利用大豆肽降低总胆固醇水平和LDL胆固醇水平的产品和方法

优选实施方案的一般性描述

本发明通常涉及治疗个体胆固醇相关状态的组合物和方法。更具体来说，本发明涉及提供个体多种健康相关的益处的一类肽以及含有它们的组合物。更具体来说，本发明涉及含有大豆肽的新组合物、利用这些组合物降低个体总胆固醇水平和LDL胆固醇水平的方法以及制备含有它露那辛

露那辛是最近发现的大豆(glycine max)生物活性成分，其具有新的染色质结合特性和对基因表达的后生效应(17，18)。露那辛是子叶特异性的2S清蛋白的小亚基肽。图1表示2S清蛋白(SEQ ID NO.1)和露那辛小亚基(SEQ ID NO.2)。露那辛大豆肽是热稳定的、水溶的，并以显著的量存在于所选择的大豆蛋白制备物中，有关选择用于露那辛的分离或浓缩的大豆和大豆产品来源的重要指导，在文献中提供(19)。

露那辛在本文中被鉴定为具有降胆固醇作用的大豆活性成分。除此以外，也描述了制备和使用露那辛减少胆固醇的组合物和方法。

本发明解决了几个问题，这些问题直到现在才利用大豆产品解决胆固醇减少的难题。以前未鉴定用于减少胆固醇的大豆的活性成分，因而其在大豆产品中不可能被选择。因此，以前为了观察到胆固醇的即便小量的降低，也需要每天食用大量大豆。如今提供了露那辛浓度已提高的大豆组合物，使得剂量更小、功效提高以及治疗效果更一致。

此外，还处理了与向个体提供大量大豆有关的加工和包装问题，并且如今可以获得多种制剂。

研究表明，露那辛通过其RGD细胞粘附基序进入哺乳动物的上皮细胞，优先结合去乙酰化的组蛋白，并抑制组蛋白H3和H4的乙酰化(20)。越来越多的证据表明细胞转化、对荷尔蒙的反应以及饮食和环境作用与基因表达的后生变化有关，该后生变化受到DNA甲基化-去甲基化和组蛋白乙酰化-去乙酰化可逆过程的调控(21，22)。

露那辛是第一个被鉴定为组蛋白乙酰基转移酶抑制剂的天然物质，尽管其不直接影响组蛋白乙酰基转移酶。它通过与组蛋白H3和H4的N末端尾部特定的去乙酰化的赖氨酸残基结合，使它们不能作为组蛋白乙酰化的底物而抑制H3和H4乙酰化(20)。作用机制的阐明使露那辛成为理解发育遗传学和染色质修饰在重要的生物学过程中的新兴作用的研究的重要分子。

在戴维斯的加利福尼亚大学进行的有关露那辛对前列腺致癌作用的研究揭示了露那辛对组蛋白H4的修饰以及对化学预防基因(chemopreventive genes)的上调的作用(23)。然而，尚未研究在生物系统中露那辛与去乙酰化的H3的N末端尾部结合的具体作用，以及对H3组蛋白的乙酰化的抑制作用。

血液中大多数循环的胆固醇都是内部合成的，因此，受HMG-CoA还原酶(胆固醇生化合成的限速酶)催化的胆固醇的内部产生以及肝细胞膜上LDL受体的量，是调控LDL胆固醇水平的重要因素(33)。

为了确定露那辛与去乙酰化的组蛋白H3的结合和乙酰化抑制的具体生物学作用，以固醇调节元件结合蛋白(SREBP)对与胆固醇生物合成有关的基因的诱导作为生物学模型。之所以选择这个生物学模型，是因为SREBPs受固醇损耗的激活，在接近HMG-CoA还原酶(胆固醇生化合成的限速酶)和LDL受体基因的启动子/调节序列的染色质中，通过组蛋白乙酰基转移酶P300/CBP相关因子(PCAF)，导致组蛋白H3而非组蛋白H4乙酰化增加(24)。而且，SREBP激活导致辅调节因子的募集增加，所述募集即环单磷酸腺苷反应元件结合(CREB)到HMG-CoA还原酶基因的启动子/调节序列，以及Sp1到LDL受体基因启动子/调节序列(24)。

我们对体外组蛋白乙酰基转移酶(HAT)分析的研究(描述于下文实施例8中)表明，露那辛显著抑制通过组蛋白乙酰基转移酶PCAF的组蛋白H3的乙酰化。利用HepG2肝细胞的细胞培养实验表明，合成的露那辛在无胆固醇的培养基中可显著地减少HMG-CoA还原酶的表达并增加LDL受体基因的表达(下文的实施例1)，这与他汀(Statin)类的降低胆固醇药物的作用相似。我们的研究还表明，LDL受体表达的增加与Sp1在无胆固醇的培养基中表达的增加一致(下文的实施例2)。

在非意图将本发明限制于任何具体的作用机制或模式的情况下，基于所述实验，提出了分子作用机制，即，露那辛减少激活HMG-CoA还原酶的表达所需的组蛋白乙酰基转移酶PCAF对组蛋白H3的乙酰化，并增加LDL受体的表达。因此，露那辛通过以下方式减少总胆固醇水平和LDL胆固醇水平：1)抑制HMG-CoA还原酶基因的表达，该酶的酶促活性被降低胆固醇的他汀药物降低，以及2)增加LDL受体的表达，这增加了血液中LDL胆固醇的清除。

而且，如实施例所示，露那辛的生物学活性还受到将食用大豆蛋白与较低的LDL胆固醇和较低的心血管病风险联系起来的大规模流行病学和临床数据的支持(3)。将露那辛鉴定为大豆蛋白中赋予大豆蛋白降低胆固醇特性的主要成分，为优化大豆蛋白成分以便最大化其对心脏健康的益处铺平了道路。

以前出版的数据表明，不同大豆品种、大豆蛋白浓缩物以及大豆蛋白分离物的露那辛含量在不同制品之间显著不同(19)。在非意图将本发明限制于任何具体的作用模式或机制的情况下，由该数据来看，露那辛是来自大豆的唯一生物活性剂，其具有可行的分子作用机制，该机制可解释大豆蛋白降低胆固醇的特性(描述于下文的实施例1和2中)。该数据也有助于阐明美国心脏协会科学报告(16)所引用的普遍分歧的临床结果。因为我们目前已经知道，露那辛以不同的量存在于各种大豆蛋白制品中(19)，所以，显然，在以前使用大豆蛋白分离物的研究甚至检测较高浓度大豆蛋白的那些研究中，有关降低固醇作用以及剂量依赖性作用的缺少的不可预测的结果，很可能是由于露那辛量的变化，或由于消化过程中保护露那辛的胰凝乳蛋白酶的缺乏，或由于这两种因素的结合。

我们的这一令人惊讶的发现，即露那辛减少个体的胆固醇以及是大豆的负责降低LDL胆固醇的组分，还受到实验的支持，实验证明，当50％的大豆粉与50％大豆蛋白浓缩物混合时，在临床检测中呈现了LDL胆固醇减少的最高速率(减少20-30％)(26，27)。尽管各种商购来源的露那辛的浓度和生物学活性不同，但在露那辛的不同来源中，大豆蛋白浓缩物在一些实验中已表现出较高产率的生物活性露那辛(参阅实施例4和参考文献(19))。在本发明优选的实施方案中，大豆蛋白浓缩物是用于本发明组合物和方法的露那辛的来源。

在此已指出，在如上文提到的临床试验中所用的大豆蛋白混合物中存在大豆粉，可在其被摄取时为露那辛提供免遭消化和降解的保护(实施例5)。也显示，与大豆粉混合的富集露那辛的种子提取物的部分消化，增加露那辛的生物活性(实施例6)。

