通过颅内递送SIRNA治疗亨廷顿氏舞蹈症的组合物、装置和方法

最佳实施方式的具体描述

本发明同时解决了现有技术中的两个问题：(1)如何治疗因神经元内致病性蛋白的产生所致的神经退行性疾病的问题；以及(2)递送治疗性小干扰RNA到患病神经元的问题。

为了更好地理解本发明，下面列出了术语以及对这些术语的理解范围。

术语

“α-突触核蛋白、BACE1(包括其变异体，例如A、B、C和D型变异体))、亨廷顿蛋白、1型共济失调蛋白、3型共济失调蛋白和/或1型萎缩蛋白”是指，分别由含有下列基因和/或人类基因组DNA表达和/或编码的氨基酸序列的蛋白及其突变蛋白衍生物：α-突触核蛋白(帕金森氏病)，以及β位-APP裂解酶(BACE1(包括其变异体，例如A、B、C和D型变异体))(阿尔兹海默氏病)、亨廷顿蛋白(亨廷顿氏舞蹈症)，以及1型共济失调蛋白(1型脊髓小脑性共济失调)，3型共济失调蛋白(3型脊髓小脑性共济失调或Machado-Joseph病)，和/或齿状核-红核-苍白球-路易氏体萎缩(DRPLA)。

此处使用的“细胞”，用其通常的生物学含义，并不指完整的多细胞有机体。该细胞可存在于有机体，例如人，但是优选哺乳动物来源，诸如人、牛、羊、猿、猴、猪、狗、猫等。然而，产生小干扰RNA的一些步骤可能也需要使用原核细胞(如细菌细胞)或者真核细胞(如哺乳动物细胞)，因此也包括在术语“细胞”的范围。

所用“互补”是指含有一个或多个核酸(DNA或RNA)的分子可以和其它含有一个或多个核酸的分子通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)配对或其他非传统的方式形成一个或多个氢键。

所用α-突触核蛋白、BACE1(包括其变异体，例如A、B、C和D型变异体))、亨廷顿蛋白、1型共济失调蛋白、3型共济失调蛋白和/或1型萎缩蛋白的“等效”DNA，包括与编码α-突触核蛋白、BACE1(包括其变异体，例如A、B、C和D型变异体))、亨廷顿蛋白、1型共济失调蛋白、3型共济失调蛋白和/或1型萎缩蛋白的DNA，或者与在包括人类、啮齿类、灵长类、兔、猪和微生物的多种生物中编码与α-突触核蛋白、BACE1(包括其变异体，例如A、B、C和D型变异体))、亨廷顿蛋白、1型共济失调蛋白、3型共济失调蛋白和/或1型萎缩蛋白具有相似功能的蛋白的DNA具有同源性的(部分或全部)天然产生的DNA分子。等效DNA序列还包括诸如5’非翻译区、3’非翻译区、内含子、内含子-外显子连接区、小干扰RNA靶点等，任选地，包括并入感染性病毒的DNA，诸如腺相关病毒(AAV)。

术语“功能等效”是指与参考序列或蛋白功能相似的任一衍生物。特别地，术语“功能等效”包括有一个或多个核苷酸碱基插入、删除或替换，而对生物学功能没有显著不利影响的衍生物。所用“基因”是指控制RNA生产的DNA区域。在产生功能性小干扰RNA这种语境下，这种定义包括必需的DNA序列信息，包括编码小干扰RNA的DNA序列、非编码调控序列和包括在内的任何内含子。本定义并未排除其它编码蛋白的基因可以和编码小干扰RNA的基因联合或串联而发挥作用的可能性。

术语“载体”为本技术领域熟知，定义为质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA等，它们可以作为DNA运载工具，本发明的DNA可以插入其中并且可以被转录为RNA。术语“多个载体(vectors)”指这些用于递送目标核酸的基于核酸和/或病毒的技术中的任何一种。存在着多种类型的载体并为本技术领域所熟知。

术语“表达”定义为基因被转录成RNA的过程(转录)；RNA还可进一步加工成成熟的小干扰RNA。

术语“表达载体”定义为如上所述的载体或运载工具，设计成使插入序列在转化宿主后能够表达。克隆基因(插入序列)通常置于调控因子序列的调控之下，例如启动子序列。将克隆基因置于这种调控序列的调控之下通常被称作可操作性地连接到调控因子或序列。

“启动子”是指能够直接或间接地结合到细胞中的RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列转录的DNA调控区。为了本发明的目的，启动子通过其转录起始位点结合在3’末端并向上游延伸(5’方向)以包括启动本底水平以上可检测的转录所必需的碱基或因子。在启动子中，可以发现转录起始位点(通过S1核酸酶作图可方便地定义)，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合区(共有序列)。真核细胞启动子还常常，但并不总是，含有＂TATA＂框和＂CCAT＂框。原核细胞启动子含有-10区和-35区共有序列用于转录启动。

所用“同源”是指该两个或多个核酸分子的核苷酸序列部分或全部相同。

所用“高度保守序列区”是指靶基因中的一个或多个区域的核苷酸序列从一代到另一代或从一种生物系统到另一种生物系统不会发生显著变化。

所用术语“抑制”或“抑制性的”是指和没有小干扰RNA时所观察到的相比，靶基因的活性或mRNA或编码靶基因的等效RNA的水平被降低。优选的抑制为比没有小干扰RNA时降低至少10％、25％、50％，或至少75％、85％，或至少95％。

所用“抑制表达”是指α-突触核蛋白、BACE1(包括其变异体，例如A、B、C和D型变异体))、亨廷顿蛋白、1型共济失调蛋白、3型共济失调蛋白和/或1型萎缩蛋白mRNA水平降低，因此相应的蛋白水平降低以在某种程度上缓解疾病或病情中的症状。

所用“RNA”是指核糖核酸，一种由核糖核苷酸通过磷酸-核糖(糖)骨架连接所组成的的分子。所用“核糖核苷酸”是指鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶，或腺嘌呤，或2’位带羟基β-D-核-呋喃糖配基。本领域众所周知，在DNA序列中使用碱基胸腺嘧啶，在RNA中使用尿嘧啶作为遗传密码。本领域的技术人员知道在核酸序列中如何用尿嘧啶替代胸腺嘧啶将DNA序列转换成RNA序列，反之亦然。

所用“患者”是指有机体，它是外植体细胞的供者或受者或细胞本身。“患者”还指给予本发明的核酸分子的有机体。优选地，患者是哺乳动物或哺乳动物细胞，诸如人、牛、羊、猿、猴、猪、狗、猫等，或者用于移植的这些动物的细胞。更优选地，患者是人或者人的细胞。

术语“突触核蛋白”是指α-突触核蛋白(特别是人或小鼠的)或者β-突触核蛋白(特别是人或小鼠的)。编码人α-突触核蛋白的全长核苷酸序列可通过登录号AF163864(SEQ IDNO：7)获得。人α-突触核蛋白序列的两个变异体可通过登录号NM000345(SEQ ID NO：14)和登录号NM_007308(SEQ ID NO：23)获得。小鼠α-突触核蛋白可通过登录号AF163865(SEQ ID NO：10)获得。

术语“BACE1”是指1型β-淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶(特别是人或小鼠的)。BACE1的几种变异体已经被测序，包括A、B、C或D型变异体。在某些科学文献中，BACE1也被称为ASP2和Memapsin2。编码人BACE1的全长核苷酸序列及其相关的变异体序列可通过登录号No.NM_138971(SEQ ID NO：20)、登录号NM_138972(SEQ ID NO：19)、登录号NM_138973(SEQ ID NO：21)和登录号NM_012104(SEQ ID NO：18)获得。小鼠同源序列可通过登录号NM_011792(SEQ ID NO：22)获得。

