用于液态奶中三聚氰胺现场快速检测的拉曼光谱法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测方法，特别是涉及一种用于液态奶中三聚氰胺现场快速检测的拉曼光谱法及使用的试剂盒。

背景技术

最近相继在市售的婴幼儿配方奶粉和液态奶中检测出含有工业原料三聚氰胺，掺有三聚氰胺的奶粉导致多名婴幼儿发生泌尿系统疾病，并有死亡病例，这对我国的乳制品生产和奶牛养殖业产生了巨大的影响，也使我国的食品监管能力受到了社会的质疑。

在牛奶中掺兑三聚氰胺可以提高牛奶的氮含量，我国现行的奶制品蛋白含量测定中，依然沿用凯氏定氮法，通过牛奶中的氮含量来确定蛋白含量。这就给不法分子以可乘之机，通过添加含氮的廉价工业原料来提高牛奶的氮含量，这样就可在牛奶中大量掺水。消费者的反应、媒体的强烈关注、政府的高度重视都使这起奶粉污染事件成为了当前社会焦点。加强检测、尽早发现问题成为关键，这一突发事件也检验着食品监管部门的能力，如何保障食品安全成为全民共同关注的主要问题。当前，奶及奶制品中“三聚氰胺污染事件”对我国的乳制品生产和奶牛养殖业产生的不良影响是空前的，甚至使我国的食品监管能力受到了社会的质疑。其经济损失也是巨大的，损失范围波及到从原料到制成品、从源头到餐桌的整个链条，损失最大的当属原料乳的收购环节。生鲜奶的保质期仅为4个小时，这意味着，在等待检验的生鲜奶超过4小时后就要倒掉。据我国农业部统计数据表明，目前因无法在现场快速检测三聚氰胺含量而导致每天倒掉的奶多达2000多万吨，损失巨大！

目前，常规检测三聚氰胺的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)和高效液相色谱-质谱-质谱联用技术(HPLC-MS-MS)，虽然这些方法可以进行准确的定性及定量分析，但只能在试验室进行检测，无法应用于奶站收购现场。尽管日前国家批准发布了《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》国家标准，但所需要的液相色谱仪现场化操作条件苛刻(流动相，泵)，操作复杂(未配自动进样器)，耗材成本高(色谱柱昂贵)，分析速度仍然不够理想。

因此，如何实现液态奶中三聚氰胺重复性好、灵敏度高、操作简便、实验成本低、能进行现场、快速检测、易于普及推广，从奶源上解决三聚氰胺检测控制问题，是目前急需解决的关键技术问题。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种重复性好、灵敏度高、操作简便、实验成本低、能进行现场快速检测、易于普及推广的液态奶中三聚氰胺现场快速检测的拉曼光谱法。

本发明的另一个目的是提供一种在此检测方法过程中使用的检测试剂盒。

一种用于液态奶中三聚氰胺现场快速检测的拉曼光谱法，液态奶样品用水或pH＝2～pH＝14的水溶液以1～10倍的稀释比例稀释后，进行离心，吸取离心后中间层的匀质试液于预先加好检测试剂的2mL的检测池中，涡旋或摇振均匀，置检测池于便携式拉曼光谱仪检测室中在250～2300cm^-1的范围内进行拉曼光谱扫描检测获得拉曼光谱图，依据所获得的拉曼光谱图，选用特征频率下三聚氰胺的拉曼光谱信号，以内标信号为基准，采用归一化方法，根据三聚氰胺的拉曼光谱信号的相对强度与三聚氰胺含量的线性比例关系，对液态奶样品中三聚氰胺进行现场快速的定量和定性检测。

本发明的拉曼光谱法，所述水为二次蒸馏水或去离子水；所述pH＝2～pH＝14的水溶液为盐酸或柠檬酸或氢氧化钾或氢氧化钠调制而成。

本发明的拉曼光谱法，所述稀释后的液态奶样品进行离心时，涡旋或摇振0.3～1分钟匀质，取匀质后的试液0.8mL～1.3mL于1.5mL离心管或3mL～4mL于5mL离心管或6mL～8mL于10mL离心管，置于离心机，于1000～16000r/min转速下离心1-5分钟。

本发明的拉曼光谱法，所述检测试剂包括以下用量的试剂：

(1)检测试剂A：银胶体水溶液50～500μL；

(2)检测试剂B：0.5M～5M的可水解出Cl^-1的电介质水溶液100μL；

(3)检测试剂C：0.5M～2M的碱性溶液10～300μL。

其中检测试剂A银胶体水溶液按照公知的方法制备即可；检测试剂B为使银溶胶凝聚含Cl^-1的电介质水溶液，优选为CaCl₂水溶液或MgCl₂水溶液或KCl水溶液或NaCl水溶液。检测试剂C为促使三聚氰胺与银溶胶结合的碱性溶液，优选为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。

本发明的拉曼光谱法，其中所述液态奶样品离心后中间层的匀质试液的加样量为50～300μL。优选100～200μL。

本发明的拉曼光谱法，所述便携式拉曼光谱仪的激光光源发射波长为532nm或785nm。目前，美国光纳科技公司(OptoTrace Technologies，Inc.)、必达泰克公司、常州市莱赛光电技术有限公司可提供满足测试要求的便携式拉曼光谱仪。

