合物，其中对所述基材进 行灭菌或者将其压缩和膨胀后，所述生物活性实体的抗-凝血酶III结合活 性为至少5皮摩尔抗-凝血酶III/平方厘米基材(pmol/cm²)。在其它实施方式 中，该抗-凝血酶III结合活性为至少6皮摩尔抗-凝血酶III/平方厘米基材 (pmol/cm²)，至少7皮摩尔抗-凝血酶III/平方厘米基材(pmol/cm²)，至少8 皮摩尔抗-凝血酶III/平方厘米基材(pmol/cm²)，至少9皮摩尔抗-凝血酶III/ 平方厘米基材(pmol/cm²)，或者至少10皮摩尔抗-凝血酶III/平方厘米基材 (pmol/cm²)。在一些实施方式中，所述抗-凝血酶III结合活性为至少100皮 摩尔抗-凝血酶III/平方厘米基材(pmol/cm²)。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种医疗器件，其包含基材、粘附 于所述基材表面的至少一部分的聚合物被覆材料，端点连接于所述聚合物 被覆材料的至少一部分的具有抗-凝血酶III结合活性的第一组多个肝素分 子，与所述聚合物被覆材料结合的生物相容性组合物，其中将所述基材压 缩和膨胀后，所述第一组多个肝素分子的抗-凝血酶III结合活性至少为10 皮摩尔抗-凝血酶III/平方厘米基材(pmol/cm²)。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种灭菌医疗器件，其包含聚合物 基材，粘附于所述基材表面的至少一部分的聚合物被覆材料，端点连接于 所述聚合物被覆材料的至少一部分的具有抗-凝血酶III结合活性的多个肝 素分子，以及含有与所述聚合物被覆材料结合的多个聚乙二醇分子的组合 物，其中将所述基材压缩和膨胀后，所述第一组多个肝素分子的抗-凝血酶 III结合活性至少为50皮摩尔抗-凝血酶III/平方厘米基材(pmol/cm²)。

在另一实施方式中，本发明涉及一种医疗器件，其包含基材、存在于 所述基材的至少一部分上具有抗凝血酶III结合活性的多个化学实体、与所 述基材结合的第一生物相容性组合物和与其混合的第二生物相容性组合 物。

本发明另一实施方式涉及一种医疗器件，其包含基材，粘附于所述基 材表面的至少一部分的聚合物被覆材料，存在于所述聚合物被覆材料上具 有抗-凝血酶III结合活性的多个化学实体，与所述基材结合的第一生物相 容性组合物，和与其混合的第二生物相容性组合物。

在涉及非共价结合的生物相容性有机组合物的实施方式中，将医疗器 件放入温度约为37摄氏度且pH为基本中性的0.15M磷酸盐缓冲液中时， 灭菌或机械操作导致医疗器件常常在数小时内释放至少一部分有机组合物 或者第二组多个肝素分子。可以用常规测定技术检测缓冲液中释放的化合 物。

在涉及共价结合的生物相容性有机组合物的实施方式中，进行灭菌或 机械操作后该有机组合物或第二组多个肝素分子基本保留在经过灭菌或机 械操作处理的医疗器件上。

在其它实施方式中，可由聚合物被覆材料通过共价键反转释放共价结 合的生物相容性有机组合物。可以利用常规测定技术检测缓冲液中通过共 价键反转释放的化合物。

在一些实施方式中，可以在机械操作和/或灭菌之前混合生物相容性有 机组合物。在其它实施方式中，可以在机械操作或灭菌(即在手术室)之后混 合生物相容性有机组合物。这在采用该有机组合物的基材或器件可能被机 械操作或灭菌降解时特别有用。这也使得该有机组合物能够以不同剂量设 置在基材或器件的特定位置上。

附图简要说明

图1是上面有多个反应性化学基团的聚合物基材的示意图。

图1A是金属基材的示意图。

图2是固定有多个生物活性实体的聚合物基材的示意图。

图3是具有聚合物被覆材料的聚合物基材的示意图，所述聚合物被覆 材料上具有多个反应性化学基团。

图3A是具有聚合物被覆材料的金属基材的示意图，所述聚合物被覆材 料上具有多个反应性化学基团。

图4是具有聚合物被覆材料的聚合物基材的示意图，所述聚合物被覆 材料上固定有多个生物活性实体。

图4A是具有聚合物被覆材料的金属基材的示意图，所述聚合物被覆材 料上固定有多个生物活性实体。

图5是固定有多个生物活性实体且结合有附加生物相容性组合物的聚 合物基材的示意图。

图6是具有固定有多个生物活性实体且结合有附加生物相容性组合物 的聚合物被覆材料的聚合物基材的示意图。

图6A是具有固定有多个生物活性实体且结合有附加生物相容性组合 物的聚合物被覆材料的金属基材的示意图。

图6B是具有固定有多个生物活性实体的聚合物被覆材料的聚合物基 材的示意图，该图显示，图6所示的一些生物相容性分子已由基材和聚合 物被覆材料释放。

图6C是具有固定有多个生物活性实体的聚合物被覆材料的金属基材 的示意图，该图显示，图6A所示的一些生物相容性分子已由基材和聚合物 被覆材料释放。

图7是具有固定有多个生物活性实体且结合有附加生物相容性组合物 的三层聚合物被覆材料的聚合物基材的示意图。

图7A是具有固定有多个生物活性实体且结合有附加生物相容性组合 物的三层聚合物被覆材料的金属基材的示意图。

图7B是具有固定有多个生物活性实体的三层聚合物被覆材料的聚合 物基材的示意图，该图显示，图7所示的一些生物相容性分子已由基材和 聚合物被覆材料释放。

图7C是具有固定有多个生物活性实体的三层聚合物被覆材料的金属 基材的示意图，该图显示，图7A所示的一些生物相容性分子已由基材和聚 合物被覆材料释放。

图8是说明对未结合肝素进行灭菌不会显著降低肝素的生物学活性的 直方图。

图9是说明在固定肝素接触环氧乙烷灭菌方案期间和之后，各种生物 相容性有机组合物对固定于聚合物被覆材料上反应性化学基团的端点连接 的肝素生物学活性的影响的直方图。

图10是说明在固定肝素接触环氧乙烷灭菌方案期间和之后，加入的肝 素或硫酸葡聚糖生物相容性有机组合物导致固定于基材聚合物被覆材料上 的肝素产生高水平ATIII结合活性的能力的直方图。

图11是说明在固定肝素接触环氧乙烷灭菌方案期间和之后，加入硫酸 葡聚糖维持固定在聚乙烯醇包被基材上的端点连接肝素的生物学活性的能 力的直方图。

图12是说明在将基材进行压缩和膨胀之后，加入甘油维持固定在基材 聚合物被覆材料上的端点连接肝素的生物学活性的能力的直方图。

图13是说明将基材进行机械压缩、进行环氧乙烷灭菌方案和机械膨胀 之后，加入甘油和肝素维持固定在基材聚合物被覆材料上的端点连接肝素 的生物学活性的能力的直方图。

图14是具有聚合物被覆材料的聚合物基材的示意图，所述聚合物被覆 材料上固定有多个生物活性实体且具有反应性化学基团。

图15是具有聚合物被覆材料的金属基材的示意图，所述聚合物被覆材 料上固定有多个生物活性实体且具有反应性化学基团。

图16是具有共价连接多个生物活性实体和附加生物相容性组合物的 聚合物被覆材料的聚合物基材的示意图。

图17是具有共价连接多个生物活性实体和附加生物相容性组合物的 聚合物被覆材料的金属基材的示意图。

图18是组合有第二生物相容性组合物的本发明实施方式的示意图。

图19是组合有第二生物相容性组合物的本发明实施方式的示意图。

图20是具有固定有多个生物活性实体、结合有第一生物相容性组合物 和第二种生物相容性组合物的聚合物被覆材料的聚合物基材的示意图。

图21是具有固定有多个生物活性实体、结合有第一生物相容性组合物 和第二种生物相容性组合物的聚合物被覆材料的金属基材的示意图。

发明详述

本发明涉及固定有生物活性实体的材料和器件，在灭菌、机械压缩和 膨胀和/或经历可能显著降低该实体生物学活性的储存条件后，固定的生物 活性实体仍能保持显著的生物学活性。经历这种条件的固定的生物活性实 体的生物学活性可能受到至少一种附加生物相容性组合物的正面影响，所 述生物相容性组合物与所述生物活性实体共价或非共价结合。在大多数实 施方式中，所述附加组合物是有机化合物。然而，在一些实施方式中，所 述生物相容性组合物是无机化合物。在优选实施方式中，所述附加组合物 是多糖形式的糖。优选的多糖是糖胺聚糖。优选的糖胺聚糖是肝素组合物、 肝素类似物和肝素衍生物。

参见图1和2，一些聚合物基材(12)含有多个反应性化学基团(16)，它 们分布在连接、限定或固定多个生物活性实体(17)的所述基材的至少一部分 表面上。大部分生物活性实体(17)通过反应性化学基团(16)共价连接或结合 于基材(12)。聚合物基材(12)的表面可以是光滑、粗糙、多孔、弯曲、平坦、 有角、不规则的表面或其组合。在一些实施方式中，具有表面孔隙的基材 含有由该材料多孔表面延伸到材料本体内部的内部孔隙空间。这些多孔性 基材的内部基材约束了这些孔隙，常常提供适合固定生物活性实体的表面。 无论是否具多孔性，基材都可以是细丝、薄膜、片层、管状、网状、织物、 无纺织物和其组合。

适用于固定生物活性实体(17)的基材(12)包括生物相容性聚合物材料， 如聚乙烯、聚氨酯、硅酮、含聚酰胺的聚合物和聚丙烯。如果反应性化学 基团(16)被引入聚合物材料成分中，那么真密度(full density)或多孔性聚四 氟乙烯是合适的聚合物基材(12)。具有作为基材一部分的多个反应性化学基 团的基材在本文中称为“可官能化材料”。生物活性实体与可官能化基材反 应后，则认为该基材被官能化且该生物活性实体被固定。为了在后续加工 条件，如灭菌、机械压缩和膨胀或储存中保持固定的实体的生物学活性， 将附加生物相容性有机化学组合物与官能化材料和固定的实体进行非共价 结合。

基材也可具有通过将一种或多种被覆组合物或材料施加于表面而加到 材料表面上的多种反应性化学基团。至少一部分被覆材料含有能与生物活 性实体发生反应，并用于将生物活性形式的生物活性实体连接、限定或固 定于被覆材料的化学元素、基团、化合物或组分。可以溶质、颗粒、分散 体、涂料或覆盖层的形式施加被覆材料，并以各种方式使其粘附于基材， 这些方式包括但不限于：共价结合，吸附，如物理吸附和化学吸附，以及 非共价结合，如氢键结合或离子键结合。在优选实施方式中，被覆材料以 溶液形式施加，去除溶剂后在基材的一个或多个表面上形成连续或不连续 的薄膜层。可以施加一层或多层被覆材料。各层被覆材料的化学组成可以 相同或不同。在一些实施方式中，被覆材料自身交联，或者与其它层的其 它被覆材料交联。交联结合可以是共价结合或离子结合。