术语“亨廷顿蛋白”指由亨廷顿氏舞蹈症基因(IT-15)(特别是人或小鼠的)编码的蛋白产物。编码人IT-15的全长核苷酸序列可通过登录号AH003045(SEQ ID NO：9)获得。小鼠序列可通过登录号U24233(SEQ ID NO：12)获得。

术语“1型共济失调蛋白”指由1型脊髓小脑性共济失调基因编码的蛋白产物(特别是人或小鼠的)。编码人SCA1的全长核苷酸序列可通过登录号NM_000332(SEQ ID NO：15)获得。小鼠SCA1可通过登录号NM_009124(SEQ ID NO：13)获得。

术语“3型共济失调蛋白”指由3型脊髓小脑性共济失调基因编码的蛋白产物(特别是人或小鼠的)。编码人SCA3的全长核苷酸序列可通过登录号NM_004993(1型剪接变异体)(SEQ ID NO：16)和NM_030660(2型剪接变异体)(SEQ ID NO：17)获得。(小鼠同源序列尚不可得)。

术语“1型萎缩蛋白”是指由齿状核-红核-苍白球-路易氏体萎缩(DRPLA)基因编码的蛋白产物(特别是人或小鼠的)。编码人DRPLA的全长核苷酸序列可通过登录号NoXM_032588(SEQ ID NO：8)获得。小鼠序列可通过登录号No.XM_132846(SEQ ID NO：11)获得。

术语“修饰”包括与参考序列或蛋白基本相似的衍生物。

此处所用的“核酸分子”是指含有核苷酸的分子。核酸可以是单链的、双链的或多条链的，并且可以包括修饰的或非修饰的核苷酸或非核苷酸或不同混合及其组合。根据本发明的核酸分子的一个例子是编码小干扰RNA的基因，即便它不一定具有其更普遍的编码蛋白产物的含义。

所用“小干扰RNA”是指在底物结合区与特异的基因靶标具有互补性的核酸分子，它能特异性地引导宿主细胞的酶裂解靶RNA。亦即，小干扰RNA凭借其序列特异性及其与靶RNA的同源性，能够引起RNA链的裂解，进而使靶RNA分子因不能再被转录而失活。这些互补区容许小干扰RNA和靶RNA充分杂交因而许可裂解发生。对于生物学活性来讲百分之百的互补常常是必要的，因此是优选的，但是在本发明中低至90％的互补性也是可用的。本申请所述的特异性小干扰RNA其旨不在限制，本领域的技术人员可以清楚，本发明的小干扰RNA最重要之处在于它具有特异性的底物结合位点，该位点能与一个或多个靶核酸区域互补。

小干扰RNA是双链RNA制剂，它能与靶RNA(通常是信使RNA)的一个部分互补(即能进行碱基配对)。通常，这种互补是100％的，但如果需要，也可以低至诸如91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。例如，21个碱基中的19个碱基可以碱基配对。在某些情况下，需要在多个等位变异体间进行选择，需要与靶基因100％互补以从其它等位序列中识别出靶序列。当在等位靶标中选择时，长度的选择也是一个重要的因素，因为它是涉及互补百分比以及鉴别等位差异能力的另一重要因素。

小干扰RNA序列需要具有足够的长度，以便小干扰RNA能和靶RNA通过碱基配对作用结合在一起。本发明的小干扰RNA可以具有不同长度。小干扰RNA的长度优选大于或等于10个核苷酸并且具有和靶RNA稳定地相互作用的足够长度；具体地说是15～30个核苷酸，更具体说是15～30之间的整数个核苷酸，诸如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30个。所用“足够长度”是指大于或等于15个核苷酸的寡核苷酸，它的长度足够长，在预期条件下能提供预期的功能。所用“稳定地相互作用”是指小干扰RNA和靶核酸的相互作用(例如通过在靶标与互补核苷酸在生理条件下形成氢键)。

所用“包含”是指包括，但不限于“包含”这个词之后的任何内容。因此，术语“包含”表示所列出的元素是必需的或强制性的，而其它元素则是可选的，可以存在也可以不存在。

所用“由......组成”是指包括且限于短语“由......组成”中的任何内容。因此，短语“由......组成”表示所列元素是必需的和强制性的，而不再存在其它元素。

所用“基本上由......设计的组成”是指包括该短语中列出的任何元素，并限于不干扰或有助于在公开内容中详细说明的所列的活性或作用的其它元素。因此，短语“基本上由......组成”提示所列出的元素是必需的或强制的，但其它元素依赖于他们是否影响所列元素的活性或作用是可选的，可以存在或不存在。

本发明提供了通过颅内递送编码小干扰RNA的载体来治疗多谷氨酰胺疾病(诸如亨廷顿氏舞蹈症和1型脊髓小脑性共济失调)、帕金森氏病和阿尔兹海默氏病的手段和工具，该小干扰RNA设计成能使致病性蛋白或病情恶化蛋白表达沉默，通过一个或多个植入性颅内导管来递送。具体而言，本发明是：(1)通过颅内递送编码能使亨廷顿蛋白沉默的小干扰RNA的载体来治疗亨廷顿氏舞蹈症的方法；(2)通过颅内递送编码能使1型共济失调蛋白沉默的小干扰RNA的载体来治疗1型脊髓小脑性共济失调的方法；(3)通过颅内递送编码能使α-突触核蛋白沉默的小干扰RNA的载体来治疗帕金森氏病的方法；以及(4)通过颅内递送编码能使1型β-淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE1)沉默的表达小干扰RNA的载体来治疗阿尔兹海默氏病的方法。

如前所述，此处所述的小干扰RNA(或siRNA)是长度为15～30个核苷酸的双链RNA片段。它用于触发称为RNA干扰的细胞反应。在RNA干扰中，双链RNA被一种细胞内酶——Dicer酶消化，产生双螺旋siRNA。该双螺旋siRNA与另一细胞内酶复合物结合，该复合物因此被激活，导向任何与该siRNA序列同源的(或互补的)mRNA分子。激活的酶复合物裂解靶mRNA，破坏并防止它被用来指导其相应蛋白产物的合成。RNA干扰过程看起来似乎是自我扩增的，其方式尚未完全清楚。最近有证据显示，RNA干扰是一种古老的固有的机制，不仅用于对病毒感染的防御(许多病毒都会给细胞引入外源RNA)，而且也是一种十分基础水平的基因调节。已经发现，RNA干扰在植物、昆虫、低等动物和哺乳动物中都会发生，并且已经发现RNA干扰比其它基因沉默技术如反义技术和核酶技术都有效得多。作为一种生物技术，siRNA涉及在细胞中中引入(或促进细胞产生)短的、双链RNA分子，这种RNA分子相似于Dicer酶从入侵的双链RNA病毒加工得到的RNA分子。而人为触发RNA干扰的过程，并随后从那一点继续下去。

为了将小干扰RNA递送到患者脑部，优选的方法是将编码该siRNA的DNA而不是该siRNA本身引入脑细胞。编码特定的治疗性的siRNA的DNA序列在知晓下列情况时可以特定化：(a)靶mRNA可获得的一小部分序列(可以在公共的人类基因组数据库中获得)；和(b)如何确定DNA的众所周知的科学规则，该DNA在被细胞转录时将会产生相应的RNA。该DNA序列，一旦确定，就可以基于实验室供应商订购的合成分子在实验室中构建，并采用标准分子生物学方法插入到几个替代“载体”中的一个中，以递送DNA至细胞。一旦递送到患者脑部的神经元中，那些神经元自身通过将插入的DNA转录成RNA将会产生RNA，该RNA成为治疗性siRNA。结果是细胞自身产生将沉默靶基因的siRNA。结果是细胞产生的靶蛋白的量将会减少。

小干扰RNA和小干扰RNA载体

根据本发明，针对患病细胞产生的小干扰RNA防止神经元中疾病相关蛋白的产生。根据本发明，使用特异设计的载体来递送小干扰RNA到靶细胞的。用成功递送到大脑靶细胞来治疗神经退行性疾病来预测的所设计小干扰RNA的成功。