下文表明，大豆粉保护含有露那辛的组合物的生物学活性免遭由于消化作用的生物学活性的降低。我们也发现，大豆粉(34)中发现的胰蛋白酶抑制剂特别是胰凝乳蛋白酶抑制剂，使含有露那辛的组合物的生物学活性免遭消化副作用的危害。在非意图将本发明限制于任何作用机制或模式的情况下，据信，在上文提到的临床研究中，大豆粉中内源性胰凝乳蛋白酶抑制剂的存在，已执行保护露那辛免遭消化，并使露那辛肽在参与研究的那些个体的肝和血液中更具生物利用率，由此提供了LDL胆固醇减少的最高速率。

大豆蛋白降低胆固醇的作用，可通过研发制剂进一步提高，该制剂优化露那辛的适当吸附和向肝递送，这是实现个体明显较低的血浆LDL胆固醇水平所需的。本发明优选的实施方案包括，含有露那辛结合大豆粉或胰凝乳蛋白酶或两者的组合的组合物，使用以及制备此类组合物的方法。

露那辛是子叶特异性的2S清蛋白的小亚基肽。图1表示2S清蛋白(SEQ.ID.NO.1)和露那辛小亚基(SEQ.ID.NO.2)。露那辛已表明，露那辛基因在哺乳动物细胞中的组成型表达干扰动粒的形成并中断有丝分裂，导致细胞死亡(18)。当外源性地应用于哺乳动物细胞培养物中时，露那辛肽抑制正常细胞向癌灶的转化，所述癌灶受化学致癌物质和致癌基因的诱导。为了阐述其化学预防作用机制，我们已经表明露那辛(a)通过其RGD细胞粘附基序内在化，(b)在前中期与端粒上低乙酰化的染色质共定位，(c)与去乙酰化的组蛋白H4优先结合，其可通过发现于其他染色质结合蛋白上的结构上保守的螺旋基序的存在来促进，(d)抑制组氨酸H3和H4的乙酰化，以及(e)在E1A转染的细胞中诱导细胞凋亡。基于这些结果，提出了新的化学预防机制，其中露那辛进入细胞核，与去乙酰化的组蛋白结合，防止它们乙酰化，并抑制如受Rb肿瘤抑制子和h-ras致癌基因调控的那些的基因表达。

微阵列实验证明利用露那辛的从最小至无的负面遗传变化。为了确定与露那辛治疗有关的基因变化，利用微阵列分析，评估了用合成的露那辛处理的非致瘤前列腺细胞(RWPE-1)和致瘤前列腺细胞(RWPE-2)的基因表达谱。结果表明，在询问的14500个基因中，123个基因在暴露于2μM露那辛下24小时的细胞中的表达具有超过2倍的变化(23)。在这些基因中，121个基因在RWPE-1细胞中被上调，而仅2个基因在RWPE-2细胞中被上调。没有基因在用2μM露那辛处理的非致瘤上皮细胞或致瘤上皮细胞中被下调。在RWPE-1细胞中被上调的基因包括与预防癌症形成如肿瘤抑制、促细胞凋亡、有丝分裂检验点以及细胞分裂的调控有关的基因(23)。

我们实验的微阵列结果还提示，露那辛可以充当使正常细胞免遭转化的基因的转录激活剂。这些发现与以前的机制模型相反，以前的机制模型认为露那辛通过抑制去乙酰化的组蛋白H4的乙酰化，来防止正常细胞转化成肿瘤(20)。据认为，阻抑这些组蛋白的乙酰化导致染色质凝聚和致癌基因的转录沉默，即便在肿瘤抑制剂如Rb(视网膜母细胞瘤蛋白)缺少或失活的情况下。然而，在最近的研究中，经E1A致癌基因转染的从国立卫生研究院获得的露那辛处理的小鼠成纤维细胞3T3细胞(NIH3T3细胞)(预处理24小时)，在E1A转染8天后，表现出p21/WAF1/Cipi蛋白水平增加5倍(28)。p21/WAF1/Cipi蛋白是细胞周期蛋白依赖性激酶的有效且通用的抑制剂，所述细胞周期蛋白依赖性激酶是细胞周期进程的主要调控点(29)。微阵列的结果没有表现出在24小时内的p21/WAF1/Cipi的上调；然而，基因SP3(其是p21/WAF1/Cip的转录激活剂(30))在24小时受到露那辛的上调，这可解释在NIH3T3细胞中p21/WAF1/Cipi表达的稍后增加。

另外，微阵列的结果有助于解释，当用露那辛预处理的C3H/T101/2细胞暴露于化学致癌物二甲基苯并蒽(Dimethylbenzanthracene，DMBA)和MCA下时所观察到的病灶形成减少70％(20)。在持续6周的化学致癌分析中，将这些细胞暴露于仅仅125nM露那辛单次24小时，就足以抑制病灶的形成。据信，用露那辛预处理C3H/T101/2细胞24小时，可上调化学预防基因的表达，所述基因使细胞免遭DMBA和MCA诱导的转化。

对正常的前列腺细胞中受露那辛上调的121种基因的生物信息学分析表明，超过25％的基因位于距CpG岛0-2000bp处(10个核心小体的距离)，这由于基因组中基因的随机分布而高度显著。露那辛使致瘤前列腺细胞系(RWPE-2)中这些化学预防基因上调丧失，可能是归因于CpG岛胞嘧啶甲基化的提高和染色质的低乙酰化，而这是致癌作用的特征。

筛选分析

本发明还提供了体外分析，其可用于筛选作为可用于本发明方法中的生物活性材料的露那辛或露那辛类似物、片段或变体的潜在来源。在本发明的一个实施方案中，使用PCAF组蛋白乙酰基转移酶，在存在或不存在露那辛的情况下，用从HeLa细胞和鸡红细胞的酸提取的蛋白中纯化的核心组蛋白以及重组组蛋白H3(可从Upstate/Millipore购买)，作为组蛋白乙酰基转移酶(HAT)反应的模板。在本发明优选的实施方案中，露那辛、露那辛类似物、片段或变体的潜在来源的筛选按如下进行：在将溶液加入1×HAT反应混合物、1μM乙酰基CoA和5μLPCAF(根据Upstate/Millipore推荐的浓度)之前，将核心组蛋白模板和露那辛样品(10:1w/w)在冰上孵育5分钟，并在25℃下孵育10分钟。将混合物在30℃孵育1小时，同时250rpm振荡。加入具有β-巯基乙醇的Laemmli终止缓冲液，煮沸5分钟，并在冰上淬火15分钟，使反应终止。将PCAF HAT反应产物在16％的SDS-PAGE上运行，印迹至硝酸纤维膜，并用针对二乙酰化的组蛋白H3(Ac-Lys13+Ac-Lys14H3)和/或Ac-Lys14组蛋白H3而产生的一抗、随后用HRP-结合的二抗进行免疫染色。利用标准的化学发光试剂将来自抗体复合物的化学发光信号直观化，并在Kodak BioMax胶片上曝光、洗印、并利用来自Silk Scientific(Orem，Utah)的数码扫描仪和UN-SCAN-IT软件程序进行斑点密度计测量。

这种体外HAT分析可用于测定从不同来源获得的露那辛的生物学活性(参见实施例5和6)，而无需采用耗时且昂贵的细胞培养和/或动物实验。SREBP转录激活剂激活HMG-CoA还原酶基因的表达，这需要组蛋白H3的乙酰化(24)，且露那辛抑制组蛋白H3乙酰化的能力使HMG-CoA还原酶的表达减少，相应地肝中胆固醇的生物合成减少。

露那辛的来源

可在大豆种子和商购的大豆蛋白来源(19)中发现显著量的天然存在的露那辛，其类似物可来自诸如大麦(35)和小麦(36)的其它种子来源。由于露那辛在种子发育的DNA核内复制阶段的生物学作用，预料也可在其他产种子植物(被子植物)的胚乳和子叶中发现露那辛和其类似物。