用聚合物被覆材料(18)至少部分地覆盖表面缺少反应性化学基团(或缺 少合适的反应性化学基团)的基材(12、14)(图1A)，所述聚合物被覆材料(18) 上具有多个反应性化学基团(16)(图3和3A)，这些反应性化学基团(16)可连 接、限定或固定生物活性实体(17)(图4和4A)。大部分生物活性实体(17) 通过被覆材料(18)的反应性化学基团(16)共价连接或结合于聚合物被覆材 料(18)。聚合物被覆材料(18)在至少一部分基材(12，14)上形成至少一层。 在一些实施方式中，聚合物被覆材料(18)自身交联(19)或与聚合物被覆材料 的其他层(18a，18b)交联(图7和7A)。交联可以是共价交联、离子结合或二 者。适合被覆的基材是玻璃、金属(14)、陶瓷、聚合物材料(12)，特别是化 学惰性聚合物材料，如聚四氟乙烯。

具有抗凝血酶III结合能力的至少一种类型的生物活性实体(17)被化学 连接、限定或固定于基材(12，14)和/或被覆材料(18)上合适的反应性化学基 团(16)。

生物相容性组合物(11，15，100)包括但不限于：抗血栓药、抗凝血药、 纤溶剂或血栓溶解剂、抗生素、抗微生物/防腐性化合物、抗病毒化合物、 抗增殖剂、细胞粘附化合物、细胞抗粘附化合物和消炎药。特别感兴趣的 抗血栓药是糖胺聚糖，特别是肝素，包括它的衍生物和类似物。其它抗凝 血剂包括但不限于：蛭素、活化蛋白C和前列腺素。纤溶剂或血栓溶解剂 包括但不限于：链激酶、脲激酶和组织纤溶酶原激活剂(tPA)。抗生素的例 子包括但不限于：青霉素、四环素、氯霉素、二甲胺四环素、强力霉素、 万古霉素、杆菌肽、卡那霉素、新霉素、庆大霉素、红霉素和头孢菌素。 头孢菌素的例子包括：头孢噻吩、头孢匹林、头孢唑林、头孢氨苄、头孢 霉定、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢尼 西、头孢雷特、头孢噻肟、拉氧头孢、头孢唑肟、头孢曲松和头孢哌酮。 抗微生物/防腐性化合物的例子包括但不限于：磺胺嘧啶银、氯己定、过氧 乙酸、次氯酸钠、三氯生、苯酚、酚类化合物、碘附化合物、季铵化合物、 氯化物、肝素和其组合。抗病毒剂的例子包括但不限于α-甲基-1-金刚烷甲 胺、羟基-乙氧基甲基鸟嘌呤、金刚烷胺、5-碘代-2′-脱氧尿苷、三氟胸苷、 干扰素和阿糖腺苷。细胞粘附性化合物包括但不限于纤连蛋白、层粘连蛋 白、胶原、玻连蛋白、骨桥蛋白、RGD肽、RGDS肽、YIGSR肽和靶向细 胞表面抗原的抗体。可阻止细胞贴壁的化合物包括聚HEMA、聚乙二醇、 多糖、聚乙烯吡咯烷酮和磷脂。其它生物活性实体包括但不限于：酶、有 机催化剂、核酶、有机金属化合物、蛋白质、糖蛋白、肽、多氨基酸、抗 体、核苷、核苷酸、核酸、类固醇分子、抗生素、抗微生物化合物、抗霉 菌药、细胞因子、糖、疏油化合物、脂质、药物和治疗剂。

如上所述，虽然各种生物活性实体(17)均可用于本发明，但最优选能够 与哺乳动物血液组分相互作用以防止血液组分在基材(12，14)或被覆材料 (18)表面上形成凝块或血栓的实体。许多这类生物活性实体是寡糖或多糖。 一些多糖是糖胺聚糖，包括葡糖胺或半乳糖胺组合物。优选的糖胺聚糖是 肝素组合物、肝素类似物和肝素衍生物。肝素是具有许多生物学功能的复 杂的糖胺聚糖，这些生物学功能是通过它与生长因子、酶、形态发生素、 细胞粘附分子和细胞因子的结合介导的。肝素用作抗凝剂的生物学活性是 基于肝素用作凝血酶和抗凝血酶III(ATIII)结合的催化剂的能力。肝素的大 部分抗凝活性与促进这种结合的五糖序列有关。

本发明固定中最优选的肝素组合物是按照纳入本发明作参考的Larm 的美国专利4,613,665教导制备的具有游离末端醛基的肝素组合物。在制备 具有游离末端醛基的肝素的过程中，通过重氮化降解肝素，形成具有游离 末端醛基的肝素片段。游离的末端醛基使得肝素组合物能“端点连接”于基 材或聚合物被覆材料的伯氨基形成亚胺，通过还原将此亚胺转变为仲胺。 肝素组合物的端点连接使得肝素能够以最利于使肝素组合物的生物活性部 分暴露于负责形成凝块和血栓的血液组分的构象固定。接触负责形成血栓 和凝血的血液组分时，优化固定的肝素能与血液组分相互作用，以减少或 防止在基材和/或被覆材料表面形成血栓或发生其它凝血事件。

用于本发明的其它期望的生物活性实体(17)包括称为“fondaparinux”的 合成肝素组合物、参与抗凝血酶III介导的因子Xa抑制的组合物、抗增殖 剂和消炎药。

尽管是优化的固定方案，但基于肝素的生物实体的生物学活性在灭菌、 机械压缩和膨胀和/或储存该实体的过程中明显降低(图9、11、12和13)。 如上所述，各种因素都可能引起固定的生物活性实体的生物学活性降低。 不管固定实体的生物学活性降低是通过何种机制，加入与固定的生物活性 实体共价和/或非共价结合的生物相容性有机组合物能在灭菌、机械操作(如 机械压缩和膨胀)和/或储存期间和之后保持该实体的生物学活性。

附加生物相容性有机组合物可具有生物学活性或没有生物学活性。附 加生物相容性有机组合物可以是多羟基醛或酮形式的糖及其衍生物。这些 糖包括单糖、二糖、寡糖和多糖，包括糖胺聚糖、糖胺聚甘露糖 (glycosaminomannans)和贮存多糖，如葡聚糖和其衍生物。适用于本发明的 其它生物相容性有机组合物包括分子量小于约100,000MW的带电或不带 电的酸性粘多糖、氨基酸、多肽、蛋白质、糖蛋白、核苷、核苷酸、多核 苷酸或其它生物相容性脂族或芳族化合物。

参见图5-6A，固定有生物活性实体(17)的有覆盖层或无覆盖层的基材 (分别是14、12)具有与生物活性实体(17)、基材(12，14)和/或被覆材料(18) 结合的附加生物相容性组合物(100)。生物相容性组合物优选为有机组合物。 可通过各种方式将生物相容性有机组合物施加到固定的生物活性实体、基 材和/或被覆材料上。在优选实施方式中，将合适的糖基生物相容性组合物 溶解于水性溶剂，通过喷雾、浸渍涂布、浸没、滚涂、铺展或其它沉积方 式将该溶液施加于固定的生物活性实体、基材和/或聚合物被覆材料。在合 适的系统中，可将生物相容性组合物溶解在有机溶剂中并用类似方式施加。

本发明的一个优选实施方式涉及用于在解剖位点上植入或以其它方式 设置的灭菌医疗器件。也优选置入限定某孔隙空间、内腔的解剖结构以加 强该解剖结构或维持由其限定的孔隙空间的灭菌医疗器件。这些灭菌器件 用于脉管结构内部时，端点连接肝素形式的固定的生物活性实体与流过或 围绕该器件的血液相互作用，以最大程度减少或防止在该器件与血液接触 的表面上形成血栓或其它凝集产物。在优选实施方式中，附加生物相容性 有机组合物是与基材和/或被覆材料共价结合的聚乙二醇化合物。共价连接 的肝素能保留在灭菌器件上。优选的灭菌方法包括环氧乙烷气体。

医疗器件的制造可能需要机械操作，而机械操作常常会降低固定的生 物活性实体的生物学活性。如上所述与固定的生物活性实体、基材和/或被 覆材料结合的附加生物相容性组合物也能使固定的生物活性实体在机械压 缩和膨胀医疗器件后保留其生物学活性(图12和13)。对于膨胀型固定模和 固定模-移植片等医疗器件来说，提高固定的生物活性实体的生物学活性特 别重要。

因此，本发明提供固定有生物活性实体的灭菌器件，固定实体的生物 学活性在灭菌过程期间和之后基本保留(图9-11和13)。在灭菌之前，可通 过(例如)压缩和膨胀对该器件进行机械操作，并保留显著的生物学活性(图 12和13)。

图14是本发明实施方式(50)的示意图，该实施方式(50)中聚合物被覆 或涂布材料(18)交联(19)在聚合物基材(12)上。被覆层(18)连接有多个固定的 生物活性实体“B”(17)。被覆层(18)上也具有多个化学反应性基团“R”(13)， 可将生物相容性组合物“S”(15)共价连接到该化学反应性基团“R”(13)上(图 16和17)。在一些实施方式中，共价键可逆，从而使得生物相容性组合物 “S”(15)在合适条件下可由本发明释放。图15和17示意性说明采用金属基 材(14)的相似结构(50)。

图18和19是本发明实施方式(70)的示意图，该实施方式(70)中聚合物 被覆或涂布材料(18)交联(19)在聚合物基材(12)或金属基材(14)上。被覆层 (18)连接有多个固定的生物活性实体“B”(17)和第一生物相容性组合物 “S”(15)。在一些实施方式中，共价键可逆，从而使得生物相容性组合物 “S”(15)在合适条件下可由本发明释放。此外，该实施方式可混有第二生物 相容性组合物“A”(11)。

图20和21是本发明实施方式(80)的示意图，该实施方式(80)中聚合物 被覆或涂布材料(18)交联(19)在聚合物基材(12)或金属基材(14)上。被覆层 (18)固定有多个生物活性实体“B”(17)。使第一生物相容性组合物(100)与生 物活性实体(17)结合。此外，该实施方式可混有第二生物相容性组合物 “A”(11)。

实施例

除了实施例1，仅用样品材料一侧的表面积计算本发明表面上的肝素 活性，但整个样品，包括间隙中都可能固定有肝素。通过测定端点连接的 肝素结合已知量抗-凝血酶III(ATIII)的能力或容量来测定肝素活性。结果表 示为皮摩尔结合的抗-凝血酶III(ATIII)/平方厘米基材(pmol ATIII/cm²基 材)。该测定参见Larsen M.L.等，“Assay of plasma heparin using thrombin and the chromogenic substrate H-D-Phe-Pip-Arg-pNA”(利用凝血酶和发色底物 H-D-Phe-Pip-Arg-pNA的血浆肝素测定)(S-2238)(Thromb.Res.1978； 13：285-288)和Pasche等，“A binding of antithrombin to immobilized heparin under varying flow conditions”(抗凝血酶与固定肝素在不同流动条件下的结 合)(Artif.Organs 1991；15：281-491)。

每单位基材表面积上的ATIII结合活性定义为被覆或未被覆基材的每 单位表观基材表面积结合ATIII的皮摩尔数。表观基材表面积不考虑多个 被覆表面，也不考虑多孔性基材的多孔性。如果基材为多孔性基材，那么 这些计算不考虑多孔性对表面积的影响。例如，基材上固定有端点连接的 肝素的圆柱体管状ePTFE人造血管(由多孔性材料制成)的管状移植物内表 面的表观表面积的计算方法为任何圆柱几何体的面积计算方法，即2πrL： 其中r是移植物内部半径；L为轴向长度；π是圆周率。重要的是，注意到 本文不考虑ePTFE的多孔性和它对表面积的影响。因此，切成方块进行分 析的非多孔性基材的表面积为长乘宽。