已经表明，小干扰RNA能够靶向人细胞中的特异性mRNA分子。可以构建小干扰RNA载体来转染人细胞并产生小干扰RNA，它能使靶RNA裂解因而干扰所编码的蛋白的产生。

通过抑制神经致病性蛋白本身的产生或者通过抑制参与该神经致病性蛋白产生或加工过程的蛋白，本发明的小干扰RNA载体将会防止致病性蛋白的产生。为了改善患者的生活质量，可能需要给患者重复使用治疗性药物来实现足够大量的神经元的改变。然而，在一个个体神经元中，这种改变是长期性的，足以提供治疗性益处。诸如阿尔兹海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈症或1型脊髓小脑性共济失调患者的绝境，使得该治疗的益处超过治疗递送和用药的风险成为可能。虽然采用其它治疗药物和给药途径来实现神经致病性蛋白的减少也有可能，但是开发直接体内转染神经元的成功的治疗措施却可提供基于递送小干扰RNA载体到靶细胞的最好的方法。

递送外源DNA到脑神经元优选的载体是腺相关病毒(AAV)，诸如重组2型血清型腺相关病毒或重组5型血清型腺相关病毒。选择性地，其它病毒载体诸如单纯疱疹病毒，也可用于递送外源DNA至中枢神经系统神经元。亦有可能，非病毒载体诸如质粒载体也可单独或与脂质体复合物或聚乙烯胺混合使用，递送外源DNA到脑部的神经元。

重要的是，应当注意此处举例说明的抗-1型共济失调蛋白小干扰RNA和其它用于治疗神经退行性障碍的小干扰RNA都只是本发明实施方式的一些例子。在动物上的采用神经科学领域知晓的神经外科学方法的实验可以鉴定候选小干扰RNA。用这些实证主义方法鉴定的靶裂解部位和小干扰RNA，当给予罹患这些神经退行性疾病的患者时，将产生最大的治疗效果。

参照本发明的核酸分子，小干扰RNA被导向编码靶蛋白的mRNA的互补序列，这些序列既可在真正的蛋白编码序列，也可在与5’非翻译区或3’非翻译区。杂交后，宿主酶可以裂解该mRNA序列。小干扰RNA需要完全或高度互补才能有效。互补百分比是指核酸分子中可以和第二个核酸分子序列形成氢键(如Watson-Crick碱基配对)的连续的残基的百分比(诸如10个中有5、6、7、8、9或10个，就是50％、60％、70％、80％、90％或100％互补)。“完全互补”指一个核酸序列中的全部连续残基都能与第二个核酸分子序列相同数目的连续残基形成氢键。然而，应当注意，siRNA序列中的单个错配或碱基替代可能会实质上降低小干扰RNA的基因沉默活性。

靶向α-突触核蛋白、BACE1(包括其变异体，例如A、B、C和D型变异体)、亨廷顿蛋白、1型共济失调蛋白、3型共济失调蛋白和/或1型萎缩蛋白中特异性位点的小干扰RNA代表了一种在细胞或组织中治疗帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、亨廷顿氏舞蹈症、1型脊髓小脑性共济失调、3型脊髓小脑性共济失调和齿状核-红核-苍白球-路易氏体萎缩的新方法。

在本发明的一个优选的实施方式中，小干扰RNA的长度为15～30个核苷酸，在具体的实施方式中，核酸分子的长度是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在优选的实施方式中，siRNA序列的长度可能在19～30个碱基对，更优选的是21～25个碱基对，更优选的是21～23个碱基对。

在一个优选的实施方式中，本发明提供了一种生产一类基于核酸的基因抑制剂的方法，它们对预期靶标表现出高度特异性。例如，小干扰RNA靶标优选编码α-突触核蛋白、BACE1(包括其变异体，例如A、B、C和D型变异体)、亨廷顿蛋白、1型共济失调蛋白、3型共济失调蛋白和/或1型萎缩蛋白的靶RNA的高度保守序列区，以便使用本发明的一种或多种核酸分子可以提供对一种疾病或病情的特异性治疗。另外，通常，小干扰RNA序列可通过识别以一对腺嘌呤碱基(AA)开始的靶序列来选择(见实施例)。可以采用适当的转录酶或表达载体体外或体内构建SiRNA。

SiRNA可以使用DNA寡核苷酸体外构建。这些寡核苷酸可以构建成含有与沉默子siRNA(Silencer siRNA)(Ambion公司的构建试剂盒1620)中包含的T7启动子引物的5′末端互补的8个碱基序列。每一基因特异性寡核苷酸与所提供的T7启动子引物退火，用克伦诺片段(Klenow片段)的填充反应产生一全长DNA模板以转录成RNA。两个体外转录的RNA(一个是另一个的反义RNA)通过体外转录反应生成，然后互相杂交形成双链RNA。该双链RNA产物用DNA酶(去除DNA转录模板)和RNA酶(削平双链RNA末端)处理、柱纯化以提供可以被递送入细胞并检测的siRNA。

通常使用RNA聚合酶III启动子驱动与siRNA结构相似的短发夹RNA的表达，来构建能在哺乳动物细胞中表达siRNA的siRNA载体。编码该“发夹”的插入序列被设计成具有由一小段隔离序列分隔的两段反向重复序列。一段反向重复序列与siRNA靶向的mRNA互补。一串胸腺嘧啶加到3′末端作为pol III转录终止位点。一段进入细胞，载体组成型表达发夹RNA。发夹RNA被加工成siRNA，该siRNA诱导靶基因表达的沉默，即所谓的RNA干扰(RNAi)。

目前为止，大多数有记载的siRNA表达载体中，三个不同的RNA聚合酶III(polIII)启动子中的一个被用于驱动小发夹siRNA(1-5)。这些启动子包括已经明确表征的人类和小鼠的U6启动子和人HI启动子。选择RNA聚合酶III驱动siRNA表达是因为它能在哺乳动物中表达较大数量的小RNA，并且它会在遇到与3～6个尿嘧啶串的时候终止转录。

构建的核酸分子可以根据需要被外源性递送到特异组织或细胞靶标。选择性地，该核酸分子(如小干扰RNA)可以由递送至特异细胞的DNA质粒、DNA病毒载体和/或RNA逆转录病毒载体表达。

被递送到靶细胞或组织的小核RNA序列是基于核酸的α-突触核蛋白、BACE1(包括其变异体，例如A、B、C和D型变异体)、亨廷顿蛋白、1型共济失调蛋白、3型共济失调蛋白和/或1型萎缩蛋白的表达抑制剂(例如翻译抑制剂)，用于在细胞或组织中防治包括帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、亨廷顿氏舞蹈症、1型脊髓小脑性共济失调、3型脊髓小脑性共济失调和齿状核-红核-苍白球-路易氏体萎缩在内的神经退行性疾病，和其它任何与细胞或组织内α-突触核蛋白、BACE1(包括其变异体，例如A、B、C和D型变异体)、亨廷顿蛋白、1型共济失调蛋白、3型共济失调蛋白和/或1型萎缩蛋白水平有关的疾病或病情。

本发明的基于核酸的抑制剂可直接加入，或与阳离子脂质体复合，用脂质体包装，用病毒载体包装，或以其他手段递送至靶细胞或组织。该核酸或核酸复合物(和生物大分子结合或者不和生物大分子结合)，可通过注射、输液泵或支架局部给予离体相关组织或体内。在优选的实施方式中，该核酸抑制剂含有某些序列，这些序列具有足够长度和/或与用SEQ ID NOS：7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22或23标示的互补底物序列稳定地相互作用。这些小干扰RNA的例子也在如与1型萎缩蛋白有关的SEQ IDS NOS：1和2、3和4，和5和6等序列中显示。