本发明的多肽可以以本领域熟知的许多方式获得。例如，在非意图将本发明的范围限制于获得本发明多肽的任何特定方法的情况下，露那辛和其类似物、变体以及片段可利用商业上的自动化程序化学合成，该自动化程序包括但不限于常规的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学。多肽纯化的方法在本领域内也是熟知的，包括但不限于，阳离子和阴离子交换层析、免疫亲和层析和尺寸排阻层析。出于一些目的，优选在重组系统中产生多肽。

蛋白片段可以以数种方式产生，例如，通过重组的方式、蛋白水解消化或通过化学合成。多肽的内部片段或末端片段可通过从编码该多肽的核酸的一端(对于末端片段而言)或两端(对于内部片段而言)移除一个或多个核苷酸来产生。诱变处理的DNA的表达产生多肽片段。用“末端轻咬”核酸内切酶(＂end-nibbling＂endonucleases)消化可因此产生编码一列片段的DNA’s。编码蛋白片段的DNA’s也可通过随机切割、限制消化或上述方法的组合产生。

利用本领域已知的技术如常规的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学，也可化学合成片段。例如，本发明的肽可任意地分成所需长度的、无片段重叠的片段，或分成所需长度的重叠片段。

蛋白氨基酸序列的变体可通过编码蛋白或蛋白的特定结构域或区域的DNA的随机诱变制备。可用的方法包括PCR诱变和饱和诱变。随机氨基酸序列变体的文库，也可通过合成一组简并寡核苷酸序列产生。(筛选变体文库中蛋白的方法在本发明的其他地方)。

筛选露那辛肽类似物、片段和变体：露那辛肽、其类似物、片段和变体的存在和数量，可通过用针对露那辛肽的生物活性羧基末端而产生的露那辛抗体进行免疫染色Western印迹来确定(参阅实施例3)。露那辛肽、其类似物、片段和变体的生物活性可以通过进行实施例4和实施例8所述的体外HAT分析，来确定或定量分析。

露那辛的天然来源

露那辛是在自然界中发现的，并可从大豆种子以及商购的大豆蛋白来源中获得(19)，其类似物来自如大麦(35)和小麦(36)的其他种子来源。例如，在非意图限制于获得露那辛的任何方法的情况下，露那辛可从下列大豆来源中提取：片状或粉状形式的大豆粉、大豆蛋白浓缩物以及大豆蛋白分离物(参见实施例3)。

大豆片通常通过使大豆脱壳、脱脂和碾磨产生，并且其在脱湿的情况下通常含有少于约65％(重量计)的大豆蛋白。大豆片也含有可溶碳水化合物、诸如大豆纤维的不可溶碳水化合物以及大豆中固有的脂肪。大豆片可脱脂，如通过用己烷提取。大豆粉、大豆细粒、大豆粗粉可通过在如锤式粉碎机、或空气喷射粉碎机的碾磨和研磨设备中将大豆片粉碎成所需的颗粒大小，而由大豆片产生。粉碎的材料通常用干热进行热处理，或用湿热蒸，以便“烘烤”碾磨的片并使存在于大豆中的抗营养元素失活，所述抗营养元素包括Bowman-Birk和Kunitz胰蛋白酶抑制剂和其他的蛋白酶抑制剂。

在本发明的一个实施方案中，不在破坏蛋白酶抑制剂活性的条件下进行烘烤。在本发明优选的实施方案中，不在足以破坏胰凝乳蛋白酶抑制剂的活性的烘烤热度或持续时间下进行烘烤。避免在存在显著量水的情况下热处理碾磨的片，以防止材料中大豆蛋白的变性以及避免与大豆材料中水分的增加和除去有关的费用。所得的经碾磨、热处理的材料是大豆粉、大豆细粒或大豆粗粉，这取决于材料的平均微粒大小。大豆粉的颗粒尺寸通常小于约150.mu.m。大豆细粒的颗粒尺寸通常是约150.mu.m至约1000.mu.m。大豆粗粉的颗粒尺寸通常是大于约1000.mu.m。

大豆蛋白浓缩物通常在脱湿的情况下含有约65％(重量计)至小于约90％(重量计)的大豆蛋白，所具有的主要的非蛋白组分是纤维。大豆蛋白浓缩物通常由脱脂大豆片通过用含水酒精溶液或酸性含水溶液洗涤所述片以便将可溶的碳水化合物从蛋白和纤维中除去而形成。

大豆蛋白分离物，也称为分离的大豆蛋白，其是更高度精炼的大豆蛋白材料，经处理在脱湿的情况下含有至少约90％(重量计)的大豆蛋白，并且含很少或不含可溶的碳水化合物或纤维。分离的大豆蛋白通常通过用碱性含水提取剂从脱脂的大豆片或大豆粉中提取大豆蛋白和水溶性碳水化合物而形成。将含水提取物以及可溶蛋白和可溶碳水化合物从不溶于提取物的材料(主要是纤维)中分离。随后通常用酸处理提取物，将提取物的pH调整为蛋白的等电点，从而使蛋白从提取物中沉淀。将沉淀的蛋白从保留了可溶碳水化合物的提取物中分离，并在任选的pH调整步骤后干燥。

露那辛的提取和富集露那辛的组合物的来源。

露那辛和富集露那辛的组合物可从大豆蛋白低分子量清蛋白组分以及大豆中发现的天然蛋白酶抑制剂中获得(37，38)。大豆蛋白酶抑制剂的提取程序也可用于提取露那辛和获得富集露那辛的组合物。

本领域有已知的提取大豆蛋白酶抑制剂的方法。例如参阅Konwinski等的美国专利第7,235,269号；Kennedy等的美国专利第4793996号、第5,217,717号、第5,505,946号；Konwinski等于2003年4月3日提交的美国专利申请第2003/0064，121号；Singe的美国专利第7,235,269号，在此将它们的全部内容通过引用并入。然而以前的提取大豆蛋白酶抑制剂的方法并未专注于优化露那辛的产量。可通过在进行提取前在先筛选用于露那辛提取和用于露那辛浓缩的起始材料来源，获得本发明组合物的改善的生物学活性。在本发明优选的方法中，在用于本发明的方法前，筛选露那辛的潜在来源以确定露那辛的浓度。

获得富集露那辛的组合物的方法的下面的另外实例并非意图将本发明限制于提取露那辛的任何特定方法。脱脂大豆粉可用60％乙醇提取，用冷丙酮沉淀，随后进行多步骤的柱层析。蛋白酶抑制剂(以及其他的蛋白)在60％的乙醇中是可溶的。随后用冷丙酮沉淀蛋白酶抑制剂，离心、并再溶解于水中，获得用于进一步纯化的粗提物(37)。Odani等(38)用此方法的改良版本分离大豆提取物，作为在CM纤维素和DEAE纤维素层析上进一步纯化的起始材料。在这种方法中，在加入2体积冷丙酮前，用60％的乙醇(4:1)室温下(RT)提取脱脂大豆粉，将沉淀再溶解于水中，用蒸馏水透析，在用5mM、pH4.0的醋酸钠进一步透析前，将pH调整为4.0。

获得富集的露那辛的另一种方式是通过提取大豆蛋白的低分子量组分(39，40)。在这种方法中，利用缓冲的高盐溶剂(0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.5，0.5M NaCl，1mM PMSF，5mM DTT)，从大豆粉中提取总蛋白。通过用蒸馏水透析，大豆清蛋白保留于溶液中，因为它们是水溶性的而不溶于水的球蛋白被沉淀出来。将清蛋白溶液冷冻干燥并以最小体积再溶解，以获得清蛋白浓缩物，该浓缩物含有显著量的露那辛肽。