实施例1

本实施例证明，肝素接触环氧乙烷(EtO)灭菌过程后，未结合“纯”肝素 的生物学活性被保留。

在本实施例中，未灭菌USP级的干粉状肝素钠获自塞尔斯实验室公司 (俄亥俄州辛辛那提(Cincinnati，OH))。将一定量的肝素放入CHEX-ALL灭 菌袋(纽约长岛城(Long Island City，N.Y.))进行检测。对一组含肝素的袋进行 EtO灭菌。在调理1小时(1hr)、EtO气体停留时间1小时(1hr)、设定温度 为55摄氏度(55℃)、曝气时间12小时(12hr)的条件下进行环氧乙烷灭菌。 对另一组进行无EtO的灭菌过程。第三组未接触灭菌过程。

灭菌过程后，取出各袋中已知量的肝素，并用购自康涅狄格斯坦佛的 美国诊断公司(American Diagnostica Inc.，Stamford，CT)的ACTICHROME 肝素(抗-FXa)测定试剂盒测定其生物学活性。各肝素样品的生物学活性值表 示为每单位质量肝素中肝素的国际单位(IU/mg)。肝素的国际单位是根据肝 素催化的因子X_a被ATIII灭活来计算的。因此，国际单位是肝素的ATIII 结合活性的衡量。对ACTICHROME测试的相应肝素对照而言，肝素活性 的降低简单地表示为IU/mg降低。认为活性降低的肝素已被灭菌过程减活 至一定程度。

图8是说明EtO灭菌对未结合状态的干粉状肝素的抗-凝血酶III(ATIII) 结合活性的影响的直方图。图8显示各组中肝素样品(n＝3)的平均活性水平， 表示为IU/mg。不进行灭菌的对照肝素样品的平均值为138IU/mg。进行非 EtO灭菌过程(即高湿、高温等)的对照肝素样品的平均值为119IU/mg。进 行EtO灭菌过程的肝素样品的平均值为123IU/mg。与未灭菌对照样品相 比，接触非EtO灭菌过程的肝素样品的活性降低14％，而接触EtO灭菌过 程的样品的活性仅降低11％。如图8所示，与未灭菌对照样品相比，在存 在或不存在EtO的条件下对未结合纯肝素粉末进行灭菌不会显著降低肝素 的ATIII结合。通过非EtO灭菌或EtO灭菌不会显著降低未结合、未灭菌 肝素的抗凝血酶III结合活性。因此，经历相似EtO灭菌条件的固定肝素的 抗凝血酶III结合活性的降低必定是由简单接触EtO灭菌或非EtO灭菌以外 的机制引发的。

实施例2

本实施例描述了EtO灭菌不会显著降低肝素抗凝血酶III(ATIII)结合的 本发明实施方式的结构。

按照纳入本文作参考的美国专利6,653,457，将按照纳入本文作参考的 美国专利4,613,665制备的醛改性肝素组合物端点连接到置于膨胀型聚四氟 乙烯(ePTFE)材料上的被覆材料或涂层上。将附加生物相容性有机组合物掺 入该被覆材料和结合的肝素中，以使固定肝素在EtO灭菌过程中不显著丧 失其生物学活性。

片层形式的ePTFE材料获自亚利桑那州弗拉格斯塔夫的W.L.戈尔联合 公司(W.L.Gore & Associates，Inc.，Flagstaff，AZ)，商品名为GORE^TM微孔过 滤介质(GMM-406)。将底基涂层形式的被覆材料施加于ePTFE材料，具体 是将该材料设置到直径十厘米(10cm)的塑料绣花圈(embroidery hoop)上，并 先将支持的ePTFE材料浸入100％异丙醇(IPA)约五分钟(5min)，然后浸入 LUPASOL聚乙烯亚胺(PEI)和IPA的一比一(1:1)溶液中。LUPASOL无水 PEI获自BASF，将其稀释至约4％的浓度，并调节至pH 9.6。将ePTFE材 料浸入该溶液约15分钟后，由该溶液中取出该材料，并用pH 9.6的去离子 (DI)水冲洗15分钟。保留在ePTFE材料上的PEI与pH 9.6的0.05％戊二醛 水溶液(获自安氏公司(Amresco))交联15分钟。将该结构放入pH 9.6的 0.5％PEI水溶液中15分钟，然后再次用pH 9.6的DI水冲洗15分钟，以便 使附加的PEI加入该结构。用氰基硼氢化钠(NaCNBH₃)溶液(5g溶解于1L DI水中，pH 9.6)还原戊二醛与PEI层之间反应形成的亚胺15分钟，并用 DI水冲洗30分钟。

将该结构浸入pH 9.6的0.05％戊二醛水溶液15分钟，然后浸入pH 9.6 的0.5％PEI水溶液15分钟，以便将另一层PEI加入该结构。然后用pH 9.6 的DI水冲洗该结构15分钟。将该结构浸入NaCNBH₃溶液(5g溶解于1L DI 水，pH 9.6)15分钟，然后用DI水冲洗30分钟，即便将得到的亚胺还原。 通过重复这些步骤将第三层施加于该结构。产物是多孔疏水性氟聚合物基 料，该基料的基本上所有暴露表面和间隙表面上都具有亲水性交联聚合物 基料涂层。

在将另一层PEI设置到该结构上的制备过程中，可将中间化学层粘附 于聚合物底基涂层。在硫酸葡聚糖(安玛西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech))和氯化钠(0.15g硫酸葡聚糖和100g NaCl溶解于1L DI 水，pH 3)的60℃溶液中处理该构建物90分钟，然后用DI水冲洗15分钟， 以制备中间离子电荷层。

将该结构放置在0.3％PEI水溶液(pH 9)中约45分钟，然后用氯化钠溶 液(50g NaCl溶解于1L DI水)冲洗20分钟，以便将本文中称为“加帽层”的 PEI层粘附于中间层。最后用DI水冲洗20分钟。

将该结构放入含肝素的氯化钠盐溶液(1.5g肝素，29.3g NaCl溶解于1 L DI水，pH 3.9)，六十摄氏度(60℃)处理120分钟，以便将醛改性肝素端 点连接或偶联于PEI层。将2.86mL体积的2.5％(w/v)水性NaCNBH₃溶液 加入一升(1L)肝素溶液中，然后加入样品。然后用DI水冲洗样品15分钟， 用硼酸盐缓冲液(10.6g硼酸，2.7g NaOH和0.7g NaCl溶解于1L DI水， pH9.0)冲洗20分钟，最后用DI水冲洗15分钟，然后冻干整个结构，得到 结合于ePTFE材料的干燥肝素。用甲苯胺蓝对该结构样品的两侧染色，以 测定肝素的存在和均一性。染色产生均匀紫色表面表明存在肝素，且肝素 均一地结合于ePTFE材料。

通过将特定化合物或组合物加入结合肝素的结构，可以在接触会降低 肝素的生物学活性的条件后维持肝素的生物学活性。该条件包括但不限于： EtO灭菌、机械压缩和膨胀以及储存。使被覆材料包被的上述结构接触以 下化合物的溶液，以评价其对结合于涂层某部分的肝素的生物学活性的稳 定作用：USP级氯化钙(费氏科技公司)、USP级肝素钠(塞尔斯公司)、聚乙 二醇(分子量20,000，西格玛公司)、DEAE葡聚糖(分子量500,000，PK化 学品公司)、葡聚糖硫酸钠(分子量8,000，西格玛公司)和葡聚糖(分子量 9,500，西格玛公司)，它们的浓度为0.5g/100ml DI水，将pH调节至9.6。 也使用0.5g/100mL乙醇的地塞米松，但不调节pH。这些溶液各自称为“处 理溶液”。这些化合物对EtO灭菌后肝素与抗凝血酶III(ATIII)的结合活性 的影响表示为每平方厘米(cm²)基材结合的抗凝血酶III的皮摩尔数。这些数 据小结于图9。

为了使特定含肝素结构接触特定处理溶液，将该结构放入两升(2L)烧 杯中，加入一百毫升(100mL)处理溶液，足以将该结构完全浸没在处理溶 液中。使各结构接触六十摄氏度(60℃)的处理溶液一小时(1hr)。？从该 溶液中取出该结构并冻干，然后进行灭菌过程。

？在EtO灭菌的准备中，将各冻干结构放入Tower DUALPEEL自密封 袋(伊利诺州麦克格的安利真健康护理公司(Allegiance Healthcare Corp.， McGaw Park，IL))中并密封。在调理1小时(1hr)、EtO气体停留时间1小 时(1hr)、设定温度为55摄氏度(55℃)、曝气时间12小时(12hr)的条件下 进行环氧乙烷灭菌。

EtO灭菌后，从袋中取出各结构(包括对照)，并用DI水洗涤15分钟， 用硼酸盐缓冲液(10.6g硼酸、2.7g NaOH和0.7g NaCl溶解于1L DI水， pH9.0)洗涤20分钟，最后用DI水冲洗15分钟。

将该结构切成大小约为一平方厘米(1cm²)的样品，并通过检测端点连 接的肝素结合ATIII的能力测定肝素活性。该测定参见Larsen M.L.等， “Assay of plasma heparin using thrombin and the chromogenic substrate H-D-Phe-Pip-Arg-pNA(S-2238)”(用凝血酶和发色底物 H-D-Phe-Pip-Arg-pNA(S-2238)测定血浆肝素)，Thromb Res 13：285-288 (1978)和Pasche B.等，“A binding of antithrombin to immobilized heparin under varying flow conditions”(抗凝血酶在不同流动条件下与固定肝素的结 合)Artif.Organs 15：281-491(1991)。结果表示为每单位表面积基材结合的 ATIII量，单位是皮摩尔/平方厘米(pmol/cm²)。在整个测定中，将所有样品 保持在湿润条件下。重要的是，注意到如果考虑到材料的两面，则约一平 方厘米(1cm²)的各样品的总表面积为2平方厘米(2cm²)，以pmol/cm²计算 ATIII肝素结合活性时只考虑样品的一个表面(即1cm²)。

图9是说明在固定肝素接触EtO灭菌后，与固定在被覆基材上的肝素 非共价结合的各种生物相容性有机组合物对固定肝素的抗凝血酶III结合活 性的影响。

固定肝素的抗凝血酶III结合活性表示为每平方厘米基材结合的ATIII 皮摩尔数(pmol/cm²)。一组对照样品未灭菌。在不存在与固定肝素和被覆材 料非共价结合的生物相容性有机组合物的情况下对另一组对照样品进行 EtO灭菌。其余各柱代表在与固定肝素和被覆材料非共价结合的所示生物 相容性有机组合物存在下，固定肝素的抗凝血酶III结合活性。所有柱都代 表n＝3个样品的平均值，除了在硫酸葡聚糖中n＝6个样品。

如该直方图所示，与未灭菌对照样品相比，灭菌对照样品的抗凝血酶 III结合活性显著降低。未灭菌对照样品的抗凝血酶III结合活性为103 pmol/cm²基材。灭菌对照样品的抗凝血酶III结合活性为66pmol/cm²基材。 与未灭菌样品相比，EtO灭菌使抗凝血酶III结合活性降低36％。