一种在所述的拉曼光谱法中使用的检测试剂盒，包括以下试剂：

(1)检测试剂A：银胶体水溶液；

(2)检测试剂B：0.5M～5M的可水解出Cl^-1的电介质水溶液；

(3)检测试剂C：0.5M～2M的碱性溶液10～300μL。

利用本发明时，后期的数据采集及结果分析为：

(1)选定某一特征频率下的拉曼信号峰所对应的强度为内标基准，进行谱图归一化；

(2)用具有背景扣除功能的数据处理软件进行数据处理，获得基线平坦的拉曼图谱，此步骤为基线拉平步骤；

(3)数据库的建立：根据拉曼光谱图中三聚氰胺特征频率处所对应的信号强度进行大量实际样品测定，运用数理统计方法建立不同基质样品拉曼光谱数据库，获得空白样品中相对强度本底值范围和已知三聚氰胺含量样品所对应的相对强度值。

(4)定性分析：根据所建立的数据库，以空白样品中相对强度本底值为参照依据，高于此本地底值范围即为三聚氰胺阳性结果，低于此本地底值范围即为三聚氰胺阴性结果。

(5)定量分析：根据所建立的数据库中已知三聚氰胺含量样品所对应的相对强度值，或根据特征频率处三聚氰胺所对应的相对信号强度与其浓度的线性关系做标准曲线，用该标准曲线可对液态奶中三聚氰胺进行定量分析。

本发明的拉曼光谱法，样品前处理简单，可实现准确的定性和定量分析，实验耗材成本低廉，可进行现场、快速检测、易于普及推广，从而达到对液态奶中三聚氰胺能及时发现和监控管理，克服了目前对化学小分子检测存在的问题。本发明具有操作简便(稀释、离心后即可测试)、灵敏准确(检出限：0.3ppm，测定限：1.0ppm)、重现性良好(定量分析，RSD≤10％)等优势，从样品前处理到出检测结果，单样检测仅需要5～8分钟，单样检测耗材直接成本在10元人民币以内。

附图说明

图1为本发明中便携式拉曼光谱仪的参数设置图；

图2是本发明测定步骤中的扫描图；

图3是本发明结果分析中的谱图归一图；

图4是本发明结果分析中的谱图平滑图；

图5是利用本发明测定的三聚氰胺标准品的拉曼光谱图(标品的浓度是300ppb)；

图6是利用本发明测定的液态奶中三聚氰胺的拉曼光谱图；

图7是三聚氰胺的校准曲线图，是由不同浓度(如0，2，4，6，8ppm)的三聚氰胺标准品加入到空白液态奶后，扫描得到的拉曼光谱图经过以内标信号为基准谱图归一和基线拉平后，对应某位置的强度作图得到的。

具体实施方式

实施例1：

一种用于液态奶中三聚氰胺现场快速检测的拉曼光谱法，包括以下具体的步骤：

1、液态奶稀释：取1mL液态奶于10mL塑料离心管中，加入4mL的水溶液，涡旋0.5分钟，取1mL涡旋好的稀释液于1.5mL离心管中。

2、稀释液离心：置上述装有1.5mL稀释液的离心管于便携式的离心机，于14000r/min转速下离心4分钟。

3、配制检测试剂

(1)检测试剂A：银胶体水溶液；

(2)检测试剂B：1M的CaCl₂水溶液；

(3)检测试剂C：1M的氢氧化钠水溶液；

4、选用激光光源发射波长为785nm的便携式拉曼光谱仪进行检测，其步骤为：

(1)取样：取300μL检测试剂A于2mL的检测池中，加入100μL检测试剂B，加入200μL检测试剂C，小心吸取步骤2中离心匀质液200μL于检测池中；涡旋或摇振0.3～0.5分钟均匀；

(2)仪器参数设置(见图1)：激光能量参数选择200mw，积分时间参数选择20秒，用此两个参数调节最佳拉曼峰强度；

(3)扫描(见图2)：用拉曼光谱仪在250～2300cm^-1的范围内，以8cm^-1的分辨率扫描测试样品；于5分钟内读取或记录或保存拉曼光谱测试结果。连续扫描光谱3次，最后得3次扫描光谱的平均光谱。

5、结果分析

(1)以928cm^-1对应峰的强度为单位100，进行谱图归一化(见图3)；

(2)用数据处理软件获得基线平坦的拉曼图谱(见图4)；

(3)根据拉曼光谱图中700±4cm^-1处对应的信号强度来进行定性定量判定，若相对强度在80以上则判定为样品中三聚氰胺的含量大于等于2ppm，若该处的相对强度低于80则判定为三聚氰胺的含量小于2ppm；若以700±4cm^-1处对应的信号最高强度做标准曲线，可根据标准曲线进行液态奶中三聚氰胺的定量测定。)