低分子量清蛋白和富集蛋白酶抑制剂的大豆提取物的进一步露那辛纯化，可通过阴离子交换或分子排阻层析以及免疫亲和层析实现。阴离子交换树脂的实例：DEAE-交联葡聚糖、QAE-交联葡聚糖、DEAE-琼脂糖、QAE-琼脂糖、DEAE-sephacel、DEAE-纤维素以及QAE-纤维素。分子排阻树脂的实例：交联葡聚糖G-25(分离1-5kDa的肽)、交联葡聚糖G-50(分离1.5-30kDa的蛋白)。利用露那辛抗体可制备免疫亲和柱，以捕获大豆蛋白组分中的露那辛肽。

对于下文的实施例3和实施例4而言，按如下获得富集露那辛的种子提取物：将在本文所述的另一个实验中发现的含有生物学活性露那辛的大豆蛋白浓缩物用作使用0.1×PBS的一步缓冲液提取法的起始材料，随后离心，分离上清液。向上清液加入约2体积的丙酮，在真空干燥前，用袋式过滤器通过离心分离沉淀，以获得富集露那辛的种子提取物。在本发明的某些实施方案中，代替丙酮沉淀而对此方法所做的改变是，缓冲液提取后，通过真空加热至75℃，将上清液浓缩至最多原体积的1/10，随后冷冻干燥获得富集露那辛的种子提取物的粉末形式。

施用

组合物可利用许多不同的途径施用，包括口服施用、局部施用、透皮施用或直接注射于体内。用于本发明实践的组合物的施用，可以是全身的(即经由任何上述途径从总体上施用受试者)或局部的(即经由任何上述途径，施用受试者特定疾病或病理状态的具体部位)。

本发明的方法、试剂盒和组合物也可以与另一种组合物或治疗以“组合疗法”使用，所述另一种组合物或治疗已显示治疗或预防与胆固醇或脂质水平升高有关的或源于胆固醇或脂质水平升高的病症，如他汀(如洛伐他汀(Lovastatin))、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、抗心律失常剂、降胆固醇药物、利尿剂、多巴胺受体激动剂、多巴胺受体拮抗剂或血管扩张剂，它们通常经施用以治疗、预防或最小化与此病症有关的症状和并发症。这些药物具有某些和它们的用途相关的劣势，当与本发明的组合物组合施用时，其中的一些劣势可通过减少获得治疗效果所需的剂量而得到改善。

剂量给药

在本发明一个示例性的实施方案中，提供了含有有效量露那辛肽的产品，该产品降低食用了该产品的个体的胆固醇水平。应当理解，露那辛的有效量至少部分取决于食用了组合物的个体的个头、体重、健康状况和所期望的目标。因此认为，在至少一个实施方案中，向个体提供的露那辛的有效量是每日25mg/kg至100mg/kg。

可基于本发明的教导，以各种剂量施用本发明的组合物，以提供有效治疗浓度，这取决于有关的单个受试者的特定需要。诸如所选择的组合物的活性、受试者的生理特性、受试者的疾病或病理状态的程度或性质的因素，以及施用方法，决定哪些构成所选择的组合物的有效量。通常，改良初始剂量，以确定特定受试者治疗的最佳剂量。可以通过考虑任何或所有诸如如下所述的因素，选择适宜的剂量：人或个体的个头、体重、健康状态、年龄和性别、患者的期望目标、病理状态(为此而施用组合物)的严重性、治疗反应、可能与组合物相互作用(或使组合物增效，或使其受到抑制)的给予患者的其他药物的类型和量以及诸如肝、肾功能的其他药物动力学考虑因素。这些考虑因素在本领域内是熟知的，并描述于标准的教科书中。

可利用具有本领域普通技术的药理学家和临床医师所知的方法，来确定本发明任何实施方案的治疗有效量。例如，可以通过施用量逐渐增加的本发明的组合物直到接受治疗的患者表现出胆固醇、总胆固醇、LDL胆固醇或脂质水平减少的时间，来主观地确定有效量。利用常规生物学和化学分析，可确定组合物、胆固醇和脂质水平的血液水平，并且可将这些血液水平与施用途径匹配。随后可以用血液水平和产生最为需要的水平的胆固醇减少的施用途径，建立用于治疗的药物组合物的“有效量”。

这种与施用途径并行的滴定组合物的相同方法可用于确定用于治疗本文所述的任何和所有病症的本发明组合物的治疗有效量。另外，下文所述的动物模型可用于确定特定疾病或病理状态的可适用剂量。通常，来自最初体外或体内检测的剂量-作用关系，可提供有关受试者施用的正确剂量的指导。

在本发明的一个涉及减少或控制胆固醇、LDL胆固醇或脂质水平或胆固醇或LDL胆固醇的合成的实施方案中，本发明的方法和组合物包括，一剂含有露那辛或露那辛的功能等价变体、类似物或片段的组合物，所述组合物的量为约5ng至约1000g或约100ng至约600mg或约1mg至约500mg或约20mg至约400mg。出于说明目的，本发明组合物的剂量单位可以通常含有例如但不限于约5ng、50ng、100ng、500ng、1mg、10mg、20mg、40mg、80mg、100mg、125mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、5g、10g、20g、30g或40g的本发明的组合物。在本发明某些优选的实施方案中，本发明的组合物含有约2.5-100mg、优选5-50mg、更优选约25mg的露那辛、或露那辛片段、变体和类似物。

根据本发明教导，露那辛、或其片段、变体和类似物的示例性剂量的范围，对于平均体重为60kg的人和其他个体而言，为0.0001mg至200mg、优选2.5mg至100mg、更优选25mg至50mg，尽管也认为可选剂量位于本发明范围内。在用于局部施用的组合物和方法的本发明某些优选实施方案中，露那辛或其片段、变体和类似物的存在水平为25μg/ml至25mg/ml，更优选50μg/ml至1mg/ml，更优选100μg/ml至500μg/ml，甚至更优选约250μg/ml。在用于口服的组合物和方法的本发明某些优选实施方案中，提供给个体的露那辛或其片段、变体和类似物的水平为0.01mg/Kg至100mg/Kg个体体重，优选0.05mg/Kg至50mg/Kg，更优选0.5mg/Kg至2.5mg/Kg，甚至更优选0.2mg/Kg至1.5mg/Kg。

剂量可以以每天1到约4次的剂量施用，或以引起治疗性作用的每天多次剂量施用。可以选择剂型，以适应期望的用于实现指定剂量的施用频率和递送途径。

基于例如进入血清的药剂的吸收速率、药剂的生物利用率以及调节HMG-CoA还原酶和/或LDL受体的表达或作用的功效，和通过监控总胆固醇和LDL胆固醇的减少，以实验的方式确定引起治疗性作用所需的治疗剂的量。这些参数的确定属于本领域的现有技术。

制剂

本发明也涉及含有本发明组合物的制剂。本发明的产品和组合物可单独使用或用于个体食用的食品、粉剂、食品块、胶囊、混合饮料和其他熟知的产品中。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物是与适宜食用的赋形剂、稀释剂、载体一起，或与食品一起。在本发明优选的实施方案中，制剂是采用药丸、片剂、胶囊、粉剂、压成块的加工食品形式或类似的剂型。

制剂可以是多种形式的，如营养补充剂、药物制剂、维生素补充剂、食品添加剂或补充了本发明指定组合物的食品，固体制剂或液体制剂，所述固体制剂或液体制剂包括饮料、无菌可注射溶液、片剂、有包衣的片剂、胶囊、粉剂、滴剂、悬浮液或糖浆、药膏、洗剂、乳质贴剂、凝胶等。

制剂可以以便利的剂型进行包装，也可包括其他的活性成分，和/或可以含有常规赋形剂、药用可接受载体和稀释剂。草药方案和治疗中包括本发明的组合物，也是本发明的优选部分。