下一段小结了灭菌后与固定肝素和被覆材料非共价结合的上述生物相 容性有机组合物对抗凝血酶III结合活性的影响。如前所述，在测定抗凝血 酶III结合活性之前，冲洗各结构上的各生物相容性有机组合物。

将肝素加入该结构时，抗凝血酶III结合活性的平均值为108pmol/cm²。 将葡聚糖加入该结构产生的抗凝血酶III结合活性平均值为98pmol/cm²基 材。将硫酸葡聚糖加入该结构时，抗凝血酶III结合活性的平均值为134 pmol/cm²基材。此外，聚乙二醇产生的抗凝血酶III结合活性平均值为129 pmol/cm²基材。有趣的是，这些值大于103pmol/cm²基材的未灭菌对照样 品的平均值。

将无机氯化钙(CaCl₂)加入该结构时，固定肝素的抗凝血酶III结合活性 的平均值为75pmol/cm²基材。将地塞米松加入该结构产生的抗凝血酶III 结合活性平均值为42pmol/cm²基材。DEAE葡聚糖似乎能降低固定肝素的 抗凝血酶III结合活性，平均活性为5pmol/cm²基材。

这些结果表明，与固定肝素和被覆材料非共价结合的合适的生物相容 性组合物能够维持或提高EtO灭菌后端点连接肝素的抗凝血酶III结合活 性。

实施例3

本实施例描述了其它生物相容性有机组合物使端点连接于基材上的聚 合物被覆材料的肝素具有高抗凝血酶III(ATIII)结合活性的能力，所述基材 是可植入医疗器件的部件。

本实施例所用的可植入医疗器件是由膨胀型多孔聚四氟乙烯(ePTFE) 材料制成的镍钛记忆合金线强化管形式，所述聚四氟乙烯(ePTFE)材料获自 W.L.戈尔联合公司，商品名为VIABAHN内用假体(Endoprosthesis)。该管 状器件的长度为15厘米(15cm)，直径为6毫米(6mm)。

VIABAHN内用假体约束在递送导管中，在固定肝素之前需要从导管 中取出。拉拔连接于约束外壳的脱离索(release cord)并使外壳与该器件脱 开，以便取出约束在导管中的各器件进行加工。失去约束后，各器件膨胀 并可用作单独的基材。将各基材(内用假体器件)浸入体积百分比为30:70的 PEI溶液(5％的DI水溶液)和IPA(USP级)中约12小时，以便将聚合物被覆 材料(18)安置在基材(12)上。该聚合物被覆材料(18)包含多个最终端点连接 多个醛改性肝素分子(17)的反应性化学基团(16)。

至少将另外一层被覆材料(18a，18b)安置在第一层PEI层(18)上。可通 过以下方法实现这一目的：将各内用假体器件放置在单独的硅胶管中，硅 胶管连接于蠕动泵和溶液储库。这能使含有被覆材料的其它溶液重复地通 过该管状医疗器件的中心，以便大致涂布该器件的内表面。

各内用假体被约束在这些动态流动系统之一内时，体积百分比为45:55 的0.10％(pH 9.0)PEI和IPA水溶液形式的被覆材料(18)分别通过该器件约 20分钟(20min)。用DI水(pH 9.0)冲洗各器件5分钟(5min)，通过接触0.05％ 戊二醛水溶液(pH 9.0)二十分钟(20min)交联(19)PEI层。然后，再用PEI (0.10％，pH 9.0)水溶液冲洗该器件五分钟(5min)。用氰基硼氢化钠溶液(5g 溶解于1L DI水中，pH 9.0)还原得到的亚胺十五分钟(15min)，用DI水冲 洗三十分钟(30min)。

将中间离子电荷层安置在各器件的交联PEI层上的具体方法为：使硫 酸葡聚糖溶液(溶解于一升(1L)DI水的0.15g硫酸葡聚糖和一百克氯化钠 (100g NaCl)，pH 3)流过动态流动系统和PEI层，在六十摄氏度(60℃)流动 约九十分钟(90min)。然后，用DI水冲洗该系统十五分钟(15min)。

使PEI水溶液(0.075％，pH 9.0)流过该动态流动系统约四十五分钟(45 min)，然后用氯化钠溶液(50g NaCl溶解于1L DI水)冲洗十五分钟(15min)， 以便将PEI“加帽”层(18b)加到离子带电的硫酸葡聚糖层(18a)上。冲洗后， 再用DI水短暂地冲两分半钟(2.5min)。

将该结构放入含肝素的氯化钠盐溶液(1.5g肝素，29.3g NaCl溶解于1 L DI水，pH 3.9)，六十摄氏度(60℃)处理120分钟，以便将醛改性肝素端 点连接或偶联于PEI层。开始该步骤十分钟(10min)后，将2.86mL体积的 2.5％(w/v)水性NaCNBH₃溶液加入一升(1L)肝素溶液中。首先用DI水冲洗 十五分钟(15min)，然后用硼酸溶液(0.7g NaCl、10.6g硼酸和2.7g NaOH 溶解于1L DI水，pH 9.0)冲洗约二十分钟(20min)，最后用DI水冲洗十五 分钟(15min)。然后，对该结构进行冻干操作。用甲苯胺蓝染色所选样品产 生均匀紫色表面则表明存在均一结合的肝素。

根据上述实施例2所述研究中获得的结果，浓度为0.5g/100ml DI水 (pH9.6)的USP级肝素(钠盐)和8,000MW硫酸葡聚糖(钠盐)被选作优选的生 物相容性有机组合物，以维持或稳定EtO灭菌期间或之后固定肝素的抗凝 血酶III结合活性。

对各优选的生物相容性有机组合物而言，将肝素端点连接于聚合物被 覆材料的内用假体部件放置在含有所述生物相容性有机组合物的溶液(各 自浓度为0.5g/100mL DI水，pH 9.6)的塑料管中，60摄氏度(60℃)处理一 小时(1hr)。从塑料管中取出各处理样品，并进行冻干操作。

将各冻干样品放入单独的Tower DUALPEEL自密封袋(伊利诺州麦克 格的安利真健康护理公司(Allegiance Healthcare Corp.，McGaw Park，IL))中 并密封，以进行EtO灭菌。在调理1小时(1hr)、EtO气体停留时间1小时 (1hr)、设定温度为55摄氏度(55℃)、曝气时间12小时(12hr)的条件下进 行环氧乙烷灭菌。

EtO灭菌后，从袋中取出各结构，并用DI水洗涤15分钟，用硼酸盐 缓冲液(10.6g硼酸、2.7g NaOH和0.7g NaCl溶解于1L DI水，pH9.0)洗 涤20分钟，最后用DI水冲洗15分钟。

从各器件上切下各EtO灭菌器件的基材样品(长约0.5cm)，用上述 ATIII结合实验(实施例2)测定固定肝素的生物学活性。在整个测定过程中 保持样品湿润。结果表示为，在各器件内腔表面、而非整个表面(即外腔 (abluminal)和内腔表面)上测定的每单位面积基材结合的抗凝血酶III皮摩 尔数(pmol/cm²)。

图10是直方图，说明接触EtO灭菌方案期间和之后，肝素和硫酸葡聚 糖形式的两种不同生物相容性有机组合物对固定在被覆基材上的肝素的抗 凝血酶III结合活性的影响。抗凝血酶III结合活性表示为每平方厘米基材 上的结合抗凝血酶III的皮摩尔数。如结果所示，使用肝素和硫酸葡聚糖生 物相容性有机组合物导致固定肝素在EtO灭菌后具有高抗凝血酶III结合活 性，其活性分别为97pmol/cm²基材和91pmol/cm²基材。所有柱均代表n＝6 个样品的平均值。

实施例4

本实施例描述了本发明一种实施方式的结构，该实施方式含有端点连 接于聚合物被覆材料的醛改性肝素化合物，所述聚合物被覆材料包括离子 中性的第一被覆层。该结构中的肝素ATIII结合不会因接触EtO灭菌而显 著降低。

选择用作该结构底基涂层的被覆材料，以产生基本无离子电荷的含肝 素被覆材料或涂层。采用聚乙烯醇和PEI作为被覆材料。

按照通过引用纳入本文的美国专利6,653,457，将醛改性肝素组合物结 合于被覆基材。基材(12)是膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材料。将附加生物相 容性有机化学组合物(100)掺入该结构的含肝素被覆材料(18)，以使肝素经 EtO灭菌而不显著降低其生物学活性。

片层形式的ePTFE基材获自亚利桑那州弗拉格斯塔夫的W.L.戈尔联合 公司(W.L.Gore & Associates，Inc.，Flagstaff，AZ)，商品名为GORE^TM微孔过 滤介质(GMM-406)。将一层被覆材料或底基涂层施加于ePTFE基材，即将 该材料设置到直径10cm的塑料绣花圈上，并将支持的ePTFE材料浸入 100％IPA溶液约五分钟(5min)。然后将ePTFE材料浸入百分之二(2％)USP 级聚乙烯醇(PVA)(斯普克醇公司(Spectrum))的水溶液中十五分钟(15min)。 用DI水冲洗十五分钟(15min)后，使PVA层接触百分之二(2％)戊二醛和百 分之一(1％)氢氯酸(HCL)的水溶液十五分钟(15min)，以原位交联(19) PVA(18)。用DI水冲洗该结构十五分钟(15min)，然后再用DI水冲洗十五 分钟(15min)。得到的交联PVA底基涂层不含净离子电荷。

将另一层聚合物被覆材料(18a)加到该结构上，具体是将该结构浸入 0.15％ PEI水溶液(pH 10.5)中三十分钟(30min)。将该结构浸入氰基硼氢化 钠水溶液(5g/L的DI水溶液，pH 10.5)中十五分钟(15min)，以还原得到的 亚胺。用DI水冲洗该结构十五分钟(15min)，然后再用DI水冲洗十五分钟 (15min)。

将上面有多个反应性化学基团的ePTFE被覆基材浸入肝素溶液(1.0g 肝素、29.3g NaCl溶解于1L DI水，pH 3.9)中，60℃处理九十分钟(90min)。 在开始这一步骤之前，将2.86mL体积的2.5％(w/v)NaCNBH₃水溶液加入 1L肝素溶液中。首先用DI水冲洗十五分钟(15min)，然后用硼酸水溶液(0.7 g NaCl、10.6g硼酸和2.7g NaOH溶解于1L DI水，pH 9.0)冲洗约二十分 钟(20min)，最后用DI水冲洗十五分钟(15min)。然后，对该结构进行冻干 操作。然后，用甲苯胺蓝对该结构样品进行染色。染色产生均匀的紫色表 面表明肝素均一地结合在ePTFE被覆材料上。

使该结构接触水溶液处理，该水溶液含有8,000MW USP级硫酸葡聚 糖(钠盐)(西格玛公司(Sigma))形式的生物相容性有机组合物(100)，即将该结 构浸入100mL处理溶液(0.5g硫酸葡聚糖/100mL DI水，pH 9.6)中，六十 摄氏度(60℃)处理一小时(1hr)。从处理溶液中取出该结构后，冻干该结构。