另一方面，本发明提供了含有本发明的一个或多个核酸分子和/或表达载体的哺乳动物细胞。该一个或多个核酸分子可以独立地被导向相同或不同的位置。

在本发明的另一方面，与靶RNA分子相互作用并抑制α-突触核蛋白、BACE1(包括其变异体，例如A、B、C和D型变异体)、亨廷顿蛋白、1型共济失调蛋白、3型共济失调蛋白和/或1型萎缩蛋白活性的小干扰RNA分子，是由插入到DNA或RNA载体的转录单元表达的。该重组载体优选为DNA质粒或病毒载体。表达小干扰RNA的病毒载体，可以基于，但不限于腺相关病毒、逆转录病毒或腺病毒载体序列构建。优选地，表达小干扰RNA的重组载体被按上述方式递送并在靶细胞中维持。选择性地，病毒载体可用于提供小干扰RNA的瞬时表达。根据需要这些载体可以重复给药。一旦表达，该小干扰RNA结合到靶RNA并通过宿主机制抑制其表达进而抑制其功能。小干扰RNA表达载体，或小干扰RNA是通过使用颅内通路装置递送的。

本发明的核酸分子，可单独使用或与其它药物协同使用或联合使用来治疗上述疾病或病情。例如，为了治疗与α-突触核蛋白(帕金森氏病)、1型β-淀粉样前体蛋白裂解酶(阿尔兹海默氏病)、亨廷顿蛋白(亨廷顿氏舞蹈症)和1型共济失调蛋白(1型脊髓小脑性共济失调)相关的疾病或病情，可单独使用或联合使用一种或几种适合于该治疗的药物来治疗患者或处理其它适合的细胞，这对于本技术领域的技术人员是显而易见的。

在进一步的实施方式中，所述的小干扰RNA可以与其它已知的治疗措施合并使用来治疗上述的病情或疾病。

在另一个优选的实施方式中，本发明提供了基于核酸的抑制剂(例如小干扰RNA)及其用于下调或抑制编码参与帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、亨廷顿氏舞蹈症、1型脊髓小脑性共济失调、3型脊髓小脑性共济失调和齿状核-红核-苍白球-路易氏体萎缩进展或维持的蛋白的RNA(例如，α-突触核蛋白、BACE1(包括其变异体，例如A、B、C和D型变异体)、亨廷顿蛋白、1型共济失调蛋白、3型共济失调蛋白和/或1型萎缩蛋白)表达的方法。

本发明还提供了可以在细胞内由已知的真核细胞启动子(例如：Izant and Weintraub，1985，Science，229，345；McGarry and Lindquist，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 83，399，Scanlon et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，10591-5；Kashani-Sabet et al.，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Dropulic et al.，1992，J Virol.，66，1432-41；Weerasinghe et al.，1991，J Virol.，65，5531-4；Ojwang et al，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10802-6；Chen etal.，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9；Sarver et al.，1990 Science，247，1222-1225；Thompsonet al.，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Good et al.，1997，Gene Therapy，4，45；所有这些文献在此以全文以引文形式并入本文)驱动表达的核酸分子。本领域的技术人员能够认识到，任何核酸分子都可以从适合的DNA/RNA载体在真核细胞中表达。这些核酸分子的活性可以因为被核酶从初级转录物释放而增强(Draper et al.，PCT WO 93/23569，and Sullivan etal.，PCT WO 94/02595；Ohkawa et al.，1992，Nucleic Acids Symp.Ser.，27，15-6；Taira et al.，1991，Nucleic Acids Res.，19，5125-30；Ventura et al.，1993，Nucleic Acids Res.，21，3249-55；Chowrira et al.，1994，J Biol.Chem.，269，25856；所有这些文献在此以全文以引文形式并入本文)。

本发明另一方面，本发明的RNA分子优选从插入DNA或RNA载体的转录单位表达(见，例如Couture et al.，1996，TIG.，12，510)。该重组载体优选DNA质粒或病毒载体。表达小干扰RNA的病毒载体，可以基于，但不限于腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒载体构建。

优选地，能表达核酸分子的重组载体如上述被递送并维持在靶细胞中。选择性地，可以用病毒载体来提供核酸分子的瞬时表达。这样的载体根据需要可重复给药。一旦表达，核酸分子就会结合到靶mRNA。递送表达核酸分子的载体可以通过使用所述的颅内通路装置单次、多次或长期递送。

一方面，本发明描述了一种表达载体，它含有编码至少本发明的核酸分子的至少一个功能片段的核酸序列。编码本发明的核酸分子的核酸序列以一种允许该核酸分子表达的方式可操纵性地被连接。

另一方面，本发明描述了一种表达载体，它含有：a)转录起始区(例如真核pol I、II或III起始区)；b)编码至少一个本发明的核酸制剂的核酸序列；和c)转录终止区(例如真核pol I、II或III终止区)；其中所述的序列以一种允许所述的核酸分子表达和/或递送的方式可操作性地连接到所述的起始区和终止区。

正如本领域所知晓和理解的，核酸分子序列的转录是由真核细胞RNA聚合酶I(pol I)、真核RNA聚合酶II(pol II)或真核RNA聚合酶III(pol III)启动子驱动的。所有这些文献在此并入本文作为参考。一些研究人员表明RNA分子可以由这些能在哺乳动物细胞中发挥功能的启动子来表达(例如Kashani-Sabet et al.，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Ojwanget al.，1992，Proc.NatLl Acad Sci.USA，89，10802-6；Chen et al.，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9；Yu et al.，1993，Proc.Natl.Acad Sci.USA，90，6340-4；L′Huillier et al.，1992，EMBO J，11，4411-8；Lisziewicz et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，90，8000-4；Thompson et al.，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Sullenger & Cech，1993，Science，262，1566)。更具体地说，诸如由编码U6小核RNA(snRNA)、转移核糖核酸(tRNA)和腺病毒VA RNA驱动的转录单位都可用于在细胞中产生高浓度的目的RNA分子诸如小干扰RNA(Thompson et al.，supra；Couture and Stinchcomb，1996，supra；Noonberg et al.，1994，Nucleic Acid Res.，22，2830；Noonberg et al.，US Pat.No.5,624,803；Good et al.，1997，Gene Ther.，4，45；Beigelman et al.，国际PCT公开号WO96118736；所有这些文献在此以引文形式并入本文)。上述小干扰RNA转录单位可以被合并到多种载体引入哺乳动物细胞，包括但不限于质粒DNA载体、病毒DNA载体(如腺病毒或腺相关病毒载体)或病毒RNA载体(如逆转录病毒或甲病毒载体)(见Couture and Stinchcomb，1996，supra的综述)。

重要的是，应注意到基于利用小干扰RNA靶向1型共济失调蛋白的mRNA以使之减少的，针对1型脊髓小脑性共济失调症的治疗只是本发明的一个实施方式。其他的实施方式包括利用抗亨廷顿蛋白的小干扰RNA在人脑部纹状体给药，以治疗亨廷顿氏舞蹈症，以及利用抗α-突触核蛋白的小干扰RNA在人脑部黑质给药，以治疗帕金森氏症。

应当注意，构建本发明中作为治疗药物的小干扰RNA的示例性的方法(即从DNA模板体外转录并组装成双链RNA，或将编码发夹结构RNA的DNA克隆到腺相关病毒表达载体中)只是两种产生治疗性小干扰RNA的可能的手段。也可以使用其它更大规模的、更为有效的方法生产用于人类患者治疗的临床级别和临床数量的小干扰RNA，而不会改变本发明的实质。

本领域技术人员很熟悉在众所周知的和现有的文献中讨论的原理和方法，如Remington′s Pharmaceutical Science(17th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1985)和Goodman and Gilman′s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics(8th Ed.，Pergamon Press，Elmsford，N.Y.，1990)，二者在此均以引文形式并入本文。

在本发明一个优选的实施方式中，根据适合递送给人类或哺乳动物的药物组合物的标准方法制成了含有本发明的siRNA的药物或其前体或衍生物的组合物。通常，用于静脉给药的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。

