一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒，特别是涉及使用DNA反向斑点杂交技术，快速准确地区分临床血液样品中野生型和(或)核苷类似物耐药相关突变型乙型肝炎病毒的检测试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)是引起病毒性肝炎的主要病原体。由HBV所引起的乙型肝炎是一种危害严重的传染性疾病。目前，全世界慢性HBV感染者至少有3.5亿，而中国作为乙型肝炎的高发流行区，约占总人口9％左右的人群(约1.2亿)为慢性HBV感染者。持续慢性HBV感染在临床上可表现为各种不同类型的疾病，包括无症状携带状态、急或慢性肝炎、肝硬化等，严重的可能发展为原发性肝癌(HCC)。目前全世界每年有120万人死于HBV感染引起的疾病。。

研究证明，持续高载量HBV是慢性乙肝病情进展和发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC)的主要病因，因此慢性乙肝的治疗应着手于长期抑制或清除病毒。目前用于抗HBV治疗的药物有干扰素和核苷类似物两大类，核苷类似物则是近年发展最快的抗病毒药物。截至目前，美国FDA批准可用于治疗乙肝的核苷类似物药物主要有拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定和依曲西他平，克拉夫定仍处于试验阶段，临床一线药物以拉米夫定、阿德福韦和恩替卡韦为主。

据研究，大部分乙型肝炎病毒中耐药突变主要集中在病毒DNA聚合酶序列，其中在不同药物的选择压力下产生的耐药突变不尽相同，简述如下：

拉米夫定(LAM)耐药突变主要集中在病毒DNA聚合酶的酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基序，表现为编码甲硫氨酸的核苷酸发生碱基替代(ATG→ATT/GTG)，从而使其编码的氨基酸发生相应的变化(M→I/V，rtM204I/V)。阿德福韦(ADV)耐药集中在HBV多聚酶D区N236T和B区A181V等位点，rtV173L位点变异也对阿德福韦耐药产生一定的协同作用；同时，据报道发现一例rtA181S变异与阿德福韦耐药相关，rtA181S+N236T联合变异对拉米夫定与阿德福韦联合治疗敏感性较差。根据目前的资料证明，在YMDD突变基础上，加上以下耐药突变位点：T184G、S202I、M250V之一，即可发生恩替卡韦(ETV)耐药。因此，ETV的耐药突变只发生在LAM耐药的患者中，提示ETV治LAM耐药的患者，有可能发生ETV耐药突变。替比夫定(LdT)在治疗过程中，亦可出现YMDD突变耐药，治疗52周后，出现突变耐药率为2/44(4.5％)，主要突变表型为M204I和L180M+M204V，与LAM有交叉耐药。据报道依曲西他平(FTC)治疗48周后，YMDD突变耐药率达12.6％，与LAM交叉耐药。

目前国内外的乙型肝炎病毒耐药基因突变检测试剂盒检测的变异位点一般为rtL180M、rtA181V、rtM204V和rtN236T等与拉米夫定及阿德福韦耐药相关位点，虽然也能覆盖部分乙肝耐药患者群，但存在一定的漏检率，并且不能检测恩替卡韦耐药突变位点。本发明拟检测rtV173L、rtL180M、rtA181V、rtA181S、rtT184G、rtS202I、rtM204V/I、rtI233V、rtN236T和rtM250V等几乎涵盖目前已知所有能引起核苷类似物药物耐受性核苷酸变异位点，并且能较准确的检测出野生型和耐药突变型混合感染，劣势型在混合群体中占10％即可检出；设计出一种能在短时间内系统、全面的检测和分析乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒。

目前耐药突变的检测方法主要有以下几种：质谱分析，荧光偏振，PCR-肽核酸，限制性片段长度多态方法RFLP，线性探针分析法，荧光定量PCR熔解曲线分析法和基因芯片技术。然而，这些方法大多成本昂贵，操作繁琐，不利于广大基层医院开展。因此，本发明人在前期的研究成果的基础上(CN200410052531.1)，结合半自动的结果判读系统，建立一种能够在短时间内检测和分析乙型肝炎病毒多种核苷类似物药物耐受突变基因型的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒，特别是涉及使用DNA反向斑点杂交技术，快速准确地区分临床血液样品中野生型和(或)核苷类似物耐药相关突变型乙型肝炎病毒的检测试剂盒。