将各冻干结构放入Tower DUALPEEL自密封袋(伊利诺州麦克格的安 利真健康护理公司(Allegiance Healthcare Corp.，McGaw Park，IL))中进行 EtO灭菌。在调理1小时(1hr)、EtO气体停留时间1小时(1hr)、设定温度 为55摄氏度(55℃)、曝气时间12小时(12hr)的条件下进行环氧乙烷灭菌。

EtO灭菌后，从袋中取出各结构(包括对照)，并用DI水洗涤15分钟， 用硼酸盐缓冲液(10.6g硼酸、2.7g NaOH、0.7g NaCl溶解于1L DI水，pH 9.0)洗涤20分钟，最后用DI水冲洗15分钟。

切出端点连接肝素的膜样品(约1cm²)，并用上述ATIII结合实验(实施 例2)测定固定肝素的抗凝血酶III结合活性。在整个测定过程中保持样品湿 润。结果表示为每单位基材表面积结合的抗凝血酶III的皮摩尔数(pmol/cm²基材)。

图11是直方图，说明硫酸葡聚糖形式的生物相容性有机组合物对固定 在膨胀型多孔聚四氟乙烯基材以及聚乙烯醇和PEI的被覆材料上的端点连 接肝素经EtO灭菌后的抗凝血酶III结合活性的影响。固定肝素的生物学活 性表示为每平方厘米基材上结合的抗凝血酶III的皮摩尔数。

未灭菌的对照样品的抗凝血酶III结合活性为150pmol/cm²基材。灭菌 的对照样品的抗凝血酶III结合活性为93pmol/cm²基材。用硫酸葡聚糖处 理的环氧乙烷灭菌样品的抗凝血酶III结合活性为115pmol/cm²基材。该值 大于未接触硫酸葡聚糖处理溶液的EtO灭菌器件的对照值(即93pmol/cm²基材)，这表明加入的硫酸葡聚糖能提高固定肝素经EtO灭菌后的生物学活 性。这两种结构的抗凝血酶III结合活性值均显著低于未处理、非EtO灭菌 对照(150pmol/cm²基材)。

如结果所示，硫酸葡聚糖能显著影响连接于结构的固定肝素经EtO灭 菌后的抗凝血酶III结合活性，所述结构具有包括离子中性第一被覆层的聚 合物被覆材料。所有柱均代表n＝3个样品的平均值。

实施例5

本实施例描述了在施加可能显著降低生物活性实体的生物学活性的机 械应力期间或之后，附加生物相容性有机组合物维持或提高固定在被覆基 材上的生物活性肝素的生物学活性的能力。

在本实施例中，内腔假体形式的可植入医疗器件具有含肝素涂层，如 上述实施例3所述。各假体是由膨胀型多孔聚四氟乙烯(ePTFE)材料制成的 镍钛记忆合金线强化管形式，所述聚四氟乙烯(ePTFE)材料获自W.L.戈尔联 合公司，商品名为VIABAHN内用假体。该管状器件的长度为15厘米(15 cm)，直径为6毫米(6mm)。利用与实施例3所述相同的方法以便在该器件 上形成含肝素涂层。

用生物相容性有机组合物(100)处理时，内腔器件的基材(12)上载有聚 合物被覆材料(18)，聚合物被覆材料(18)的至少一部分端点连接有醛改性肝 素(17)。将所制备器件各区段放入塑料管中，用甘油溶液(5mL西格玛奥德 里奇公司(Sigma-Aldrich)的SigmaUltra甘油的100mL DI水溶液，pH 9.6) 于六十摄氏度(60℃)处理一小时(1hr)。从塑料管中取出各个经处理的器件， 并进行冻干操作。

将各圆柱形内用假体放置在血管内递送系统上并进行机械压缩，直到 它在递送系统上被充分压缩以便约束在限制外壳内。按照实施例3制备的 器件可承受与将该内用假体压缩到递送系统上有关的机械应力，而不会显 著降低掺入涂层的肝素活性。

甘油被选作非共价结合的生物相容性有机组合物(100)，以便在各测试 内用假体的直径发生压缩和膨胀的过程中维持端点连接肝素(17)的生物学 活性。各对照内用假体器件中，端点连接(即共价结合)的肝素(17)和聚合物 被覆材料(18)上没有非共价结合的生物相容性甘油组合物(100)。对各器件 进行冻干操作。

为了将内腔器件压缩到递送系统上，通过固定直径的锥形漏斗拉拔各内用 假体。各内用假体上有六根(6)穿过一端的缝线(Gore-Tex CV-0，0N05)，以便 将该器件拉过所述漏斗。各器件被拉过二十五毫升(25ml)移液管尖头(Falcon， 产品编号#357525)的开口(直径约为3毫米)，并被拉入直径约为3.1mm的玻璃 管内，以便使其保持压缩状态。

压缩后，将各内用假体浸入三十七摄氏度(37℃)的0.9％盐水溶液中展 开，冲洗，如本文所述检测抗凝血酶III结合活性。结果见图12。通过以下 方法制备各内用假体以便检测：用DI水洗涤十五分钟(15min)，然后用硼 酸盐缓冲液(10.6g硼酸、2.7g NaOH、0.7g NaCl溶解于1L DI水，pH 9.0) 冲洗二十分钟(20min)，最后用DI水冲洗十五分钟(15min)。

将各内用假体切成含肝素材料的样品(长约0.5cm)，采用上述抗凝血酶 III(ATIII)结合实验(实施例2)测定结合肝素的生物学活性。在整个测定过程 中保持样品湿润。结果表示为每单位基材表面积结合的抗凝血酶 III(pmol/cm²基材)。

图12是直方图，说明甘油组合物对被覆基材上的固定肝素在压缩和膨 胀后的影响。结果证明，与未加入甘油的类似处理的对照样品相比，向固 定肝素加入甘油能显著提高固定肝素在压缩和膨胀后的抗凝血酶III结合活 性。所有竖直柱均代表n＝3个样品的平均值。

与经相似构建和处理、但未经直径压缩和膨胀的对照材料(137 pmol/cm²)相比，未接受附加甘油生物相容性有机组合物处理的固定于聚合 物被覆材料的肝素经过直径压缩和膨胀后显示出抗凝血酶III结合活性显著 降低(85pmol/cm²)。用生物相容性有机甘油组合物处理固定肝素被覆基材， 并使其接触与未处理结构相同的机械操作时，固定肝素的抗凝血酶III结合 活性仍然保持与对照材料相似(129pmol/cm²)。

实施例6

本实施例描述了加入生物相容性有机组合物对实施例3和5所述包被 医疗器件经过压缩、膨胀和EtO灭菌的ATIII结合活性的影响。

以与实施例3所述的相同方式构建本实施例所用的可植入医疗器件。 该器件是由膨胀型多孔聚四氟乙烯(ePTFE)材料制成的镍钛记忆合金线强 化管形式，所述聚四氟乙烯(ePTFE)材料获自W.L.戈尔联合公司，商品名为 VIABAHN内用假体。该管状器件的长度为15厘米(15cm)，直径为6毫 米(6mm)。采利用与实施例3所述相同的方法以便在该器械上形成含肝素 涂层。

用生物相容性有机组合物(100)处理时，内腔器件的基材(12)上具有聚 合物被覆材料(18)，所述聚合物被覆材料(18)的至少一部分端点连接有醛改 性肝素(17)。将所制备的器件放入塑料管中，用肝素和甘油溶液(0.5g USP 肝素和5mL甘油溶解于100mL DI水中，pH 9.6)于六十摄氏度(60℃)处理 一小时(1hr)。这些化合物的选择是实施例2、3和5的结果。从肝素和甘油 溶液中取出各处理器件，并进行冻干操作。对器件的进一步加工和分析方 法与上述实施例5相同。

图13是直方图，说明甘油和肝素形式的生物相容性有机组合物在固定 肝素的基材和聚合物被覆材料接触EtO灭菌方案、经历压缩和膨胀形式的 机械操作期间和之后，维持固定在基材聚合物被覆材料上肝素的生物学活 性的能力。所有竖直柱均代表n＝3个样品的平均值。

与未进行EtO灭菌以及直径压缩和扩张的类似方式构建和处理的对照 材料(158pmol/cm²)相比，未接受附加甘油和肝素生物相容性有机组合物处 理而接触EtO灭菌以及直径压缩和膨胀的固定肝素被覆基材的抗凝血酶III 结合活性显著降低(63pmol/cm²)。用生物相容性有机甘油和肝素组合物处 理固定肝素被覆基材，并使其接触与未处理结构相同的EtO灭菌条件和机 械操作时，固定肝素的抗凝血酶III结合活性仍然保持与对照材料相似(147 pmol/cm²)。

实施例7

本实施例显示，市售肝素包被的医疗器件的抗凝血酶III结合活性相对 较低。该器件是长五十厘米(50cm)，直径六毫米(6mm)，经灭菌处理的包装 的肝素包被人造血管(购自德国Hechingen的JOTEC公司(JOTEC GmbH， Hechingen，Germany))，商品名为FLOWLINE BIPORE的肝素包被人造血 管(目录号15TW5006N))。按照生产商的说明，该管状人造血管由膨胀型聚 四氟乙烯(ePTFE)材料制成，肝素通过共价或离子方式粘附于该人造血管的 内腔表面。生产商声称，肝素可稳定且永久地连接于ePTFE。据说含肝素 的移植物表面能抗血栓形成。

如上述实施例2所述获得和检测含肝素人造血管的样品(长0.5cm)。如 同本发明材料一样，该人造血管的抗凝血酶III结合活性表示为每平方厘米 基材上抗凝血酶III结合的皮摩尔数(pmol/cm²)。如前述实施例所述，只测 定各器件的内腔表面区域，而不是测定该器件的全部表面区域。ATIII结合 实验的结果表明，尽管生产商声称该人造血管的内腔表面上存在生物活性 肝素，但没有抗凝血酶III结合活性。应注意到，抗凝血酶III结合活性实 验能够检测每平方厘米基材约五皮摩尔(5pmol/cm²基材)以上水平的抗凝 血酶III结合活性。

实施例8

本实施例描述了肽抗菌素制剂作为生物相容性有机组合物与固定于被 覆或涂布基材的生物活性肝素的联用。接触EtO灭菌后，该结构具有显著 的ATIII结合特性。

在本实施例中，片层形式的ePTFE材料获自亚利桑那州弗拉格斯塔夫 的W.L.戈尔联合公司，商品名为GORE^TM微孔过滤介质(GMM-406)，它通 过基本等同于实施例2的方式具有含肝素涂层。

使上述结构接触浓度为0.5g/100ml去离子水(DI水)的杆菌肽(72,000 单位/克)溶液，即将该结构浸入一百毫升(100ml)杆菌肽溶液，室温下温育 三小时(3hr)。从该溶液中取出该结构并冻干，然后进行灭菌过程。

在EtO灭菌的准备中，将各冻干结构放入Tower DUALPEEL自密封 袋(伊利诺州麦克格的安利真健康护理公司(Allegiance Healthcare Corp.， McGaw Park，IL))中并密封。在调理1小时(1hr)、EtO气体停留时间1小时 (1hr)、设定温度为55摄氏度(55℃)、曝气时间12小时(12hr)的条件下进 行环氧乙烷灭菌。

EtO灭菌后，从袋中取出该结构，并用DI水洗涤15分钟，用硼酸盐 缓冲液(10.6g硼酸、2.7g NaOH和0.7g NaCl溶解于1000mL DI水，pH 9.0) 洗涤20分钟，最后用DI水冲洗15分钟。