如有必要，该组合物还可以包括增溶剂和局麻药来缓解注射部位的疼痛。通常，这些成分可单独或混合在单位剂型中提供，例如，密封容器如安瓿或sachette容器中的冻干粉或无水浓缩物，标明活性成分含量。当组合物用于输液给药时，它可以用含有药用级的无菌水或盐的输液瓶配药。当组合物用于注射给药时，可提供一安瓿无菌注射用水或盐水以便其成分在给药前混合。

在静脉给药以外的情况下，该组合物可以含有少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。该组合物可以是液体溶液、悬浊液、乳液、凝胶、聚合物或缓释制剂。该组合物可以和本领域知晓的传统的粘合剂和载体一起制成制剂。制剂可以包括标准载体诸如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖类化合物的钠盐、纤维素、碳酸镁等在药物生产中功能明确的惰性载体。已知多种递送系统可用于本发明的治疗剂的给药，包括用脂质体包囊、微粒、微囊、纳米颗粒和纳米胶囊等。

在另一个优选的实施方式中，含小干扰RNA或其前体或衍生物的治疗剂可以制成中性或盐的形式。药学可接受的盐包括与游离氨基基团形成的盐，诸如从盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等衍生的盐，以及与游离羧基基团形成盐诸如衍生于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因或类似物的盐。

本发明的治疗量是指根据疾病和病情的性质，对一种特定失调或病情是有效的量，这可以用在药物给药方面已经明确的标准临床技术确定。所用制剂的精确的剂量也有赖于给药途径、疾病或病情的严重程度，应当根据操作者的判断以及患者的需求确定。颅内给药剂量的适当范围通常大约为每毫升10³～10¹⁵感染单位的病毒载体，单次注射1～3000毫升。每毫升中载体感染单位的加入量通常含有大约10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴感染单位病毒载体，在大约10、50、100、200、500、1000或2000毫升中递送。有效剂量可以由体外或体内试验系统用量效关系曲线推定。

用本发明的小干扰RNA载体治疗神经退行性疾病，可以给特定患者植入具有通路端口的多个导管来完成全程治疗。在一个优选的实施方式中，每个大脑或小脑半球有一个或几个端口和导管系统。一旦神经外科医生完成植入，患者的神经内科医生就可以进行常规治疗，该治疗由在几周到几个月的时间段重复静脉推注小干扰RNA表达载体，以及随着时间监测治疗效果组成。在整个疗程中，该装置可保持植入几个月或几年。在确认治疗有效后，通路端口可选择性地拔除，导管可以封闭并放弃或者拔除。装置的材料应不会干扰磁共振成像，并且，当然，小干扰RNA制剂必须与通路端口和导管的材料以及任何表面涂层相兼容。

除非特别限定，本文中的科学术语和技术术语及命名法具有与本发明所涉及领域的普通技术人员通常的理解相同的含义。通常，细胞培养、感染、分子生物学方法的流程等是本领域常用的方法。这些标准技术可见于参考手册诸如Sambrook et al.(1989，MolecularCloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor.Laboratories)和Ausubel et al.(1994，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，N.Y.)。

构建siRNA表达质粒和/或病毒载体所用的聚合酶链式反应(PCR)按照已知技术实施，见例如美国专利号4,683,195；4,683,202；4,800,159和4,965,188(所有这三篇美国专利公开专利文献以引文形式并入本文)。通常，PCR涉及在杂交条件下，用待测特定序列每一条链的一条寡核苷酸引物处理核酸样品(如在热稳定DNA聚合酶存在时)。每一引物合成的延伸产物与两条核酸链中的每一条互补，该引物和具有特定序列的每条链充分互补、杂交。从每条引物合成的延伸产物还可以作为模板，用相同的引物进一步合成延伸产物。延伸产物的合成经足够的循环数之后，分析样品以测定待测序列是否存在。可以在电泳后，用溴化乙锭染色使DNA可见，以检测扩增序列，或按照现有技术使用可检测标签来等方法检测。PCR技术的综述见PCR Protocols，A Guide to Methods and Amplifications，Michael et al.Eds，Acad.Press，1990。

装置

本发明还提供了使用前述的小干扰RNA，递送小干扰RNA到脑部靶位的装置、系统和方法。可预见的递送途径是通过使用植入的、内在的脑实质内导管，它能提供途径直接注射含AAV或其它载体的小体积液体到局部脑组织的途径。这些导管的近端可以连接到一个植入的、外科方法固定在患者脑内的颅内通路端口，或者连接到位于患者躯干的植入性的药物泵。

本发明范围的递送装置的例子包括8506型实验器械(麦德托尼克公司，明尼阿波利斯，明苏里达州)，它能皮下植入在颅骨上，提供一个通路端口，治疗药物可以通过它被递送给脑。递送通过一个通过立体定向植入的聚氨酯导管来实现。图4和图5示意性地描述了8506型实验器械。能在8506型实验器械通路端口工作的两种型号的导管包括：8770型脑室导管(麦德托尼克公司)，用于递送到脑室，公开于美国专利6,093,180，在此以引文形式并入本文；以及IPA1导管(麦德托尼克公司)，用于递送到脑组织本身(脑实质内递送)，公开于美国专利09/540,444和09/625,751，在此以引文形式并入本文。后者导管在远端具有多个出口以便沿导管方向的多个位置递送治疗药物。

在接入和放置过程中，优选放置某些器件来定位导管远端。优选在远端使用接入和放置过程中能被检测到的标记物。如果接入和定位使用某种形式的x射线放射完成的，则标记物优选为射线不能透过的。射线不能透过的标记物至少是远端尖部的一部分x射线不能透过，使尖端在接入和放置过程中通过荧光镜或通过x线能被观察到。

在一个有优势的实施方式中，该射线成像标记物包括钽份，它分散在由生物相容性粘合剂(诸如如上讨论的)组成的基质中。其他可能适合作为射线成像标记物的材料诸如钡或铂材料。通常，射线成像标记物需要预先浇铸在导管远端尖部。

选择性地，放射成像标记物可以选择那些具有足够放射浓度以便在成像过程中可视，而在导管尖端铸造时以粉状形式分散在导管远端尖部的材料。

可选择地，标记物还可以由与核磁共振成像(MRI)相兼容的材料组成以便远端尖部在MRI扫描时可被检测到。这种标记物优选的材料是铂，而钡、钽以及相似的材料也可用。不管是否使用放射成像或MRI，提供这种成像标记物的目的是使术者能精确地检测到尖端的确切位置，有助于放置以及以后验证导管远端的完整性和位置。

除了上述装置，根据本发明的小干扰RNA载体的递送也可以用包括但不限于美国专利5,735,814、5,814,014和6,042,579的多种装置完成。所有这些在此以引文形式并入本文。采用本发明，本技术领域的技术人员可以认识到这些以及其它的装置和系统都可以适合递送本发明的小干扰RNA载体来治疗神经退行性疾病。

在一个优选的实施方式中，该方法还包括在脑外植入泵的步骤，该泵与导管的近端相耦联，操纵泵即可通过导管的排出部位递送预定剂量的至少一种小干扰RNA或小干扰RNA载体。进一步的实施方式还包括周期性地为脑外泵更新至少一种小干扰RNA或RNA载体的供给的进一步步骤。脑内预定位置可以通过多种方法定位，例如，对于某些应用，靶区可以通过立体排列方式或大体解剖图谱来定位。在其它实施方式中，当靶区的精确定位非常关键时，例如，当至少部分可逆性基因治疗系统被递送到患者脑内时，可以采用其它定位方法。这些定位方法包括，但不限于，正电子发射体层显像和单光子发射计算机断层显像(分别是PET和SPECT)、药理学磁共振成像(phMRI)、功能性MRI(fMRI)和对照增强计算机化成像(CT)扫描。

在另外一个实施方式中，基于计算机辅助图谱的功能神经手术方法学可用来准确和精确地注射本发明的至少部分可逆性基因治疗系统。这些方法学允许对脑结构的三维显示和实时操纵。因此，在三维正交定向多脑图谱相互预登记的神经外方案是可能的，可提高神经毒素的注射或植入靶位界限的精确度，通过减少手术泳道的数目减少手术过程的时间，有助于设计更为复杂的轨道。见如Nowinski W.L.et al.，Computer-Aided StereotacticFunctional Neurosurgery Enhanced by the Use of the Multiple Brain Atlas Database，IEEE TransMed Imaging 19(1)；62-69：2000.