图5和图6示出了本发明的方法对三聚氰胺标标准品具有很好的谱图，在特征频率下峰值较高，而对液态奶样品中的三聚氰胺也具有类似的谱图，故而可以采用此拉曼光谱图作为三聚氰胺定性或定量的基准。

图7是三聚氰胺的校准曲线图，由不同浓度(如0，2，4，6，8ppm)的三聚氰胺标准品加入到空白液态奶后，扫描得到的拉曼谱图经过以内标信号为基准谱图归一和基线拉平后，对应某位置的强度作图得到的。

实施例2：

一种用于液态奶中三聚氰胺现场快速检测的拉曼光谱法，包括以下具体的步骤：

1、液态奶稀释：取1mL液态奶于10mL塑料离心管中，加入2mL的pH＝2的盐酸溶液，涡旋0.5分钟，取1mL涡旋好的稀释液于1.5mL离心管中。

2、稀释液离心：置上述装有1.5mL稀释液的离心管于便携式的离心机，于14000r/min转速下离心4分钟。

3、配制检测试剂

(1)检测试剂A：银胶体水溶液；

(2)检测试剂B：0.5M的MgCl₂水溶液；

(3)检测试剂C：0.5M的氢氧化钠水溶液；

4、选用激光光源发射波长为785nm的便携式拉曼光谱仪进行检测，其步骤为：

(1)取样：取50μL检测试剂A于2mL的检测池中，加入100μL检测试剂B，加入10μL检测试剂C，小心吸取步骤2中离心匀质液50μL于检测池中；涡旋或摇振0.3～0.5分钟均匀；

(2)仪器参数设置：激光能量参数选择200mw，积分时间参数选择20秒，用此两个参数调节最佳拉曼峰强度；

(3)扫描：用拉曼光谱仪在250～2300cm^-1的范围内，以8cm^-1的分辨率扫描测试样品；于5分钟内读取或记录或保存拉曼光谱测试结果。连续扫描光谱3次，最后得3次扫描光谱的平均光谱。

其余同实施例1。

实施例3：

一种用于液态奶中三聚氰胺现场快速检测的拉曼光谱法，包括以下具体的步骤：

1、液态奶稀释：取1mL液态奶于10mL塑料离心管中，加入10mL的pH＝10的氢氧化钾溶液，涡旋0.5分钟，取1mL涡旋好的稀释液于1.5mL离心管中。

2、稀释液离心：置上述装有1.5mL稀释液的离心管于便携式的离心机，于14000r/min转速下离心4分钟。

3、配制检测试剂

(1)检测试剂A：银胶体水溶液；

(2)检测试剂B：5M的KCl水溶液；

(3)检测试剂C：2M的氢氧化钾水溶液；

4、选用激光光源发射波长为785nm的便携式拉曼光谱仪进行检测，其步骤为：

(1)取样：取500μL检测试剂A于2mL的检测池中，加入100μL检测试剂B，加入300μL检测试剂C，小心吸取步骤2中离心匀质液300μL于检测池中；涡旋或摇振0.3～0.5分钟均匀；

(2)仪器参数设置：激光能量参数选择200mw，积分时间参数选择20秒，用此两个参数调节最佳拉曼峰强度；

(3)扫描：用拉曼光谱仪在250～2300cm^-1的范围内，以8cm^-1的分辨率扫描测试样品；于5分钟内读取或记录或保存拉曼光谱测试结果。连续扫描光谱3次，最后得3次扫描光谱的平均光谱。

其余同实施例1。

试验例1：

使用本发明实施例1的检测方法，采用美国光纳科技公司(OptoTrace Technologies，Inc.)生产的便携式拉曼光谱仪，对各种市售液态奶样品进行三聚氰胺检测，并用传统的实验室分析方法高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱-质谱联用技术(HPLC-MS-MS)进行对比，分析结果见表1、表2、表3。

表1.纯牛奶中三聚氰胺分析结果对比

表2.酸牛奶分析结果对比

表3.生鲜奶分析结果对比

试验例2：采用本发明实施例1的检测试剂和检测方法，使用必达泰克公司生产的便携式拉曼光谱仪，对生鲜奶盲样进行三聚氰胺检测，与传统的液相色谱-质谱-质谱联用技术(HPLC-MS-MS)检测，分析结果见表4。

表4.生鲜奶盲样分析结果对比

试验例3：使用本发明实施例1的检测试剂和检测方法，采用美国光纳科技公司(OptoTraceTechnologies，Inc.)生产的便携式拉曼光谱仪，参加了科技部会同质检总局、农业部、卫生部等部门联合组织的对生鲜奶中三聚氰胺盲样进行现场定性测试考试，现场公示的分析结果见表5。

表5.生鲜奶盲样现场定性测试考试结果

试验例4：使用本发明实施例1的检测试剂和检测方法，采用美国光纳科技公司(OptoTraceTechnologies，Inc.)生产的便携式拉曼光谱仪，参加了科技部会同质检总局、农业部、卫生部等部门联合组织的对生鲜奶中三聚氰胺盲样进行现场定量测试考试，现场公示的分析结果见表6。

表6.生鲜奶盲样现场定量测试考试结果

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。