对于药用和美容用途而言，用于本发明组合物局部应用的优选制剂，通常使用适宜局部应用的赋形剂。尽管在所需表面释放限定量的活性成分的受控制剂也是需要的，但局部制剂通常是凝胶、软膏、粉剂或液体。制剂可以含有增强活性部分穿过表皮的渗透性的材料。此类渗透剂包括例如DMSO、各种胆汁盐、非毒性表面活性剂等。美容/药物组合物的标准成分在本领域内是熟知的；医药品局部应用的制剂可见于Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物学)，latest edition(最新版)，MackPublishing Co.，Easton，Pa.中，在此将其以引用的方式并入。美容剂型变化繁多，并且对从业者而言是熟知的。

在本发明一个优选的实施方案中，也考虑了用于活性成分局部使用的组合物，不论其用于严格美容或药用/美容目的。

本发明的一些实施方案包括治疗一种或多种下列疾病或状态的方法：胆固醇、总胆固醇、LDL胆固醇或脂质水平升高，癌性肿瘤，与高血脂有关的任何疾病，其包括但不限于动脉粥样硬化、高血压、肥胖症、糖尿病和肾病，包括根据本发明的方法，用含有生物学活性水平的露那辛或其功能等价片段、变体或类似物的组合物治疗遭受一种上述疾病或状态的患者。本发明另一个实施方案包括这样一种方法，即该方法包括根据本发明的方法，用生物学活性水平的露那辛或其功能等价片段、变体或类似物治疗期望维持特定水平的胆固醇、总胆固醇、LDL胆固醇或脂质的个体。

尽管本发明材料的主要用途是用于人类，但也有需要治疗是针对家畜或牲畜或实验动物的例子。事实上，本发明的一方面是利用实验动物证实本发明组合物的安全性和功效。因此，供人类使用的产品也可应用于实验室动物如大鼠、小鼠或兔，以证实单个制备物减少或控制胆固醇水平的能力并确保单个制备物是无毒的。恰如所述的，在质量控制背景下本发明材料的用途，是本发明的一部分。

保持或增强露那辛生物学活性的方法

在本发明另一个示例性的实施方案中，提供了含有有效量露那辛肽或露那辛肽衍生物和含有一种或多种蛋白酶抑制剂的组合物的组合物，所述一种或多种蛋白酶抑制剂一起降低食用了组合物的个体的胆固醇水平。

蛋白酶抑制剂的作用是保护露那辛免遭消化，据此促进吸收并递送至合适的靶区域。适当的蛋白酶抑制剂的实例包括但不限于，胰酶制剂、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制剂。应当理解，本发明的范围包括，与已知或认为促进露那辛在个体中吸收或递送的任何其他组合物或产品一起使用露那辛和露那辛片段、类似物或变体。

仍然在本发明另一个示例性的实施方案中，提供了降低或减少个体胆固醇水平的方法。该方法包括向个体提供含有有效量露那辛肽的产品，并要求该产品降低、减少或维持食用了组合物的个体的胆固醇、总胆固醇、LDL胆固醇或脂质水平。应当理解，本发明包括以多种方式要求该产品降低、减少或维持食用了该组合物的个体的胆固醇、总胆固醇、LDL胆固醇或脂质水平，所述方式包括但不限于通过建议或通过书面、口头或电子方式明确表述。

在本发明至少一个实施方案的一方面，露那辛肽是从大豆中获得的。在本发明至少一个实施方案的另一方面，露那辛肽是从其他产种子植物或从大豆和其他产种子植物的组合中获得的。含有充足量露那辛的产种子植物在本领域内是熟知的。

仍然在本发明至少一个实施方案的另一方面，露那辛肽或露那辛肽衍生物是利用重组DNA技术通过产生、提取和纯化露那辛肽或露那辛肽衍生物或另外获得分离的露那辛肽而获得的。仍然在本发明至少一个实施方案的另一方面，露那辛肽或露那辛肽衍生物通过产生合成的多肽而获得。这些获得露那辛的方法在本领域内是熟知的。

露那辛的部分消化

本发明令人惊讶的发现是，露那辛的部分消化不是减少或破坏了露那辛的生物学活性，而实际上可以提高或增加了露那辛的生物学活性(参见图8和下文的实施例6)。因此，本发明优选的实施方案包括部分消化的生物学活性露那辛肽。

与大豆粉混合的富集露那辛的大豆蛋白(LeSC+SF)通过胰酶制剂消化酶的部分消化，增加了露那辛肽的生物活性(图8)。这在制备局部应用的富集露那辛的种子提取物中具有实际应用。

已经证明，当利用乙醇作为递送系统局部应用时，合成的露那辛表现减少小鼠皮肤肿瘤的形成(20)。通过以具有适当赋形剂的局部制剂使用部分消化的生物学活性露那辛，增加露那辛的应用功效是可能的，所述功效如减少皮肤肿瘤和癌症的形成、光化性角化病、酒渣样斑、老年斑和晒斑以及其他与异常细胞分裂和增殖有关的皮肤病。这种制剂也可以用于露那辛肽的局部递送，以减少胆固醇水平并治疗其他胆固醇相关的疾病，如动脉粥样硬化、高血压、肥胖症和糖尿病，但不限于此。

已表明大豆粉的存在在消化过程中保护露那辛的生物学活性(参见实施例5)。在非意图将本发明限制于任何特定的作用机制或模式的情况下，认为消化过程中大豆粉的存在保护露那辛免遭完全消化，而允许增加露那辛生物学活性的部分消化。

本发明的一个实施方案是部分消化的露那辛肽、其片段、变体或类似物。本发明优选的实施方案是与大豆粉组合的部分消化的露那辛肽、其片段、变体或类似物。本发明另一个优选的实施方案是适于局部应用制剂的部分消化的露那辛肽、其片段、变体或类似物。本发明另一个优选的实施方案是治疗皮肤病症的方法，包括向需要此类治疗的患者应用部分消化的露那辛肽、其类似物、变体或片段。

应当理解，上述讨论、实施方案和实施例仅介绍某些优选实施方案的详细描述。显然，对本领域技术人员而言，在未偏离本发明的精神和范围的情况下，可做各种修饰和等同。

为了更好的说明本发明，提供下列非限制性实施例。所述实施例并非是用来限制本发明的范围，并且也不应该如此理解。根据本发明的这些反应方案和组合物的结构，其他程序和调整对本领域技术人员而言是显然的。认为此类程序位于本发明的范围内。除非另有说明，量指重量份或重量百分比。在此将所有引用的专利和出版物通过引用的方式并入。

实施例

为了证明和进一步说明本发明某些优选的实施方案和方面，提供了下列实施例，且它们不应该解释为限制本发明的范围。

实施例1

证明露那辛降低LDL和总胆固醇水平的实验

他汀药物降低血清胆固醇是通过竞争性地抑制HMG-CoA还原酶实现的，该酶是体内胆固醇合成代谢途径的限速酶。通过减少内源性胆固醇合成，他汀也使肝细胞上调LDL受体的表达，导致低密度脂蛋白(LDL)从血流中的清除增加(25)。1985年，Michael Brown和Joseph Goldstein由于澄清了这种LDL-降低机制，而获得诺贝尔医学奖。

HMG-CoA还原酶和LDL受体的转录调节受固醇调节元件结合蛋白(SREBP)1和2的调控。这种蛋白与位于该还原酶和LDL受体基因5’端的固醇调节元件(sterol regulatory element，SRE)结合。当SREBP无活性时，其与ER或核膜结合。当胆固醇水平下降时，SREBP通过蛋白水平从膜中释放，并迁移至细胞核内，在那儿，其与SRE结合，上调HMG-CoA还原酶和LDL受体的转录(24，25)。

在HepG2肝细胞的细胞培养物中，通过除去生长培养基中的胆固醇，激活SREBP和增加HMG-CoA还原酶和LDL受体的表达是可能的。这可通过将细胞暴露于无血清的培养基中24小时实现(31，32)。