在另外一个实施方式中，定位方法还容许术中验证导管远端的放置。例如，导管远端的放置的验证可以通过术中使用过MRI实施，MRI可使用术中MR成像导向系统通诸如 iMRI Navigation Suite或与之相当的系统。

在另外一个例子中，在接入和放置过程中定位远端的方法是：使用暂时性地附着到导管近端部分或外科医生正在使用的将导管插入到患者脑内的手术仪器上的红外光反射小球。手术室中的红外照相机安放在手术台附近，发射和追踪从这些小球反射的红外信号。检测到的反射使得软件和计算机系统(诸如能够计算和显示导管远端的位置，在术中实时地叠加到之前捕获的、该具体患者的MRI成像。(这是可能的，因为该导管的远端和该导管近端为已知的线性距离，而红外光反射球就是暂时附着在近端的)。

在另外一个实施例中，在接入和放置过程中定位远端的方法是：使用暂时性地附着到导管近端部分或外科医生正在使用的将导管插入到患者脑内的手术仪器上的红外发射发光二极管(LED)。手术室中的红外照相机安放在手术台附近，发射和追踪从这些LED发射的的红外信号。检测到的反射使得软件和计算机系统(诸如)能够计算和显示导管远端的位置，在术中实时地叠加到之前捕获的、该具体患者的MRI成像。(这是可能的，因为该导管的远端和该导管近端为已知的线性距离，而LED就是暂时附着在近端的)。

不管是使用被动反射的红外光还是使用主动发射的红外光来计算导管的位置或术者所用的将导管插入患者脑内的手术仪器的位置，使用红外三角法的目的是使术者精确地测定尖端的确切位置，帮助放置和在术中验证导管远端的完整性和位置。

因此，本发明包括使用可植入性泵和导管递送小干扰RNA载体，如美国专利5,735,814和6,042,579所揭示的，并且还使用传感器作为注入系统的一部分来调节递送到脑的小干扰RNA载体的量，如美国专利5,8、14,014所揭示。根据本发明的方法，还可使用例如美国专利申请号09/872,698(2001年1月1日提交)和申请号09/864,646(2001年5月23日提交)中所公开的其他装置和系统，在此以引文形式并入本文。

综上，本发明提供了递送小干扰RNA载体到人中枢神经系统的方法，因此可通过减少神经元内致病蛋白的产生来治疗神经退行性疾病。

本发明旨在治疗神经退行性障碍和/或疾病，包括帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、亨廷顿氏舞蹈症、1型、2型和3型脊髓小脑性共济失调，和/或任何由致病性蛋白产生而引起或加重的神经退行性疾病，或由任何其它突变蛋白获得新的致病性功能而引起的神经退行性疾病。

实施例

实施例1

靶向人1型共济失调蛋白mRNA的小干扰RNA的构建

作为本发明实施方式的一个实施例，我们制成了一种靶向人1型共济失调蛋白mRNA的小干扰RNA。该小干扰RNA可减少细胞培养物中人细胞中人1型共济失调蛋白mRNA的量。作为1型脊髓小脑性共济失调症(SCA1)的治疗手段，使用植入的通路端口和导管，同样的小干扰RNA或类似的小干扰RNA将被递送到患者脑部的小脑细胞。结果是这些细胞中的1型共济失调蛋白量的减少，因此减缓或阻滞了患者SCA1病的进展。

抗人1型共济失调蛋白的小干扰RNA基于人1型共济失调蛋白核酸序列构建。人1型共济失调蛋白核酸序列从NCBI提供的公开的核酸数据库检索，NCBI检索登录号为NM_000332(SEQ ID NO：15)。人1型共济失调蛋白mRNA序列的一部分被鉴定为小干扰RNA裂解的潜在位点，并通过MFOLD分析预测为单链的。在登录号NM_000332(SEQ IDNO：15)中，构建了三对抗1型共济失调蛋白的siRNA靶点：

1.靶向1型共济失调蛋白mRNA序列945～965位的抗1型共济失调蛋白siRNA：

SEQ ID NO：1：5′-AACCAAGAGCGGAGCAACGAA-3′

SEQ ID NO：2：3′-GGTTCTCGCCTCGTTGCTTAA-5′

2.靶向1型共济失调蛋白mRNA序列1671～1691位的抗1型共济失调蛋白siRNA：

SEQ ID NO：3：5′-AACCAGTACGTCCACATTTCC-3′

SEQ ID NO：4：3′-GGTCATGCAGGTGTAAAGGAA-5′

3.靶向1型共济失调蛋白mRNA序列2750～2770位的抗1型共济失调蛋白siRNA：

SEQ ID NO：5：5′-AAGCAACGACCTGAAGATCGA-3′

SEQ ID NO：6：3′-CGTTGCTGGACTTCTAGCTAA-5′

设计了一系列的6个脱氧寡核苷酸片段，从MWG Biotech公司定制并购买，寡核苷酸合成定制服务提供的6个片段组成了三个靶位点。另外，这些寡核苷酸构建时还包括和T7启动子引物(包括在siRNA构建试剂盒中，Ambion公司。货号1620)5’末端互补的8个碱基序列。每个特异性寡核苷酸都与所提供的T7启动子引物退火，用Klenow片段补平，产生用以转录成RNA的全长DNA模板。通过体外转录反应生成了两种体外转录RNA(其一是另外一个的反义RNA)，然后彼此杂交产生双链RNA。该双链RNA产物用DNA酶(以去除DNA转录模板)和RNA酶(以削平双链RNA末端)处理、柱纯化以提供该三种siRNA，这三种siRNA被递送入细胞并在其中检测。

实施例2

靶向人1型共济失调蛋白mRNA的小干扰RNA的递送

所构建的如实施例1所述的siRNA分子1-3转染到HEK293细胞。收获转染细胞产生的RNA，分析以测定人1型共济失调蛋白mRNA的量。

图1显示定量逆转录酶聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析HEK293H细胞培养物中每微克总RNA中1型共济失调蛋白信使RNA(mRNA)的量的结果。分析了四个细胞群。第一个细胞群是被抗GAPDH(一种与1型共济失调蛋白mRNA表达没有已知的相关性的“管家基因”)的siRNA瞬时转染的293H细胞(抗GAPDH siRNA作为标准对照，siRNA制备和检测商业试剂盒，Ambion，Inc.提供)。第二个细胞群是被抗1型共济失调蛋白mRNA(抗1型共济失调蛋白mRNA序列1671位)的siRNA瞬时转染的293H细胞。第三个细胞群是被含有抗1型共济失调蛋白mRNA的核酶(该核酶在1型共济失调蛋白mRNA序列的第1364位裂解1型共济失调蛋白mRNA)的质粒瞬时转染的293H细胞。第四个细胞群是被含有抗1型共济失调蛋白mRNA第0945位的siRNA瞬时转染的293H细胞。转染48小时后，同时收获所有细胞群得到总细胞RNA。