试剂盒的检测步骤如下：(1)提供待检标本并从中提取DNA；(2)使用合成的特定寡核苷酸引物，利用聚合酶链反应技术扩增包含目的基序的一段靶DNA序列；(3)使被标记的靶DNA序列与特异性寡核苷酸探针杂交；(4)杂交膜条经显色后，扫描结果并用软件分析并判断乙型肝炎病毒耐药突变的存在及其相对量。

为了达到上述检测步骤，本发明提供的乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒的组分，包括：(1)提取样本核酸的核酸抽提试剂；(2)聚合酶链反应试剂，阴、阳质控品；(3)用于核酸杂交反应的核酸杂交试剂、杂交膜条，其中聚合酶链反应试剂由正向引物、生物素标记的反向引物、脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、耐热Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG酶)组成，其特征在于正向引物和生物素标记的反向引物的序列分别是：

(1)5’-TAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCARTTT-3’(SEQ ID NO：1)

(2)5’-TGGATGTRTCTGCGGCGTTT-3’(SEQ ID NO：2)

(3)生物素-5’-GCCTTRTAAGTTGGCGAG-3’(SEQ ID NO：3)

(4)5’-CGACGTGCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA-3’(SEQ ID NO：4)。

根据本发明的一个优选实施方案，所述引物为SEQ ID NO：1～4中15～28bp碱基范围内所有可能的碱基长度和位置组合。

根据本发明的一个优选实施方案，杂交膜条中用于核酸杂交的5′端氨基标记的寡核苷酸探针的序列分别是：

(5)NH₂-5’-TWCCTATGGGAGTGGGCCTCAGYCCG-3’(SEQ ID NO：5)

(6)NH₂-5’-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT-3’(SEQ ID NO：6)

(7)NH₂-5’-CGTTTCTCHTGGCTCAGTTTACTWGY-3’(SEQ ID NO：7)

(8)NH₂-5’-TGGCTCAGTTTACTWGYGCMATTTGT-3’(SEQ ID NO：8)

(9)NH₂-5’-GYYTGGCTTTYAGTTATATKGATGAY-3’(SEQ ID NO：9)

(10)NH₂-5’-GCTTTYAGYTATATGGATGATSTGGT-3’(SEQ ID NO：10)

(11)NH₂-5’-TRTCTBTGGGYATMCATTTRAAYMCY-3’(SEQ ID NO：11)

(12)NH₂-5’-TWCCTATGGGATTGGGCCTCAGYCCG-3’(SEQ ID NO：12)

(13)NH₂-5’-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT-3’(SEQ ID NO：13)

(14)NH₂-5’-CGTTTCTCHTGACTCAGTTTACTWGY-3’(SEQ ID NO：14)

(15)NH₂-5’-TGGCTCAGTTTGGTWGYGCMATTTGT-3’(SEQ ID NO：15)

(16)NH₂-5’-GYYTGGCTTTYATTTATATKGATGAY-3’(SEQ ID NO：16)

(17)NH₂-5’-GCTTTYAGYTATATHGATGATSTGGT-3’(SEQ ID NO：17)

(18)NH₂-5’-TRTCTBTGGGYGTGCATTTRAAYMCY-3’(SEQ ID NO：18)

(19)NH₂-5’-TCTBTGGGYAAYCATTTRAAYCCTMA-3’(SEQ ID NO：19)

(20)NH₂-5’-TCTBTGGGYACMCATTTRAAYCCTMA-3’(SEQ ID NO：20)

(21)NH₂-5’-CGTTTCTCHTGATTCAGTTTACTWGY-3’(SEQ ID NO：21)

(22)NH₂-5’-CCCTTAAYTTYATGGGHTAYRTNATY-3’(SEQ ID NO：22)

(23)NH₂-5’-CCCTTAAYTTYGTGGGHTAYRTNATY-3’(SEQ ID NO：23)

(24)NH₂-5’-GCTTTYAGYTATGTGGATGATSTGGT-3’(SEQ ID NO：24)