为了评估露那辛对HMG-CoA还原酶表达和LDL受体表达的作用，进行下列相关的实验。

在第一个实验中，在用无胆固醇的培养基替代生长培养基以激活SREBP之前，在具有10％ FBS的DMEM中，用或不用10μM的合成露那辛处理HepG2细胞(1×10⁶)24小时。24小时后，提取总蛋白，将10μg蛋白上样于10％ Tris-甘氨酸凝胶上，电印迹至硝酸纤维膜，并用针对HMG-CoA还原酶和肌动蛋白而产生的一抗进行免疫染色(以显示相同的蛋白上样)。通过数码扫描和Un-Scan It软件获得斑点密度计值，并呈现三个单独实验数据的平均偏差和标准偏差。结果显示于图2中。

在第二个实验中，在用无胆固醇的培养基替代生长培养基以激活SREBP之前，在具有10％ FBS的DMEM中，用或不用10μM的合成露那辛处理HepG2细胞(1×10⁶)24小时。24小时后，提取总蛋白，将10μg蛋白上样于10％ Tris-甘氨酸凝胶上，电印迹至硝酸纤维膜，并用针对LDL受体和肌动蛋白而产生的一抗进行免疫染色(为了显示相同的蛋白上样)。通过数码扫描和Un-Scan It软件获得斑点密度计值，并呈现三个单独实验数据的平均偏差和标准偏差。结果显示于图3中。

图2和图3表示使HepG2细胞在无胆固醇的培养基中生长24小时时，HMG-CoA还原酶(增加98％)和LDL受体(增加34％)的上调。然而，当将露那辛加入无胆固醇的培养基中时，HMG-CoA还原酶的表达降低了大于50％(图2)，而LDL受体的表达增加了大于60％(图3)。

露那辛的这种作用与他汀药物相似，该药剂通过抑制HMG-CoA还原酶的活性减少内源性胆固醇的合成，这导致LDL受体表达增加。并非意图将本发明限制于任何精确的作用机制或模式，认为露那辛的作用模式与他汀药剂的不同之处在于，露那辛看起来是在转录水平抑制HMG-CoA还原酶的表达，而不是抑制其酶活性。和他汀药物一样，露那辛上调LDL受体基因的表达。再次，尽管意图不将本发明限制于任何精确的作用机制或模式，但露那辛对这两种SREBP调控基因的相反作用可通过将不同的辅调节转录因子选择性募集到两个单独的胆固醇调节启动子/调节序列上而得以解释。

实施例2

露那辛对Sp1辅激活物表达的作用

与HMG-CoA还原酶不同，经由固醇损耗的LDL-受体的SREBP激活需要Sp1辅激活剂向邻近LDL受体基因的启动子/调节序列中SREBP的位点的募集增加(25)。如图3所示，在无胆固醇的培养基中，LDL受体被露那辛(LS)上调，这可归因于利用率的增加以及Sp1辅激活剂向LDL-受体启动子/调节序列募集的增加。为了检测这种假说，按如下，利用Sp1抗体，通过Western分析，在露那辛处理的生长培养基和无胆固醇的培养基中确定Sp1的水平：在用新鲜的培养基或无胆固醇培养基替代生长培养基(以激活SREBP)之前，使HepG2细胞(1×10⁶)自汇合生长在具有10％FBS的DMEM中24小时，并用或不用10μM合成露那辛处理。24小时后，从每次处理中提取总蛋白，并将10μg蛋白上样于10％ Tris-甘氨酸凝胶上，电印迹至硝酸纤维膜，并用针对Sp1和肌动蛋白而产生的一抗进行免疫染色(以显示相同的蛋白上样)。通过数码扫描和Un-Scan It软件获得斑点密度计值，并呈现一个实验的数据。结果显示于图4中。

图4表示在对照和露那辛处理的生长培养基中Sp1的水平无明显不同。然而，与生长培养基相比，在无胆固醇的培养基中Sp1水平增加了23％。向无胆固醇的培养基中加入露那辛，将Sp1的水平进一步增加了几乎60％，这紧密地反应了露那辛处理的无胆固醇培养基中LDL受体水平的增加。

来自这些实验的数据表明，在固醇被消耗的培养基中，露那辛增加LDL受体的表达，这可归因于Sp1转录辅激活剂利用率的增加。露那辛抑制HMG-CoA还原酶的表达降低了保持SREBP激活的胞内胆固醇水平，导致LDL受体表达的上调。因此，所述数据表明，露那辛抑制HMG-CoA还原酶即体内胆固醇合成代谢途径的限速酶的表达，同时增加LDL受体的表达，导致低密度脂蛋白(LDL)从血流中的清除增加，因此，降低了个体总胆固醇和LDL胆固醇。

与来自人饮食中肠摄取的200-300mg/日相比，个体中大多数循环的胆固醇是在体内合成的，平均为1000mg/日。因此，通过HMG-CoA还原酶和肝细胞膜中LDL受体的量催化的胆固醇的内部产生，在个体胆固醇水平的调控中是唯一最重要的因素。因此，这些实验证明，有效量的露那辛既减少了个体的LDL胆固醇水平又减少了个体的总胆固醇水平。

实施例3

可从商业来源的大豆蛋白中提取露那辛

已在商业来源的大豆蛋白中发现了显著量的露那辛(19)，并从其他种子来源如大麦(4)和小麦(5)中发现了其类似物。为了鉴定可用于获得富集露那辛的种子提取物的起始原材料的优选来源，筛选数种可商购的大豆蛋白产品中露那辛的存在。

所用程序如下：将从不同商业来源(Solae，St.Louis，MO)获得的大豆蛋白样品(A-E)约500mg通过在室温下振荡1小时溶解于50mL含水磷酸盐缓冲液(pH7.2)中。将样品2500rmp离心30分钟，分离含水部分并置于单独试管中。通过Bradford分析测量蛋白浓度，并将约20μg总蛋白上样至两个Bio-Rad实验室(Hercules，California)的16％ Tris-三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶上。SDS-PAGE凝胶中的一个(I)用考马斯亮蓝染色，并在数码拍照前脱色。用箭头指示5kDa的露那辛条带。另一个(II)电印迹至硝酸纤维膜，并与亲和纯化的露那辛多克隆抗体(Pacific Immunology，(Ramona，California)孵育，随后与HRP偶联的驴抗兔二抗(AmershamBiosciences，Piscataway，New Jersey)孵育。用来自Amersham的ECLWestern印迹试剂盒检测露那辛的免疫信号(以箭头表示)。

结果显示于图5中。从照片中可以看出，露那辛的浓度在不同的来源中变化显著。这种分析是鉴定用于本发明组合物和方法的天然露那辛来源的有用工具。用含露那辛最多的大豆浓缩物(图5中的样品A)作为缓冲液提取步骤的起始材料，以产生富集露那辛的种子提取物，所述种子提取物在提及它们的下列实施例和附图中称为“富集露那辛的大豆浓缩物”或“LeSC”。

实施例4

配制的富集露那辛的大豆浓缩物(LeSC)和添加了大豆粉(SF)的LeSC含有显著量的露那辛

本实验评估富集露那辛的大豆浓缩物(LeSC)和添加了大豆粉的LeSC中露那辛的量。注意，在本发明的某些实施方案中，富集露那辛的种子提取物是从大豆分离物或其他的大豆产品而不是大豆浓缩物中获得的。

如实施例3所述，首先利用露那辛多克隆抗体通过Western印迹分析，鉴定含有显著量的露那辛的可商购的大豆蛋白制备物，以产生富集露那辛的大豆蛋白浓缩物。用经鉴定含露那辛最多的大豆蛋白浓缩物，作为一步缓冲液提取步骤(0.1×PBS pH7.2)中的起始材料，随后离心，分离上清液。将两体积的丙酮加入到上清液中，在真空干燥前，用过滤袋通过离心分离沉淀，得到富集露那辛的大豆浓缩物。