由灭菌结构切出包含端点连接肝素的膜样品(约1cm²)，并用上述ATIII 结合实验(实施例2)测定固定肝素的抗凝血酶III结合活性。在整个测定过 程中保持样品湿润。结果表示为每单位基材表面积结合的抗凝血酶III的皮 摩尔数(pmol/cm²)。

用杆菌肽处理、接着用环氧乙烷灭菌的样品的抗凝血酶III结合活性为 9pmol/cm²(n＝3)。

实施例9

本实施例描述了将生物相容性有机组合物加入固定于被覆或涂布基材 且之前接触过EtO灭菌的生物活性肝素中。选择肽抗菌素制剂作为本实施 例中的生物相容性有机组合物。以此方式处理的结构在接触EtO灭菌后具 有显著的肝素ATIII结合特性。

在本实施例中，片层形式的ePTFE材料获自亚利桑那州弗拉格斯塔夫 的W.L戈尔联合公司，商品名为GORE^TM微孔过滤介质(GMM-406)，它通 过基本等同于实施例2的方式具有含肝素涂层。

在EtO灭菌的准备中，将各冻干结构放入Tower DUALPEEL自密封 袋(伊利诺州麦克格的安利真健康护理公司(Allegiance Healthcare Corp.， McGaw Park，IL))中并密封。在调理1小时(1hr)、EtO气体停留时间1小时 (1hr)、设定温度为55摄氏度(55℃)、曝气时间12小时(12hr)的条件下进 行环氧乙烷灭菌。

EtO灭菌后，该结构在NUAIRE II类A/B3型生物安全柜(型号为 NU-425-600)(明尼苏达州普利茅斯(Plymouth，MN))中进行无菌操作。

由该结构切出大小为约一平方厘米(1cm²)的灭菌样品，并浸入过滤除 菌的杆菌肽溶液(649.4mg 77000单位/克的杆菌肽溶解于10ml 0.9％氯化钠 冲洗溶液中，购自霍氏公司(Hospira，Inc.))中，得到的浓度约为每毫升USP 级0.9％氯化钠冲洗溶液中五千(5000)单位。使样品在室温下接触杆菌肽溶 液两分钟(2min)。

从该溶液中取出样品，并用DI水洗涤15分钟，用硼酸盐缓冲液(10.6g 硼酸、2.7g NaOH和0.7g NaCl溶解于1000mL DI水，pH 9.0)洗涤20分 钟，最后用DI水冲洗15分钟。

切出包含端点连接肝素的片层材料样品(约1cm²)，并用上述ATIII结 合实验(实施例2)测定固定肝素的抗凝血酶III结合活性。在整个测定过程 中保持样品湿润。结果表示为每单位基材表面积结合的抗凝血酶III的皮摩 尔数(pmol/cm²)。

先用环氧乙烷灭菌、再用杆菌肽处理的样品的抗凝血酶III结合活性为 185pmol/cm²(n＝3)。这些结果表明，治疗剂可以在固定于被覆基材的生物 活性肝素灭菌之后与该实体混合，这不会显著降低其生物学活性。

实施例10

本实施例说明与生物相容性有机组合物混合、EtO灭菌、最后用肽抗 菌素制剂处理的固定于被覆基材的生物活性肝素。以此方式处理的结构具 有显著的肝素ATIII结合特性。

在本实施例中，片层形式的ePTFE材料获自亚利桑那州弗拉格斯塔夫 的W.L.戈尔联合公司，商品名为GORE^TM微孔过滤介质(GMM-406)，它通 过基本等同于实施例2的方式具有含肝素涂层。

使上述结构接触浓度为0.5g/100ml DI水、调整为pH 9.6的聚乙二醇 (分子量20,000，西格玛公司)溶液。将该结构放入烧杯中，加入一百毫升(100 mL)溶液，以将该结构完全浸没在聚乙二醇溶液中。使该结构接触六十摄氏 度(60℃)的聚乙二醇溶液一小时(1hr)。从该溶液中取出该结构并冻干，然 后进行灭菌过程。

在EtO灭菌的准备中，将该冻干结构放入Convertors自密封袋(伊利 诺州麦克格的卡迪诺健康公司(Cardinal Health，McGaw Park，IL))中并密封。 在调理1小时(1hr)、EtO气体停留时间1小时(1hr)、设定温度为55摄氏 度(55℃)、曝气时间12小时(12hr)的条件下进行环氧乙烷灭菌。

EtO灭菌后，该结构在NUAIRE II类A/B3型生物安全柜(型号为 NU-425-600)(明尼苏达州普利茅斯(Plymouth，MN))中进行无菌操作。

由该结构切出大小为约一平方厘米(1cm²)的灭菌样品，并浸入过滤除 菌的杆菌肽溶液(649.4mg 77,000单位/克的杆菌肽溶解于10ml 0.9％氯化 钠冲洗溶液中)中，得到的浓度约为每毫升USP级0.9％氯化钠冲洗溶液中 五千(5,000)单位。使样品在室温下接触杆菌肽溶液两分钟(2min)。

从该溶液中取出样品，并用DI水洗涤15分钟，用硼酸盐缓冲液(10.6g 硼酸、2.7g NaOH和0.7g NaCl溶解于1,000mL DI水，pH 9.0)洗涤20分 钟，最后用DI水冲洗15分钟。

切出包含端点连接肝素的膜样品(约1cm²)，并用上述ATIII结合实验 (实施例2)测定固定肝素的抗凝血酶III结合活性。在整个测定过程中保持 样品湿润。结果表示为每单位基材表面积结合的抗凝血酶III的皮摩尔数 (pmol/cm²)。

先用聚乙二醇处理、环氧乙烷灭菌、再用杆菌肽处理的样品的抗凝血 酶III结合活性为195pmol/cm²(n＝3)。因此，固定有生物活性肝素并混有 第一生物相容性有机组合物(PEG)的灭菌被覆基材可在EtO灭菌后用第二 生物相容性有机组合物(杆菌肽)进一步处理，并基本保持ATIII结合活性。

实施例11

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料或涂层共价连接，随后将生物相容性有机组合物(醛活化葡 聚糖)共价连接于所述被覆材料。该组合物接触EtO灭菌后显示出明显的肝 素生物学活性。

在本实施例中，片层形式的ePTFE材料获自亚利桑那州弗拉格斯塔夫 的W.L.戈尔联合公司(W.L.Gore & Associates，Inc.，Flagstaff，AZ)，商品名 为GORE^TM微孔过滤介质(GMM-406)。这种ePTFE材料通过基本等同于实 施例2的方式具有含肝素涂层，然而，该结构在涂布后储存于DI水中，而 不是冻干。

涂有被覆材料的上述结构接触醛活化葡聚糖(分子量40,000，皮尔斯公 司(Pierce))溶液(0.050g醛活化葡聚糖、2.93g NaCl溶解于100ml DI水， pH 5.5)，于六十摄氏度(60℃)温育一百二十分钟(120min)。在加入样品之 前将0.286mL体积的2.5％(w/v)NaCNBH₃水溶液加入一百毫升(100mL)醛 活化葡聚糖溶液中。

由醛活化葡聚糖溶液中取出该结构，用DI水洗涤样品15分钟，用硼 酸盐缓冲液(10.6g硼酸，2.7g NaOH和0.7g NaCl溶解于1,000mL DI水， pH 9.0)冲洗20分钟，最后用DI水冲洗15分钟，然后冻干整个结构，得到 结合于ePTFE材料的干燥肝素。

在EtO灭菌的准备中，将该冻干结构放入Convertors自密封袋(伊利 诺州麦克格的卡迪诺健康公司(Cardinal Health，McGaw Park，IL))中并密封。 在调理1小时(1hr)、EtO气体停留时间1小时(1hr)、设定温度为55摄氏 度(55℃)、曝气时间12小时(12hr)的条件下进行环氧乙烷灭菌。

切出包含端点连接肝素的灭菌膜样品(约1cm²)，并用上述ATIII结合 实验(实施例2)测定固定肝素的抗凝血酶III结合活性。结果表示为每单位 基材表面积结合的抗凝血酶III的皮摩尔数(pmol/cm²)。

如本实施例所述制备的样品的平均抗凝血酶III结合活性为65 pmol/cm²(n＝3)。本实施例显示，除共价结合的端点连接肝素外，生物相容 性有机组合物也可共价连接于涂层，而在EtO灭菌后保持显著的肝素活性。

实施例12

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料或涂层共价连接，随后将生物相容性有机组合物(醛活化聚 乙二醇，分子量1,000)共价连接于所述被覆材料。该组合物接触EtO灭菌 后显示出明显的肝素生物学活性。

在本实施例中，片层形式的ePTFE材料获自亚利桑那州弗拉格斯塔夫 的W.L戈尔联合公司(W.L.Gore & Associates，Inc.，Flagstaff，AZ)，商品名 为GORE^TM微孔过滤介质(GMM-406)。这种ePTFE材料通过基本等同于实 施例2的方式具有含肝素涂层，然而，该结构在涂布后储存于DI水中，而 不是冻干。

涂有被覆材料的上述结构接触醛活化PEG(分子量1,000，纳米技术公 司(Nanocs))溶液(0.20g PEG、3.90g NaCl溶解于133ml DI水，pH 5.5)， 于六十摄氏度(60℃)温育一百二十分钟(120min)。在加入样品之前，将0.380 mL体积的2.5％(w/v)NaCNBH₃水溶液加入一百毫升(100mL)PEG溶液中。

由PEG溶液中取出该结构，用DI水洗涤样品15分钟，用硼酸盐缓冲 液(10.6g硼酸，2.7g NaOH和0.7g NaCl溶解于1,000mL DI水，pH 9.0) 冲洗20分钟，最后用DI水冲洗15分钟，然后冻干整个结构，得到结合于 ePTFE材料的干燥肝素。

在EtO灭菌的准备中，将该冻干结构放入Convertors自密封袋(伊利 诺州麦克格的卡迪诺健康公司(Cardinal Health，McGaw Park，IL))中并密封。 在调理1小时(1hr)、EtO气体停留时间1小时(1hr)、设定温度为55摄氏 度(55℃)、曝气时间12小时(12hr)的条件下进行环氧乙烷灭菌。

切出包含端点连接肝素的灭菌膜样品(约1cm²)，并用上述ATIII结合 实验(实施例2)测定固定肝素的抗凝血酶III结合活性。结果表示为每单位 基材表面积结合的抗凝血酶III的皮摩尔数(pmol/cm²)。

如本实施例所述制备的样品的平均抗凝血酶III结合活性为96 pmol/cm²(n＝3)。本实施例显示，除共价结合的端点连接肝素外，生物相容 性有机组合物也可共价连接于涂层，而保持显著的肝素活性。

实施例13

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料或涂层共价连接，随后将生物相容性有机组合物(醛活化聚 乙二醇，分子量5,000)共价连接于所述被覆或涂布材料。该组合物接触EtO 灭菌后显示出明显的肝素生物学活性。

在本实施例中，片层形式的ePTFE材料获自亚利桑那州弗拉格斯塔夫 的W.L.戈尔联合公司(W.L.Gore & Associates，Inc.，Flagstaff，AZ)，商品名 为GORE^TM微孔过滤介质(GMM-406)。这种ePTFE材料通过基本等同于实 施例2的方式具有含肝素涂层，然而，该结构在涂布后储存于DI水中，而 不是冻干。