(25)NH₂-5’-ATTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTC-3’(SEQ ID NO：25)

以及5′端生物素标记和3′端氨基标记的用于监测杂交过程的显色对照寡核苷酸探针是：

(26)生物素-5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′-NH₂(SEQ ID NO：26)。

根据本发明的一个优选实施方案，所述探针为SEQ ID NO：5～26中15～26bp碱基范围内所有可能的碱基长度和位置组合。

根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待测样本指的是血清，血浆，腹水及肝组织中乙型肝炎病毒的任何一种已知变异体或者野生型和变异型的组合，或者是多种变异型的组合。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的提取样本核酸试剂是用3％～8％的聚乙二醇和1mol/L的氯化钠配制而成的浓缩液和常规DNA提取液组成。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸杂交试剂由杂交液I(2×SSC-0.1％SDS)和II(0.5×SSC-0.1％SDS)、溶液I(250u/ml偶联辣根过氧化物酶的链酶亲和素溶液)、II(0.1mol/L的柠檬酸钠溶液)、III(2mg/ml的四甲基联苯胺溶液)和IV(3％的过氧化氢溶液)组成。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的杂交膜条上所固定的探针能够检测乙型肝炎病毒基因组逆转录酶基因野生型的位点包括：rt173V、rt180L、rt181A、rt181A、rt184T、rt202S、rt204M、rt233L、rt236N和rt250M；突变型位点包括：rt173L、rt180M、rt181V、rt181S、rt184G、rt202I、rt204V/I、rt233V、rt236T和rt250V。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的杂交膜条为尼龙膜或硝酸纤维素膜，杂交是在恒温水浴装置中进行杂交反应，检测装置包括恒温水浴摇床或自动、半自动杂交仪。

由于本发明中增加了很多近期新发现的核苷类似物耐药相关突变位点，而且使这些位点同时分布在一张检测膜条上，因此本发明的试剂盒不仅能用于检测单一乙型肝炎病毒感染，更具有检测乙型肝炎病毒混合感染或多种联合突变的能力。另一方面，由于本发明的试剂盒使用水浴摇床进行检测，其操作简单、通量大、价格低廉，半自动杂交装置方便快捷、效率高、节省人力物力，两者均具有良好的应用前景和可推广性。特别是由于使用了设计严谨的核酸探针，使得核苷类似物耐药的乙型肝炎病毒检测具有更好的灵敏度和特异性。

为了实现本发明，详细步骤分述如下：

1.引物的设计和合成

为了特异、高效地扩增待检核酸样品中的目的基因，我们从Gene Bank中调A～H型乙型肝炎病毒全基因组DNA序列，针对乙型肝炎病毒逆转录酶基因在核苷酸类似物药物选择压力下易于变异的位点，按照引物设计的一般性原则，采用primer premier5.0和oligo6.0软件分别设计合成了巢式PCR所用的正向和反向引物，其中反向引物的5’端使用生物素标记。

(1)5’-TAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCARTTT-3’(SEQ ID NO：1)

(2)5’-TGGATGTRTCTGCGGCGTTT-3’(SEQ ID NO：2)

(3)生物素-5’-GCCTTRTAAGTTGGCGAG-3’(SEQ ID NO：3)

(4)5’-CGACGTGCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA-3’(SEQ ID NO：4)。

2.探针的合成和标记

针对乙型肝炎病毒逆转录酶基因在核苷酸类似物药物选择压力下易于变异的位点，设计并合成了21条探针和一条用于控制显色反应的显色探针(探针22，SEQ ID：24)，以其作为对照借以控制显色反应。为了保证各探针均能在同一温度下与特定的靶DNA成功地杂交，本发明设计了多条简并探针并且使探针的Tm值和GC含量严格控制在特定范围内。合成的探针经20％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并纯化后，用于后面的杂交反应。杂交反应中使用的寡核苷酸探针分别是：

(5)NH₂-5’-TWCCTATGGGAGTGGGCCTCAGYCCG-3’(SEQ ID NO：5)

(6)NH₂-5’-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT-3’(SEQ ID NO：6)