为使露那辛对不期望的过度消化更具抗性、改善其生物利用率以及当摄入时保留其生物活性所做的努力，导致发现了本发明的至少一个优选的实施方案，含有富集露那辛的种子提取物和大豆粉的组合物。

在本发明的至少一个实施方案中，通过改变总蛋白和露那辛含量的量(可以通过所用大豆浓缩物的量来控制)以及改变使露那辛免遭消化的露那辛保护的量(可以通过所用大豆粉的量来控制)，可优化含有天然来源的露那辛的本发明的组合物，用于本发明的特定方法中。

对于基于食品的物品，有时需要限制产品中蛋白酶抑制剂的量。例如，2007年4月26日提交的美国专利申请第20070092633号(在此通过引用将其并入)讲述了一些大豆产品的部分标准处理包括热处理，以灭活诸如Bowman-Birk抑制剂和Kuntz抑制剂的抗营养元素。因此，在本发明优选的实施方案中，通过本文所述的制备方法或本领域技术人员已知的制备方法，优化含有露那辛和大豆粉的组合物，以使其具有足以在消化过程中保护露那辛的生物学活性的蛋白酶抑制剂水平但不足以具有口服不期望的抗营养元素的水平。

对50:50混合的大豆浓缩物和大豆粉的临床实验导致LDL胆固醇减少20-30％(26，27)。这些临床实验是在不知道露那辛是大豆浓缩物中减少LDL胆固醇的活性元素的情况下进行的，因此，未控制混合物中露那辛的水平。本发明讲述了确定本发明起始材料和终产品中露那辛浓度的改进方法，以便使露那辛的浓度最大化，从而使在胆固醇相关的应用中治疗组合物的活性最大化。在本发明至少一个优选的实施方案中，大豆粉与富集露那辛的种子提取物的比例为10:90至50:50，更优选为20:80至40:60，更优选大豆粉:大豆浓缩物为约30:70。在本发明至少一个优选的实施方案中，大豆粉与富集露那辛的种子提取物的比例为提供露那辛的生物学活性浓度以及经由大豆粉提供了足够的免遭消化的保护。

在下文的几个实验中，在用pH7.2的0.1×PBS和丙酮沉淀的缓冲液提取前，将大豆粉(SF)加入到起始大豆浓缩物(30:70w/w的混合物)中，以产生富集露那辛的大豆浓缩物外加大豆粉(LeSC+SF)。

本实验所用的Western印迹分析程序如下：将来自LeSC、SF和LeSC+SF的约20μg的总蛋白在16％ Tris-三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶中电泳，并电印迹至硝酸纤维膜。将印迹与露那辛的多克隆抗体孵育，随后与HRP偶联的抗兔二抗孵育，之后用ECL试剂盒检测露那辛免疫信号。如图6所示，LeSC和LeSC+SF两者均含有显著量的露那辛。

实施例5

即使用消化酶消化，与大豆粉组合的富集露那辛的种子提取物保持生物活性。

利用H3组蛋白乙酰基转移酶(HAT)分析，测量LeSC(A)、LeSC+SF(B)、消化的LeSC+SF(C)、消化的LeSC(D)、消化的大豆蛋白分离物(E)和消化的大豆浓缩物(F)的生物学活性(参阅实施例8)。通过与胰酶制剂(Sigma Life Sciences，Saint Louis，Missouri)以1:1(w/w)混合并在40℃下孵育30分钟，消化约100mg LeSC、LeSC+SF、大豆蛋白分离物和大豆浓缩物的总蛋白。为了证实该HAT分析起作用，包括用合成的露那辛(+synL)处理。利用从鸡红细胞(Upstate/Millipore，Billerica，MA)分离的核心组蛋白作为HAT分析的模板，合成的露那辛减少了组蛋白乙酰基转移酶PCAF对组蛋白H3的乙酰化。在与PCAF酶和乙酰CoA底物进行HAT反应前，将约10μg样品蛋白与1μg核心组蛋白一起孵育。在16％ Tris-三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶上运行反应产物，并电印迹至硝酸纤维膜。将印迹与针对乙酰化的H3(在组蛋白14和组蛋白10处二乙酰化)而产生的一抗和HRP偶联的抗兔二抗孵育，之后用ECL试剂盒检测信号。低信号表示露那辛肽是生物活性的，因为其防止了组蛋白H3的乙酰化。强信号表示露那辛肽已经消化并失活，因此不能影响组蛋白H3乙酰化的水平。结果显示于图7中。

与未处理的对照相比，在存在合成的露那辛的情况下，H3的乙酰化显著减少。LeSC(图7中的A)和LeSC+SF(图7中的B)两者都能显著减少通过PCAF的H3乙酰化，表明发现于两种大豆蛋白提取物中的露那辛是生物学活性的。LeSC+SF的胰酶制剂消化(图7中的C)减少了生物学活性，但未达到仅仅LeSC被消化时所观察到的程度(图7中的D)。和LeSC一样，含有显著量露那辛的大豆蛋白分离物和大豆浓缩物在胰酶制剂消化后未显示露那辛生物学活性(图7中的E和F)。这些结果表明，配制的LeSC+SF保护露那辛，达到了免遭胰酶制剂消化的程度，并使露那辛保持了其生物学活性。

实施例6

配制的LeSC+SF的部分消化增加了露那辛的生物学活性。

利用不同的核心组蛋白模板，进行测定消化的和未消化的LeSC和LeSC+SF的生物学活性的证实实验。这次我们使用了从HeLa肿瘤细胞提取的核心组蛋白。与鸡红细胞不同，来自经丁酸钠处理的HeLa细胞的核心组蛋白可购买获得(Upstate/Millipore，Piscataway，NJ)，并可用作组蛋白乙酰化的阳性对照。用从未处理的HeLa细胞中分离的核心组蛋白作为HAT分析的阴性对照(低水平的组蛋白乙酰化)和模板。

利用从HeLa细胞(Upstate/Millipore)酸提取的核心组蛋白作为PCAF催化的HAT反应的模板(temp(-)对照)，进行HAT生物活性分析。因为NaB是已知增加组蛋白乙酰化的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，故用来自经丁酸钠(NaB)处理的HeLa细胞的核心组蛋白作为阳性对照。用合成的露那辛(+synL)对PCAF乙酰化组蛋白H3的抑制作用，比较富集露那辛大豆浓缩物(A)、消化的LeSC(A dig)、LeSC+SF(B)和消化的LeSC+SF(Bdig)的作用。以1:0.5(w/w)加入胰酶制剂，并在38℃下孵育15分钟，部分消化LeSC和LeSC+SF。图例下的数字表示利用模板(temp)的免疫信号标准化的相对密度计读数。数字小表示存在露那辛生物学活性。

结果显示于图8中。在存在合成的露那辛的情况下，观察到H3乙酰化显著减少。未消化的LeSC(A)和LeSC+SF(B)表现出H3的乙酰化的水平降低，表明在这些大豆提取物中发现的天然露那辛是生物学活性的。LeSC的部分消化(ADig)导致生物学活性的丧失。

令人惊讶的是，LeSC+SF的部分消化导致生物学活性增加，而不是降低。尽管不意图将本发明限制于任何精确的机制，但认为露那辛共价结合于高分子量的蛋白复合体，并且在大豆粉的保护下，部分消化仅破坏这些键并释放但不破坏生物活性露那辛进入溶液。在本发明优选的实施方案中，在使用前部分消化露那辛。在本发明另一优选的实施方案中，当部分消化露那辛时，存在大豆粉。