涂有被覆材料的上述结构接触醛活化PEG(分子量5,000，纳米技术公 司(Nanocs))溶液(0.20g PEG、3.90g NaCl溶解于133ml DI水，pH 5.5)， 于六十摄氏度(60℃)温育一百二十分钟(120min)。加入样品之前将0.380mL 体积的2.5％(w/v)NaCNBH₃水溶液加入一百毫升(100mL)PEG溶液中。

由PEG溶液中取出该结构，用DI水洗涤样品15分钟，用硼酸盐缓冲 液(10.6g硼酸，2.7g NaOH和0.7g NaCl溶解于1,000mL DI水，pH 9.0) 冲洗20分钟，最后用DI水冲洗15分钟，然后冻干整个结构，得到结合于 ePTFE材料的干燥肝素。

在EtO灭菌的准备中，将该冻干结构放入Convertors自密封袋(伊利 诺州麦克格的卡迪诺健康公司(Cardinal Health，McGaw Park，IL))中并密封。 在调理1小时(1hr)、EtO气体停留时间1小时(1hr)、设定温度为55摄氏 度(55℃)、曝气时间12小时(12hr)的条件下进行环氧乙烷灭菌。

切出包含端点连接肝素的灭菌膜样品(约1cm²)，并用上述ATIII结合 实验(实施例2)测定固定肝素的抗凝血酶III结合活性。结果表示为每单位 基材表面积结合的抗凝血酶III的皮摩尔数(pmol/cm²)。

如本实施例所述制备的样品的平均抗凝血酶III结合活性为64 pmol/cm²(n＝3)。本实施例显示，除共价结合的端点连接肝素外，生物相容 性有机组合物也可共价连接于涂层，而保持显著的肝素活性。

实施例14

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料或涂层共价连接，随后将生物相容性有机组合物(EDC活化 的USP肝素)共价连接于所述被覆材料。该组合物接触EtO灭菌后显示出明 显的肝素生物学活性。

在本实施例中，片层形式的ePTFE材料获自亚利桑那州弗拉格斯塔夫 的W.L.戈尔联合公司(W.L.Gore & Associates，Inc.，Flagstaff，AZ)，商品名 为GORE^TM微孔过滤介质(GMM-406)。这种ePTFE材料通过基本等同于实 施例2的方式具有含肝素涂层，然而，该结构在涂布后储存于DI水中，而 不是冻干。

将该结构放入含USP级肝素的氯化钠盐溶液(1.5g USP肝素，29.3g NaCl溶解于1L DI水，pH 3.9)，六十摄氏度(60℃)处理120分钟，以便将 USP级肝素连接或偶联于已含端点连接肝素的PEI层。将该结构转移至溶 解于1L DI水的0.1M MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸]BupH^tm MES缓冲盐水 (皮尔斯公司)、1.5g USP肝素、29.3g NaCl、0.20g盐酸N-(3-二甲基氨基 丙基)-N′-乙基碳二亚胺(EDC)和0.13g N-羟基磺基琥珀酰亚胺(NHS)的溶液 中，pH 5.5，室温培育4小时(4hr)。

由上述溶液中取出该结构，用DI水洗涤样品15分钟，用硼酸盐缓冲 液(10.6g硼酸，2.7g NaOH和0.7g NaCl溶解于1000mL DI水，pH 9.0) 冲洗20分钟，最后用DI水冲洗15分钟，然后冻干整个结构，得到结合于 ePTFE材料的干燥肝素。

在EtO灭菌的准备中，将该冻干结构放入Convertors自密封袋(伊利 诺州麦克格的卡迪诺健康公司(Cardinal Health，McGaw Park，IL))中并密封。 在调理1小时(1hr)、EtO气体停留时间1小时(1hr)、设定温度为55摄氏 度(55℃)、曝气时间12小时(12hr)的条件下进行环氧乙烷灭菌。

切出包含端点连接肝素的灭菌膜样品(约1cm²)，并用上述ATIII结合 实验(实施例2)测定固定肝素的抗凝血酶III结合活性。结果表示为每单位 基材表面积结合的抗凝血酶III的皮摩尔数(pmol/cm²)。

如本实施例所述制备的样品的平均抗凝血酶III结合活性为31 pmol/cm²(n＝3)。本实施例显示，除共价结合的端点连接肝素外，生物相容 性有机组合物也可共价连接于涂层，而保持显著的肝素活性。

实施例15

本实施例说明，将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材料 上的被覆材料或涂层共价连接，随后肝素与所述涂层发生第二次共价连接。 为了实现端点连接的肝素的第二次共价连接，用EDC激活羧酸基团，使其 与涂层中存在的其余伯胺基发生反应。该组合物接触EtO灭菌后显示出明 显的肝素生物学活性。

在本实施例中，片层形式的ePTFE材料获自亚利桑那州弗拉格斯塔夫 的W.L.戈尔联合公司(W.L.Gore & Associates，Inc.，Flagstaff，AZ)，商品名 为GORE^TM微孔过滤介质(GMM-406)。这种ePTFE材料通过基本等同于实 施例2的方式具有含肝素涂层，然而，该结构在涂布后储存于DI水中，而 不是冻干。

将膜转移至溶解于1L DI水的0.1M MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸] BupH^tm MES缓冲盐水(皮尔斯公司)、29.3g NaCl、0.20g盐酸N-(3-二甲基 氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(EDC)和0.13g N-羟基磺基琥珀酰亚胺(NHS)的 溶液中，pH 5.5，室温培育4小时(4hr)。

由上述溶液中取出该结构，用DI水洗涤样品15分钟，用硼酸盐缓冲 液(10.6g硼酸，2.7g NaOH和0.7g NaCl溶解于1,000mL DI水，pH 9.0) 冲洗20分钟，最后用DI水冲洗15分钟，然后冻干整个结构，得到结合于 ePTFE材料的干燥肝素。

在EtO灭菌的准备中，将该冻干结构放入Convertors自密封袋(伊利 诺州麦克格的卡迪诺健康公司(Cardinal Health，McGaw Park，IL))中并密封。 在调理1小时(1hr)、EtO气体停留时间1小时(1hr)、设定温度为55摄氏 度(55℃)、曝气时间12小时(12hr)的条件下进行环氧乙烷灭菌。

切出包含端点连接肝素的灭菌膜样品(约1cm²)，并用上述ATIII结合 实验(实施例2)测定固定肝素的抗凝血酶III结合活性。结果表示为每单位 基材表面积结合的抗凝血酶III的皮摩尔数(pmol/cm²)。

如本实施例所述制备的样品的平均抗凝血酶III结合活性为20 pmol/cm²(n＝3)。本实施例说明，除共价端点连接外，还可将肝素进一步共 价连接于涂层，而在EtO灭菌后保持显著的肝素活性。

实施例16

本实施例描述了肽抗菌素制剂作为生物相容性有机组合物与固定于被 覆基材的生物活性肝素的联用。经过机械压缩和膨胀后，该结构的ATIII 结合活性大于5pmol/cm²。

在本实施例中，如实施例3所述，使内腔假体形式的可植入医疗器件 肝素化。然后，用实施例8所述条件施加杆菌肽。然后，按照实施例5所 述将肝素化的内腔假体进行机械压缩、机械膨胀、冲洗、切割测试、并测 定ATIII结合。

用杆菌肽处理、随后压缩和膨胀的样品的抗凝血酶III结合活性大于5 pmol/cm²。

实施例17

本实施例描述了将生物相容性有机组合物加入固定于被覆基材且之前 经过压缩和膨胀的生物活性肝素。将肽抗菌素制剂选作生物相容性有机组 合物。压缩和扩张后，以此方式处理的结构具有显著的肝素ATIII结合。

在本实施例中，按照实施例3所述使内腔假体形式的可植入医疗器件 肝素化，并按照实施例5所述进行机械压缩和膨胀。然后，用杆菌肽处理 内腔假体，如实施例9所述冲洗。然后，按照实施例5所述将肝素化的内 腔假体切割用于测试并测定ATIII结合。

压缩和膨胀、随后加入杆菌肽的肝素化样品的抗凝血酶III结合活性大 于5pmol/cm²。

实施例18

本实施例描述固定于被覆基材的生物活性肝素。将固定的生物活性肝 素与生物相容性有机组合物混合，机械压缩，机械膨胀，并用肽抗生物制 剂处理。以此方式处理的结构在接触机械操作后具有显著的肝素ATIII结 合。

如实施例17所述处理和检测内腔假体，但有一个不同之处：在压缩和 膨胀之前，如实施例10所述将聚乙二醇与肝素化内腔假体混合。

压缩和膨胀、随后加入杆菌肽的混有生物相容性有机组合物的肝素化 样品的抗凝血酶III结合活性大于5pmol/cm²。

实施例19

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料或涂层共价连接，随后将生物相容性有机组合物(醛活化葡 聚糖)共价连接于所述被覆材料。该组合物经过机械压缩和扩张后显示出显 著的肝素生物学活性。

在本实施例中，如实施例3所述，使内腔假体形式的可植入医疗器件 肝素化。如实施例11所述将醛活化葡聚糖固定于被覆层。然后，按照实施 例5所述将肝素化的内腔假体进行机械压缩、机械膨胀、切割测试、并测 定ATIII结合。

如本实施例所述制备的样品的抗凝血酶III结合活性大于5pmol/cm²。

实施例20

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料或涂层共价连接，随后将生物相容性有机组合物(醛活化聚 乙二醇，分子量1,000)共价连接于所述被覆材料。该组合物经过机械压缩 和扩张后显示出显著的生物肝素活性。

在本实施例中，如实施例3所述，使内腔假体形式的可植入医疗器件 肝素化。如实施例12所述将醛活化聚乙二醇固定于被覆层。然后，按照实 施例5所述将肝素化的内腔假体进行压缩、膨胀、切割测试并测定ATIII 结合。

如本实施例所述制备的样品的抗凝血酶III结合活性大于5pmol/cm²。

实施例21

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料或涂层共价连接，随后将生物相容性有机组合物(醛活化聚 乙二醇，分子量5,000)共价连接于所述被覆材料。该组合物经过机械压缩 和扩张后显示出显著的生物肝素活性。

在本实施例中，如实施例3所述，使内腔假体形式的可植入医疗器件 肝素化。如实施例13所述将醛活化聚乙二醇固定于被覆层。然后，按照实 施例5所述将肝素化的内腔假体进行压缩、膨胀、切割测试并测定ATIII 结合。

如本实施例所述制备的样品的抗凝血酶III结合活性大于5pmol/cm²。

实施例22

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料或涂层共价连接，随后将生物相容性有机组合物(EDC活化 的USP肝素)共价连接于所述被覆材料。该组合物经过机械压缩和扩张后显 示出显著的生物肝素活性。

在本实施例中，如实施例3所述，使内腔假体形式的可植入医疗器件 肝素化。如实施例14所述将USP肝素固定于被覆层。然后，按照实施例5 所述将肝素化的内腔假体进行压缩、膨胀、切割测试并测定ATIII结合。