(7)NH₂-5’-CGTTTCTCHTGGCTCAGTTTACTWGT-3’(SEQ ID NO：7)

(8)NH₂-5’-TGGCTCAGTTTACTWGYGCMATTTGT-3’(SEQ ID NO：8)

(9)NH₂-5’-GYYTGGCTTTYAGTTATATKGATGAY-3’(SEQ ID NO：9)

(10)NH₂-5’-GCTTTYAGYTATATGGATGATSTGGT-3’(SEQ ID NO：10)

(11)NH₂-5’-TRTCTBTGGGYATMCATTTRAAYMCY-3’(SEQ ID NO：11)

(12)NH₂-5’-TWCCTATGGGATTGGGCCTCAGYCCG-3’(SEQ ID NO：12)

(13)NH₂-5’-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT-3’(SEQ ID NO：13)

(14)NH₂-5’-CGTTTCTCHTGACTCAGTTTACTWGT-3’(SEQ ID NO：14)

(15)NH₂-5’-TGGCTCAGTTTGGTWGYGCMATTTGT-3’(SEQ ID NO：15)

(16)NH₂-5’-GYYTGGCTTTYATTTATATKGATGAY-3’(SEQ ID NO：16)

(17)NH₂-5’-GCTTTYAGYTATATHGATGATSTGGT-3’(SEQ ID NO：17)

(18)NH₂-5’-TRTCTBTGGGYGTGCATTTRAAYMCY-3’(SEQ ID NO：18)

(19)NH₂-5’-TCTBTGGGYAAYCATTTRAAYCCTMA-3’(SEQ ID NO：19)

(20)NH₂-5’-TCTBTGGGYACMCATTTRAAYCCTMA-3’(SEQ ID NO：20)

(21)NH₂-5’-CGTTTCTCHTGATTCAGTTTACTWGY-3’(SEQ ID NO：21)

(22)NH₂-5’-CCCTTAAYTTYATGGGHTAYRTNATY-3’(SEQ ID NO：22)

(23)NH₂-5’-CCCTTAAYTTYGTGGGHTAYRTNATY-3’(SEQ ID NO：23)

(24)NH₂-5’-GCTTTYAGYTATGTGGATGATSTGGT-3’(SEQ ID NO：24)

(25)NH₂-5’-ATTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTC-3’(SEQ ID NO：25)

以及5′端生物素标记和3′端氨基标记的用于监测杂交过程的显色对照寡核苷酸探针是：

(26)生物素-5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′-NH₂(SEQ ID NO：26)。

3.杂交载体的制备

作为杂交载体的膜可以是由硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素等材料制成的膜，大小约为3.2cm×2.5cm，并用打印机打成3行x8列的格式。膜条使用前用10％的EDC(N-乙基-N’-[二甲基氨丙基]-碳二亚胺)溶液充分浸泡活化处理。新合成的探针(100pmol/μl)经稀释后，按每孔1.0μl在膜条的适当位置上以固定格式点样。点样后用NaOH溶液处理膜条并充分洗涤，然后保存于-20℃备用。

4.核酸的提取

无菌采集待检乙型肝炎病人的静脉血约1ml，分别于室温和4℃静置一段时间后，离心分离并收集血清标本。然后从中取适量血清样品，向其中加入等量DNA提取液，充分混匀并在沸水浴中放置10分钟，离心并收集上清液用于进一步PCR反应。

5.核酸扩增体系的优化

为了进一步提高试剂盒的灵敏度、特异性和重复性，我们对聚合酶链反应所用引物进行了反复设计和优选，对聚合酶链反应的体系进行了摸索与优化使之达到最佳的特异性与最高的扩增效率。结果发现，该方法可以使低拷贝数的样品DNA得到有效的扩增，其检测下限达到1×10³～5×10³IU/ml。同时，为了尽可能地减少污染，我们使用dUTP-UNG酶处理待检核酸。特别是，我们调整了PGR扩增中使用的引物和其浓度，并调整和优化了Mg²⁺和模板等其他反应物的浓度，也有利于防止和减少污染。