在照片中的凝胶上，RT-PCR反应扩增的DNA产物被凝胶电泳按分子大小分离，可以看出是不同浓度的条带。所述的每个细胞群都采用一系列平行反应分析，显示为每个凝胶上部或下部的一组泳道。每一组泳道包括每个泳道的两条带。上面一条带是加入到反应中的已知量的DNA的DNA扩增产物，它和由细胞mRNA逆转录而来的内源性cDNA竞争。如果在某一泳道的条带的具有相同的浓度，则可以推断原始细胞样本中的细胞mRNA的量与加入到反应管中的已知量的DNA的量相同。泳道从左到右，加入的DNA标准品的量是减少的，显示是皮克级的量。该分析可以通过观察该组泳道来解释，该组泳道中，条带的浓度从DNA标准品最亮到位于其下的细胞产物最亮“跨越”，表示此时DNA标准品的量比细胞mRNA低了。

如图1所示的凝胶，上面一组泳道来源于用抗1型共济失调蛋白mRNA的核酶转染的细胞。将来自细胞样本的条带和来自DNA标准品的条带相比较，表明这些细胞中1型共济失调蛋白mRNA的量为0.505皮克到0.303皮克之间/微克总细胞RNA。下面一组泳道来源于用抗1型共济失调蛋白第0945位的siRNA转染的细胞。对这些泳道的分析表明，这些细胞中1型共济失调蛋白mRNA的量为0.303皮克到0.202皮克之间/微克总细胞RNA。

如图2所示的凝胶，上面一组泳道来源于用对照用抗GAPDH的siRNA转染的细胞。对这些泳道的分析表明，这些细胞中1型共济失调蛋白mRNA的量为0.711皮克到0.400皮克之间/微克总细胞RNA。最后，下面一组泳道来源于用另一抗1型共济失调蛋白第1671位的siRNA转染的细胞。这些泳道表明1型共济失调蛋白mRNA的量为0.404皮克到0.303皮克之间/微克总细胞RNA。

总之，具体分析结果如下：

表2抗1型共济失调蛋白的siRNA对细胞培养物中1型共济失调蛋白mRNA表达的影响

这些数据显示抗1型共济失调蛋白的siRNA AT1671和AT0945，在转染后48小时，对于减少细胞中的1型共济失调蛋白mRNA的量都是有效的，并且siRNA对于减少1型共济失调蛋白mRNA比抗-1型共济失调蛋白的核酶更加有效。

应当注意，用于本发明的治疗的小干扰RNA的示例性的构建方法(即通过体外转录产生的寡核苷酸组装和杂交)只是制备该治疗性小干扰RNA的可能的手段之一。亦可使用其它生产用于人类患者治疗的临床级别的和临床数量的更大规模、更为有效的方法而不会改变本发明的主旨或偏离由所附的权利要求定义的本发明的精神和范围。

实施例3

使用小干扰RNA等位基因特异性减少1型共济失调蛋白的表达

在杂合体患者中，如果单核苷酸多态性(SNP)在突变体与正常长度的等位基因中有所不同，那么适合的siRNA则可以选择性地仅仅降低突变的等位基因的表达。我们已经采用自SCA1起始密码下游的第+927位(见登录号NT_007592)SNP等位基因特异性RT-PCR检测了293、DAOY、SK-N-SH和HeLa细胞。HeLa细胞表达927C而不是927T等位基因，而293细胞则表达927T而不是927C等位基因，DAOY和SK-N-SH细胞则表达两种等位基因变异体。我们以该位点为中心，已经生成了等位基因特异性siRNA。用这些siRNA对内源性SCA1mRNA变异体等位基因特异性抑制的检测结果将被给出。

实施例4

小干扰RNA病毒载体的构建

构建了选择性报告质粒pAAV-U6-Tracer来克隆siRNA(见图3)。构建的质粒pAAV-U6-Tracer含有腺相关病毒的反向末端重复序列(ITR)、U6RNA聚合酶III启动子侧翼区(来自pSilencer，Ambion)、EF1启动子、绿色荧光蛋白、Zeocinr抗性基因和SV40polyA(来自pTracer，Invitrogen)。克隆的基因片段如图3所示。表达siRNA的寡核苷酸被克隆到紧接U6RNA聚合酶III启动子下游3’端的多克隆区域。

HEK293细胞用pAAV-siRNA、pHelper和pAAV-RC共转染，得到病毒生产细胞，其中pAAV-RC和pHelper质粒是这三个质粒AAV生产系统的一部分(Avigen公司)。在培养基中生长的293生产细胞用于分离重组病毒，该病毒用来转染二级细胞：HeLa细胞、DAOY细胞和SK-N-SH细胞。

实施例5

注射序列为SEQ ID NO：24的siRNA局部显著地降低HD mRNA的量

为了证实如上公开的siRNA序列在体内是有效的，给恒河猴注射3×10¹¹含AAV载体的病毒颗粒，该AAV载体包含序列如表3所示的SEQ ID.NO：24或SEQ.ID.NO：25序列的siRNA或对照siRNA，对照siRNA由CMV启动子调控的GFP序列上游的U6启动子调控。

表3 抗HD mRNA的siRNA序列

表4 试验设计

亨廷顿蛋白(HD)mRNA和蛋白自组织环切块或自组织切片激光微束切割的(LMD)细胞分离，分别用qRT-PCR或蛋白质印迹法(Western blot)定量。

注射含有序列SEQ ID NO：24的siRNA载体引起动物1在表达GFP的表达在壳核部位与同一半球(右侧)非GFP表达壳核部位相比，HD mRNA减少了37％(用qRT-PCR测定组织环切块)。

同一动物的左半球，GFP表达区域与非GFP表达区域相比，HD mRNA的量减少了65％～70％用(qRT-PCR测定LMD切片)。

另外，siRNA治疗效果是半球特异性的。在动物2中观察到右半球(注射含序列SEQ IDNO：24的载体)的GFP表达区与左半球(注射了含对照siRNA的载体)的GFP表达区相比，HD mRNA显著下降。

因此，这些数据显示含SEQ ID NO：24序列的siRNA的病毒构建体，可以局部地、显著地减少HD mRNA的量。

实施例6

注射序列为SEQ ID NO：24的siRNA不会导致大的解剖学异常，也不会损害转导细胞的内质网

动物按照前述实施例的方案注射。用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白，苏木精伊红(H&E)染色、荧光显微镜检测亨廷顿蛋白免疫染色，免疫染色法检测钙联蛋白，免疫染色法检测蛋白质二硫键异构酶(PDI)，进行组织病理学分析。这些研究结果显示HD抑制不会引起注射部位任何可检测的神经解剖学异常。病毒转导区可观察到外周血管成套的证据，但是这种成套与HD抑制没有相关性。另外，钙联蛋白和PDI染色没有显示转导细胞内质网的任何明显改变。

实施例7

注射序列为SEQ ID NO：24的siRNA不会改变自发活动并趋向改善精细自主活动(finelocomotor activity)

动物按照实施例5的方案注射。自发活动和精细运动行为(fine motor activity)分别用Etho Vision和mMAP仪测定。Etho Vision是一种商业化的视觉追踪系统(Etho Vision Pro，version 2.2，Noldus Information Technologies，Asheville，NC)，可以测定观察时段内动物运动的距离(cm)和整个身体的运动速度(cm/sec)。mMAP仪(称自动猴运动分析仪mMAP)是一种用于客观测定恒河猴在从容器室内的平板上拿取食物时小手肌的精细运动时间。

尾状核和壳核HD的抑制不会引起动物自发活动的改变。任何动物的精细自主活动也未受到损害。另外，病毒注射后，所有动物的精细运动技巧都趋向改善。

虽然本发明参考特别实施方式进行了描述，可以理解，这些实施方式都只是对本发明的原则和应用的举例说明。因此应当理解，可以对这里举例说明的实施方式进行大量的改变和设计其它排列，均不会偏离由权利要求定义的本发明的精神和范围。

说明书中引用的所有文献，包括专利文献和非专利文献，都代表着本发明相关的技术领域的技术人员的技术水平。所有这些文献在此全文以引文形式并入本文，其程度相当于每一篇文献都具体地、个别地指出作为文献并入本文。

序列表

<110>美敦力公司

<120>通过颅内递送SIRNA治疗亨廷顿氏舞蹈症的组合物、装置和方法

<130>P11089.17

<140>UNASSIGNED

<141>2007-08-08

<150>US11/501,147

<151>2006-08-08

<150>US10/721,693

<151>2003-11-25

<150>US60/444,614

<151>2003-02-03

<150>US10/852,997

<151>2004-05-25

<160>25

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>3

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>4

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>5

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>6

<210>7

<211>145606

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(145606)

<223>LOCUS AF163864 145606bp DNA linear P

RI24-JAN-2001

DEFINITION Homo sapiens SNCA isoform(SNCA)gene，...