如本实施例所述制备的样品的抗凝血酶III结合活性大于5pmol/cm²。

实施例23

本实施例说明，将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材料 上的被覆材料或涂层共价连接，随后肝素与所述涂层的反应基团发生第二 次共价连接。为了实现端点连接的肝素的第二次共价连接，用EDC激活羧 酸基团，使其与涂层中存在的其余伯胺基发生反应。对该组合物进行机械 压缩和膨胀。然后，该结构显示出显著的肝素生物学活性。

在本实施例中，如实施例3所述，使内腔假体形式的可植入医疗器件 肝素化。如实施例15所述，使固定肝素与被覆层进一步共价连接。然后， 按照实施例5所述将肝素化的内腔假体进行机械压缩、机械膨胀、切割测 试并测定ATIII结合。

如本实施例所述制备的样品的抗凝血酶III结合活性大于5pmol/cm²。

实施例24

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料或涂层共价连接，随后再将生物相容性有机组合物通过不 稳定键附加连接于所述被覆材料。所述不稳定键能够局部递送治疗性化合 物，而稳定结合的肝素在灭菌以及机械压缩和膨胀后仍然保持显著的ATIII 结合活性。

在本实施例中，如实施例3所述，使内腔假体形式的可植入医疗器件 肝素化。将该结构放入含肝素的氯化钠盐溶液(1.5g醛改性肝素，29.3g NaCl溶解于1L DI水，pH 3.9)，六十摄氏度(60℃)处理120分钟，以便附 加的醛改性肝素通过不稳定共价键端点连接于涂层。重要的是，注意到在 醛改性肝素的第二次偶联期间未加入还原剂NaCNBH₃。保持非还原状态的 伯胺和醛之间形成的键是不稳定的。然后用DI水冲洗样品15分钟，用硼 酸盐缓冲液(10.6g硼酸，2.7g NaOH和0.7g NaCl溶解于1L DI水，pH 9.0) 冲洗20分钟，最后用DI水冲洗15分钟，然后冻干整个结构，得到结合于 ePTFE材料的干燥肝素。

然后，如实施例5所述压缩肝素化内腔假体，如实施例3所述进行灭 菌。然后，按照实施例5所述将它们膨胀、切割测试并测定ATIII结合。

如本实施例所述制备的样品的抗凝血酶III结合活性大于5pmol/cm²。

实施例25

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料或涂层共价连接，随后再将生物相容性有机组合物通过不 稳定键附加连接于所述被覆材料。所述不稳定键能够局部递送治疗性化合 物，而稳定结合的肝素在机械压缩和膨胀后仍然保持显著的ATIII结合活 性。

在本实施例中，如实施例3所述，使内腔假体形式的可植入医疗器件 肝素化。将该结构放入含肝素的氯化钠盐溶液(1.5g醛改性肝素，29.3g NaCl溶解于1L DI水，pH 3.9)，六十摄氏度(60℃)培育120分钟，以便附 加的醛改性肝素通过不稳定共价键端点连接于涂层。重要的是，注意到在 醛改性肝素的第二次偶联期间未加入还原剂NaCNBH₃。保持非还原状态的 伯胺和醛之间形成的键是不稳定的。然后用DI水冲洗样品15分钟，用硼 酸盐缓冲液(10.6g硼酸，2.7g NaOH和0.7g NaCl溶解于1L DI水，pH 9.0) 冲洗20分钟，最后用DI水冲洗15分钟，然后冻干整个结构，得到结合于 ePTFE材料的干燥肝素。

然后，按照实施例5所述将肝素化的内腔假体进行压缩、膨胀、切割 测试并测定ATIII结合。

如本实施例所述制备的样品的抗凝血酶III结合活性大于5pmol/cm²。

实施例26

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料或涂层共价连接，随后再将生物相容性有机组合物通过不 稳定键连接于所述被覆材料。所述不稳定键能够局部递送治疗性化合物， 而稳定结合的肝素在EtO灭菌后仍然保持显著的ATIII结合活性。

在本实施例中，片层形式的ePTFE材料获自亚利桑那州弗拉格斯塔夫 的W.L.戈尔联合公司，商品名为GORE^TM微孔过滤介质(GMM-406)，它通 过基本等同于实施例2的方式具有含肝素涂层。将该结构放入含肝素的氯 化钠盐溶液(1.5g醛改性肝素，29.3g NaCl溶解于1L DI水，pH 3.9)，六 十摄氏度(60℃)培育120分钟，以便附加的醛改性肝素通过不稳定共价键端 点连接于涂层。重要的是，注意到在醛改性肝素的第二次偶联期间未加入 还原剂NaCNBH₃。保持非还原状态的伯胺和醛之间形成的键是不稳定的。 然后用DI水冲洗样品15分钟，用硼酸盐缓冲液(10.6g硼酸，2.7g NaOH 和0.7g NaCl溶解于1L DI水，pH 9.0)冲洗20分钟，最后用DI水冲洗15 分钟，然后冻干整个结构，得到结合于ePTFE材料的干燥肝素。

然后，按照实施例2所述将肝素化的材料进行灭菌、切割测试并测定 ATIII结合。

如本实施例所述制备的样品的抗凝血酶III结合活性大于5pmol/cm²。

实施例27

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料共价连接，然后将生物相容性有机组合物(醛活化聚乙二醇) 与被覆材料共价连接，最后加入非共价混合的生物相容性有机组合物(杆菌 肽)。该组合物接触EtO灭菌后显示出明显的肝素生物学活性。

在本实施例中，片层形式的ePTFE材料获自亚利桑那州弗拉格斯塔夫 的W.L.戈尔联合公司，商品名为GORE^TM微孔过滤介质(GMM-406)，它通 过基本等同于实施例2的方式具有含肝素涂层。如实施例12所述将醛活化 聚乙二醇(分子量1,000)共价连接于被覆材料，然后如实施例8所述将杆菌 肽与该组合物非共价混合。然后如实施例8所述将该组合物进行灭菌和取 样，用实施例2所述的ATIII结合实验测定固定肝素的抗凝血酶III结合活 性。

如本实施例所述制备的样品的抗凝血酶III结合活性大于5pmol/cm²。

实施例28

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料共价连接，然后将生物相容性有机组合物(醛活化聚乙二醇) 与被覆材料共价连接，最后加入非共价混合的生物相容性有机组合物(杆菌 肽)。该组合物经过机械压缩和扩张后显示出显著的肝素生物学活性。

在本实施例中，如实施例3所述，使内腔假体形式的可植入医疗器件 肝素化。如实施例12所述将醛活化聚乙二醇(分子量1,000)共价连接于被覆 材料，然后如实施例8所述将杆菌肽与该组合物非共价混合。然后，按照 实施例5所述将肝素化的内腔假体进行机械压缩、机械膨胀、冲洗、切割 测试、并测定ATIII结合。

如本实施例所述制备的样品的抗凝血酶III结合活性大于5pmol/cm²。

实施例29

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料共价连接，然后将生物相容性有机组合物(醛活化葡聚糖) 与被覆材料共价连接，最后加入非共价混合的生物相容性有机组合物(地塞 米松)。该组合物接触EtO灭菌后显示出明显的肝素生物学活性。

在本实施例中，片层形式的ePTFE材料获自亚利桑那州弗拉格斯塔夫 的W.L.戈尔联合公司，商品名为GORE^TM微孔过滤介质(GMM-406)，它通 过基本等同于实施例2的方式具有含肝素涂层。如实施例11所述，将醛活 化葡聚糖共价连接于被覆材料，然后如实施例2所述将地塞米松与该组合 物非共价混合，随后灭菌和取样。用实施例2所述的ATIII结合实验测定 固定肝素的抗凝血酶III结合活性。

如本实施例所述制备的样品的抗凝血酶III结合活性大于5pmol/cm²。

实施例30

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料共价连接，然后将生物相容性有机组合物(醛活化葡聚糖) 与被覆材料共价连接，最后加入非共价混合的生物相容性有机组合物(地塞 米松)。该组合物经过机械压缩和扩张后显示出显著的肝素生物学活性。

在本实施例中，如实施例3所述，使内腔假体形式的可植入医疗器件 肝素化。如实施例11所述，将醛活化葡聚糖共价连接于被覆材料，然后如 实施例2所述将地塞米松与该组合物非共价混合。然后，按照实施例5所 述将肝素化的内腔假体进行机械压缩、机械膨胀、冲洗、切割测试、并测 定ATIII结合。

如本实施例所述制备的样品的抗凝血酶III结合活性大于5pmol/cm²。

实施例31

本实施例描述了将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材 料上的被覆材料或涂层共价连接，然后再将生物相容性有机组合物(聚乙二 醇)通过不稳定键与被覆材料连接，最后加入非共价混合的生物相容性有机 组合物(地塞米松)。该组合物接触EtO灭菌后显示出明显的肝素生物学活 性。

在本实施例中，片层形式的ePTFE材料获自亚利桑那州弗拉格斯塔夫 的W.L.戈尔联合公司，商品名为GORE^TM微孔过滤介质(GMM-406)，它通 过基本等同于实施例2的方式具有含肝素涂层。用实施例12所述的方法(除 了加入NaCNBH₃)将醛改性聚乙二醇(1,000MW)通过不稳定键连接于涂层。 重要的是，注意到在醛改性聚乙二醇的偶联期间未加入还原剂NaCNBH₃。 保持非还原状态的伯胺和醛之间形成的键是不稳定的。然后用DI水冲洗样 品15分钟，用硼酸盐缓冲液(10.6g硼酸，2.7g NaOH和0.7g NaCl溶解于 1L DI水，pH 9.0)冲洗20分钟，最后用DI水冲洗15分钟，然后冻干整个 结构，得到结合于ePTFE材料的干燥肝素和聚乙二醇。然后，如实施例2 所述将地塞米松与该组合物非共价混合。然后，将该肝素化材料灭菌、取 样，并用实施例2所述的ATIII结合实验测定它的抗凝血酶III结合活性。

如本实施例所述制备的样品的抗凝血酶III结合活性大于5pmol/cm²。

实施例32

本实施例说明将生物活性肝素与位于膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)材料 上的被覆材料或涂层共价连接，然后再将生物相容性有机组合物(聚乙二醇) 通过不稳定键与被覆材料连接，最后加入非共价混合的生物相容性有机组 合物(地塞米松)。该组合物经过机械压缩和扩张后显示出显著的肝素生物学 活性。

在本实施例中，如实施例3所述，使内腔假体形式的可植入医疗器件 肝素化。用实施例12所述的方法(除了加入NaCNBH₃)将醛改性聚乙二醇 (1,000MW)通过不稳定键连接于涂层。重要的是，注意到在醛改性聚乙二 醇的偶联期间未加入还原剂NaCNBH₃。保持非还原状态的伯胺和醛之间形 成的键是不稳定的。然后用DI水冲洗样品15分钟，用硼酸盐缓冲液(10.6g 硼酸，2.7g NaOH和0.7g NaCl溶解于1L DI水，pH 9.0)冲洗20分钟，最 后用DI水冲洗15分钟，然后冻干整个结构，得到结合于ePTFE材料的干 燥肝素和聚乙二醇。然后，如实施例2所述将地塞米松与该组合物非共价 混合。然后，按照实施例5所述将肝素化的内腔假体进行机械压缩、机械 膨胀、冲洗、切割测试、并测定ATIII结合。

如本实施例所述制备的样品的抗凝血酶III结合活性大于5pmol/cm²。