6.核酸杂交体系的优化

核酸杂交的操作过程包括：首先将如前制备的膜条放入编号好的15mlEP管中，然后对应地加入PCR产物与杂交液I的混合物在一定温度下进行杂交。通过对杂交体系、杂交液的摸索，使杂交反应达到最优化和最好的杂交效率。杂交完成后，经洗涤和显色步骤以显示杂交斑点的存在，并根据所显色斑点所在位置探针的不同来判断样本的基因突变。实验证明本发明中的检测试剂能检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药相关突变位点(rt173、rt180和rt204)、阿德福韦耐药相关突变位点(rt181A、rt233和rt236N)和恩替卡韦耐药相关突变位点(rt184、rt202和rt250M)。同时，本发明也可检测出生物样本中是否存在乙型肝炎病毒。另外，在发明实施过程中，通过摸索不同的杂交温度和探针浓度使检测的结果更准确可靠，并使之具有更好的重复性。

综上所述，本发明的试剂盒主要用于检测和鉴别野生型和耐核苷类似物突变型乙型肝炎病毒，借以判断乙型肝炎病毒对药物的耐受情况。整个检测过程包括提取血清样品中的HBVDNA、PCR扩增包含HBVDNA聚合酶rt173～rt250区域序列的靶DNA片断，以及PCR扩增产物的杂交等主要步骤。为了完成这些步骤，本发明的试剂盒又可分为PCR反应试剂盒和反向斑点杂交试剂盒两个部分。其中，前者包括核酸抽提试剂、聚合酶链反应试剂，阴、阳质控品(野生型和耐核苷类似物突变型HBV DNA质粒)。后者包括核酸杂交试剂以及杂交膜。杂交试剂主要为常规的20×SSC、十二烷基磺酸钠(SDS)、链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化酶结合物(POD)、四甲基联苯胺(TMB)，试剂盒组成包括杂交液I(2×SSC-0.1％SDS)、杂交液II(0.5×SSC-0.1％SDS)、溶液I(250u/mlPOD)、溶液II(0.1mol/L柠檬酸钠)、溶液III(2mg/mlTMB)、溶液IV(3％H₂O₂)，以及用作杂交反应载体的膜条。

附图说明

图1显示所使用的探针在膜条上的排列图。rt173V号探针具有SEQ ID NO：5所示的序列，rt180L号探针具有SEQ ID NO：6所示的序列，rt181A号探针具有SEQ ID NO：7所示的序列，rt184T号探针具有SEQ ID NO：8所示的序列，rt202S号探针具有SEQ ID NO：9所示的序列，rt204M号探针具有SEQ ID NO：10所示的序列，rt233I号探针具有SEQ ID NO：11所示的序列，rt173L号探针具有SEQ ID NO：12所示的序列，rt180M号探针具有SEQ ID NO：13所示的序列，rt181T号探针具有SEQ ID NO：14所示的序列，rt184G号探针具有SEQ ID NO：15所示的序列，rt202I号探针具有SEQ ID NO：16所示的序列，rt204I号探针具有SEQ ID NO：17所示的序列，rt233V号探针具有SEQ ID NO：18所示的序列，rt236N号探针具有SEQ ID NO：19所示的序列，rt236T号探针具有SEQ ID NO：20所示的序列，rt181S号探针具有SEQ ID NO：21所示的序列，rt250M号探针具有SEQ ID NO：22所示的序列，rt250V号探针具有SEQ ID NO：23所示的序列，rt204V号探针具有SEQ ID NO：24所示的序列，阳性控制探针(P.C)具有SEQ ID NO：25所示的序列，显色对照探针(C.C)具有SEQ ID NO：26所示的序列。

图2显示靶DNA扩增片段经2％的琼脂糖凝胶电泳图。其中第1-6泳道为从乙型肝炎病毒临床样本中扩增出的特异性靶DNA片段；第7为阴性对照。

图3显示六种不同的HBV基因型血清样品反向斑点杂交检测结果。其中：A：野生型；B：rt204I突变；C：rt204V突变；D：rt181T和rt236T突变；E：rt236T突变；F：rt180M、rt202I和rt204V突变。

图4为乙型肝炎病毒野生型和耐药突变型混合感染模拟实验及其灵敏度的确定。