ACCESSION AF163864

<300>

<308>AF163864

<309>2001-01-24

<313>(1)..(145606)

<400>7

<210>8

<211>4349

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(4349)

<223>LOCUS DRPLA 4349bp mRNA linear P

RI 13-MAY-2002

DEFINITION Homo sapiens dentatorubral-pallidoluysian atrophy(at

rophin-1)

         (DRPLA)，mRNA.

ACCESSION XM_032588

<300>

<308>XM_032588

<309>2002-05-13

<313>(1)..(4349)

<400>8

<210>9

<211>13994

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(13994)

<223>LOCUS SEG_HUMHD 13994bp DNA linear P

     RI12-FEB-2001

     DEFINITION Homo sapiens huntingtin(HD)gene.

     ACCESSION  AH003045REGION：316..14309

     VERSION    AH003045.1 GI：663286

<300>

<308>L27350

<309>2001-02-12

<313>(1)..(614)

<400>9

<210>10

<211>118777

<212>DNA

<213>Mus musculus

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(118777)

<223>LOCUS AF163865 118777bp DNA linear R

     OD24-JAN-2001

     DEFINITION Mus musculus alpha-synuclein(Snca)gene，complete cd

     s.

     ACCESSION AF163865

<300>

<308>AF163865

<309>2001-01-24

<313>(1)..(118777)

<400>10

<210>11

<211>4047

<212>DNA

<213>Mus musculus

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(4047)

<223>LOCUS Drpla 4047bp mRNA linear R

     OD 16-MAY-2002

     DEFINITION Mus musculus dentatorubral pallidoluysian atrophy(Dr

     pla)，mRNA.

     ACCESSIONXM_132846

<300>

<308>XM_132846

<309>2002-05-16

<313>(1)..(4047)

<400>11

<210>12

<211>10033

<212>DNA

<213>Mus musculus

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(10033)

<223>LOCUS MMU24233 10033bp mRNA linear R

OD 18-JUL-1995

DEFINITION Mus musculus huntingtin(Hd)mRNA，complete cds.

ACCESSION U24233

<300>

<308>U24233

<309>1995-07-18

<313>(1)..(10033)

<400>12

<210>13

<211>3616

<212>DNA

<213>Mus musculus

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3616)

<223>LOCUS Sca1 3616bp mRNA linear R

     OD07-JAN-2002

     DEFINITION Mus musculus spinocerebellar ataxia1homolog(human)

     (Sca1)，mRNA.

     ACCESSION NM_009124

<300>

<308>NM_009124

<309>2002-01-07

<313>(1)..(3616)

<400>13

<210>14

<211>1543

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1543)

<223>LOCUS SNCA 1543bp mRNA linear P

RI05-NOV-2002

DEFINITION Homo sapiens synuclein，alpha(non A4 component of am

yloid

precursor)(SNCA)，transcript variant NACP140，mRNA.ACCESSION

NM_000345：

VERSION NM_000345.2 GI：6806896

<300>

<308>NM_000345

<309>2002-11-05

<313>(1)..(1543)

<400>14

<210>15

<211>10660

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(10660)

<223>LOCUS SCA1 10660bp mRNA linear P

RI 31-OCT-2000

DEFINITION Homo sapiens spinocerebellar ataxia 1(olivopontocere

bellar ataxia

1，autosomal dominant，ataxin1)(SCA1)，mRNA.

ACCESSION NM_000332

<300>

<308>NM_000332

<309>2000-10-31

<313>(1)..(10660)

<400>15

<210>16

<211>1900

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1900)

<223>LOCUS MJD 1900bp mRNA linear P

     RI31-JUL-2002

     DEFINITION Homo sapiens Machado-Joseph disease(spinocerebellar

     ataxia 3，

        olivopontocerebellar ataxia 3，...

ACCESSION NM_004993

<300>

<308>NM_004993

<309>2002-07-31

<313>(1)..(1900)

<400>16

<210>17

<211>1735

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1735)

<223>LOCUS MJD 1735bp mRNA linear P

     RI31-JUL-2002

     DEFINITION Homo sapiens Machado-Joseph disease(spinocerebellar

     ataxia 3，

     olivopontocerebellar ataxia 3，autosomal dominant，at

     axin 3)(MJD)...

ACCESSION NM_030660

<300>

<308>NM_030660

<309>2002-07-31

<313>(1)..(1735)

<400>17

<210>18

<211>5832

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(5832)

<223>ACCESSION NM_012104

     VERSION NM_012104.2 GI：21040369

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(5832)

<223>LOCUS BACE 5832bp mRNA linear PRI 05-NOV-2002

     DEFINITION Homo sapiens beta-site APP-cleaving enzyme(BACE)，tr

     anscript

     variant a，mRNA.

<300>

<308>NM_012104

<309>2002-11-05

<313>(1)..(5832)

<400>18

<210>19

<211>5757

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(5757)

<223>LOCUS BACE 5757bp mRNA linear P

     RI 05-NOV-2002

     DEFINITION Homo sapiens beta-site APP-cleaving enzyme(BACE)，tr

     anscript

     variant b，mRNA.

     ACCESSION NM_138972；VERSION NM_138972.1 GI：21040365

<300>

<308>NM_138972

<309>2002-11-05

<313>(1)..(5757)

<400>19

<210>20

<211>5700

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(5700)

<223>LOCUS BACE 5700bp mRNA linear P

     RI 21-MAY-2002

     DEFINITION Homo sapiens beta-site APP-cleaving enzyme(BACE)，tr

     anscript

     variant c，mRNA.

     ACCESSION NM_138971；VERSION NM_138971.1 GI：21040363

<300>

<308>NM_138971.1

<309>2002-05-21

<313>(1)..(5700)

<400>20

<210>21

<211>5625

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(5625)

<223>LOCUS BACE 5625bp mRNA linear P

     RI 05-NOV-2002

     DEFINITION Homo sapiens beta-site APP-cleaving enzyme(BACE)，tr

     anscript

     variant d，mRNA.

     ACCESSION NM_138973；VERSION NM_138973.1 GI：21040367

<300>

<308>NM_138973

<309>2002-11-05

<313>(1)..(5625)

<400>21

<210>22

<211>3880

<212>RNA

<213>Mus musculus

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3880)

<223>LOCUS Bace 3880bp mRNA linear R

     OD 07-JAN-2002

     DEFINITION Mus musculus beta-site APP cleaving enzyme(Bace)，mR

     NA.

     ACCESSION NM_011792；VERSION NM_011792.2GI：6857758

<300>

<308>NM_011792

<309>2002-01-07

<313>(1)..(3880)

<400>22

<210>23

<211>1096

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1096)

<223>LOCUS SNCA 1096bp mRNA linear P

     RI 05-NOV-2002

     DEFINITION Homo sapiens synuclein，alpha(non A4 component ofam

     yloid

     precursor)(SNCA)，transcript variant NACP112，mRNA.ACCESSION

NM_007308：

VERSION NM_007308.1 GI：6806897

<300>

<308>NM_007308

<309>2002-12-05

<313>(1)..(1096)

<400>23

<210>24

<211>19

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>24

<210>25

<211>19

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>25