通过以1:0.5(w/w)的比例将LeSC+SF与新鲜制备的胰酶制剂溶液(10μg/mL的蒸馏水)混合，部分消化LeSC+SF。将混合物在38℃下孵育15分钟后，通过煮沸5分钟随后在冰上淬火，使蛋白酶和消化酶失活。在这些消化条件下，消化和灭活了LeSC大豆提取物中的露那辛(图8泳道Adig)，而LeSC+SF中的露那辛更具生物学活性(图8泳道B dig)。然而，LeSC+SF部分消化的条件必须通过分析消化产物的露那辛含量(图6)和利用HAT分析的生物学活性(图8)，以经验地确定。

胰酶制剂和蛋白酶来源的变化、蛋白酶的时效或孵育条件可导致消化条件的变异。例如，在上文所述的相似孵育条件下，使用制备已一月的胰酶制剂进行部分消化，可导致露那辛降解和活性丧失。因此，在本发明优选的实施方案中，利用如上文所用的HAT分析的分析，确定蛋白酶浓度可接受范围以及用蛋白酶进行孵育的时间的可接受范围，以评估受处理的组合物的生物学活性。在本发明优选的实施方案中，使用新鲜胰酶制剂在38℃下孵育10分钟。对于每μg露那辛提取物，使用0.5μg胰酶制剂。

实施例7

胰凝乳蛋白酶抑制剂(Chy)保护露那辛的生物活性

为了确定哪种发现于大豆中的蛋白酶抑制剂保护露那辛免遭消化，从Sigma获得大豆胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶+胰凝乳蛋白酶抑制剂，并与LeSC以1:1w/w比例进行混合。用胰酶制剂消化混合物，并用露那辛抗体将消化产物进行免疫染色。

实验的细节如下：通过在38℃下孵育15分钟，用胰酶制剂(1:1w/w)消化LeSC+大豆胰蛋白酶抑制剂(1:1w/w)(Sigma)和LeSC+胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制剂(1:1w/w)(Sigma)。利用露那辛一抗和将合成的露那辛作为标准对照，通过Western印迹分析(图9)，分析消化产物和LeSC。

利用来自鸡红细胞(Upstate/Millipore)的核心组蛋白作为PCAF催化的HAT反应的模板(图10)，进行HAT生物活性分析。与阴性未处理的对照(-synL)相比的合成的露那辛(+synL)对PCAF乙酰化组蛋白H3的抑制作用，用于比较消化的LeSC(A)、消化的LeSC+try+chy(B)、消化的LeSC+try(C)、未消化的LeSC(D)和未消化的LeSC+SF(E.)的作用。图例下面的数字表示利用来自未消化的LeSC(D)的免疫信号标准化的相对密度计读数。数字小表示存在露那辛的生物学活性。

图9和图10的结果显示，露那辛在LeSC+胰蛋白酶+胰凝乳蛋白酶抑制剂样品中受到免遭消化的保护，要比LeSC+胰蛋白酶抑制剂样品中好。同样，在测定露那辛生物学活性的HAT分析中，LeSC+胰蛋白酶+胰凝乳蛋白酶抑制剂的消化比LeSC+胰蛋白酶抑制剂明显更具生物活性(图10)。LeSC的胰酶制剂消化导致生物学活性的丧失。这些结果表明，存在胰凝乳蛋白酶抑制剂和富集露那辛的种子提取物不但有助于保护露那辛的生物学活性而且有助于保护露那辛免遭过度消化。

实施例8

确定露那辛生物学活性的筛选分析

在存在或缺少约2-10μM露那辛的情况下，用PCAF组蛋白乙酰基转移酶，将从鸡红细胞纯化的核心组蛋白用作组蛋白乙酰基转移酶(HAT)反应中的模板。(10:1w/w)混合核心组蛋白模板和富集露那辛的大豆浓缩物(LeSC和LeSC+SF)，并在冰上孵育5分钟以及25℃下孵育10分钟，之后，将混合物加入1×HAT反应基液、1μM乙酰CoA和5μLPCAF(基于Upstate/Millipore推荐的浓度)。反应混合物在30℃下孵育1小时，同时250rpm振荡。加入具有β-巯基乙醇的Laemmli终止缓冲液(1:1v/v)，煮沸5分钟，之后在冰上淬火15分钟，终止反应。在16％的SDS-PAGE上运行PCAF HAT反应的产物，印迹至硝酸纤维膜，并用针对二乙酰化的组蛋白H3(Ac-Lys13+Ac-Lys14H3)而产生的一抗和随后的HRP-偶联的抗兔二抗进行免疫染色。利用标准的化学发光试剂，使抗体复合物的化学发光信号直观化，并曝光于KodakBioMAX胶片，显影，并通过利用数码扫描仪和来自Silk Scientific(Orem，Utah)的UN-SCAN-IT软件程序测量斑点密度计。图7泳道A和B表示，与未处理的对照相比，用LeSC和LeSC+SF处理的反应混合物中H3的乙酰化减少，表明这种筛选方法可确定富集露那辛的种子提取物以及含有露那辛或露那辛片段、类似物或变体的其他组合物的生物学活性。同样在图7中，LeSC消化(泳道D)消除了生物学活性但不是LeSC+SF(泳道C)的生物学活性，其表明仅仅部分减少了生物学活性，这也是可以确定的。

实施例9

当前描述的组合物的体内活性，以及试剂盒的治疗应用和治疗方法，可任选地通过下列方法中的任何一个来确定。

喂食雄犬(小猎犬，约9-14kg，年龄1-4岁)添加5.5％猪油和1％胆固醇的标准犬饲料。在启动本研究前，提取禁食犬的基础血样品，以便获得血浆胆固醇的参考值。随后将犬随机分配至具有相似血浆胆固醇水平的5只动物组。根据本文所述治疗方法给动物服药，之后立即给食7天。在最后一次剂量24小时后，获得血液样品，以确定血浆胆固醇。利用商购试剂盒，通过改良的胆固醇氧化酶法，测定血浆胆固醇水平。

在任选的替换方法中，将仓鼠分成6只组，并给予含有0.5％胆固醇的受控胆固醇饮食7天。监控饮食食用，以确定饮食胆固醇的暴露。从启动饮食开始，按本文所述治疗方法，每日给药动物一次。给药是通过口服强饲法。对垂死的或身体状况不佳的所有动物实施安乐死。7天后，通过肌肉内(IM)注射克他命，将动物麻醉，斩首处死。将血液收集于含有EDTA的真空采血管，用于血浆脂质分析，切除肝，用于组织脂质分析。按照公开的方法(如Schnitzer-Polokoff et al.，Comp.Biochem.Physiol.，99A，4(1991)，pp.665-670)，进行脂质分析，并对比对照，将数据记录为脂质的百分比减少。

上面的说明书、实施例和数据为本发明组合物的用途和制备提供了完整描述。尽管就认为是最具实践性和优选的实施方案，对产品、组合物和相关方法进行了描述，但是应当理解，不必将公开的内容限制于公开的实施方案。意在涵盖了包括于权利要求书的精神和范围内的各种修改和相似的设置，其范围应该符合最宽泛的理解，以致包括所有的此类修改和相似结构。本发明公开包括权利要求的任何和所有实施方案。在此将上文讨论或引用的所有专利、期刊文章和其他的文献通过引用并入。在此将本文讨论或引用的或列于下文的所有专利、期刊文章和其他的文献通过引用并入。

参考文献

上文并入的顺序编码对应于出版文献和摘要的下列名单。将所有下文所列出版物通过引入整体并入本文，以达到如同将每个单个出版物具体而单独地指出通过引用整体并入一样的程度。

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序列表

<110>阿尔弗雷多·弗洛里斯·拉尔瓦兹

<120>利用大豆肽降低总胆固醇水平和LDL胆固醇水平的产品和方法

<130>9SoyL.8 PCT

<140>PCT/USO 7/78584

<141>2007-09-15

<160>2

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>157

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max)

<400>1

<210>2

<211>43

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max)

<400>2