一种药品、保健食品和食品中添加化学成分的快速检测系统及其检测方法

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例详细介绍本发明方法的具体实施过程，进一步阐述本发明。补肾壮阳类是非法添加的一类典型代表，添加情况比较严重。本实施方式以检测补肾壮阳类中成药、保健食品或食品中添加的化学成分为例，详细介绍本发明方法的具体实施过程，但本实施例仅作为本发明的示例而不对本发明做任何限定，本领域技术人员可以清楚地通过本实施例的描述了解本发明，并应用于其他类中成药、保健食品或食品中是否添加化学成分的快速检测。下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

建立补肾壮阳类中成药、保健食品和食品中添加化学成分的快速检测系统的基本步骤如下：

一、按照中成药、保健食品和食品的功能分类，建立常见添加化学成分的数据库

从造假售假分子的角度考虑，非法添加的化学成分应为那些短时间内有显著效果并且价格低廉的药物，最好现有标准无法检测；从药品监管的角度考虑，那些副作用较大、可能被添加的化学成分也应该重点关注。查阅国内外文献，补肾壮阳类样品中添加的化学成分绝大部分为西地那非、伐地那非和他达拉非及其衍生物等PDE₅型抑制剂；也有添加酚妥拉明、阿朴吗啡、育亨宾等化学成分的报道，但添加情况不多，因此以PDE₅型抑制剂作为非法添加的研究对象。美国食品药品管理局(FDA)先后批准了西地那非、伐地那非和他达拉非三种PDE₅型抑制剂，成为补肾壮阳类样品中添加最早和最频繁的化学成分。西地那非、伐地那非和他达拉非均属于处方药，服用时有严格的适应症、禁忌症和一定的副作用，某些病人不能服用，患者在不知情的情况下摄入容易引起严重的药物不良反应，甚至导致死亡。近年来，还发现了添加大量上述三种PDE₅型抑制剂的未知衍生物，这些化学成分未经过严格的安全性实验，存在着严重隐患。

国内外文献已经报道了二十多种PDE₅型抑制剂，本发明选择其中具有代表性的十一种PDE₅型抑制剂作为添加化学成分的基本数据库，建立补肾壮阳类中成药、保健食品和食品的快速检测系统。十一种PDE₅型抑制剂的化学名称和结构信息见表1。

表1

二、采用近红外光谱法快速筛查

近红外光谱技术在国内开始日趋普及，我国已经配备了近400辆药品检测车，每辆都配置了近红外光谱仪。由于近红外光谱具有无需样品预处理、不使用化学试剂、不破坏样品、分析速度快等优势，在条件允许和近红外光谱鉴别模型可行的情况下，应优先考虑应用该技术。

根据文献报道，国内目前补肾壮阳类样品添加频率最高的化学成分为西地那非，其次为他达拉非，涉及的剂型主要为硬胶囊剂，其次为片剂和丸剂。按照包装和剂型分别建立的近红外光谱分析模型准确性较高。结合收集样品的实际情况，本实施例选择建立西地那非和他达拉非胶囊剂的定性鉴别模型，片剂、丸剂等其他剂型的近红外光谱鉴别模型可采用类似的方法建立，具体步骤如下：

1.从市场收集59个不同厂家不同浓度的补肾壮阳类样品作为代表性样品建立参考样品库，包括中成药、保健食品和食品；

2.采集上述59个样品的近红外光谱：用德国Bruker公司的MPA和MATRIX-F型光谱仪分别采集近红外光谱，测量方式为光纤漫反射，透过胶囊壳测量样品，测定条件为分辨率8cm^-1，扫描次数32次，数据范围4,000至12,000cm^-1，检测器为铟镓砷，每个样品测量3次；

3.对上述59个样品进行液相色谱和液质联用分析，定性分析区分阴性样品和阳性样品，(本实施例定义添加了西地那非的样品为西地那非阳性样品，添加了他达拉非的样品为他达拉非阳性样品，未添加西地那非和他达拉非的样品称为阴性样品)；根据液相色谱和液质联用分析结果，参考样品的59个样品中西地那非阳性样品16个，他达拉非阳性样品17，阴性样品26个；

4.收集西地那非和他达拉非对照品，分别采集近红外光谱；

5.建立鉴别模型：采用Bruker公司OPUS软件的IDENT程序建立定性鉴别模型；

6.利用上述步骤5建立的鉴别模型对未知样品进行分析，检测样品中是否添加PDE₅型抑制剂。

7.检测结果为阳性的样品需要现场抽样，进一步用高效液相色谱法或液质联用法确证。

从市场收集305个不同厂家不同浓度的补肾壮阳类样品作为未知样品采用本实施例的方法进行检测，同时将这305个未知样品采用液相色谱和液质联用分析，将两种方法的检测结果进行比较，结果发现假阳性样品2个，假阴性样品2个，准确率达到98.7％，由此说明本发明的基于近红外光谱技术快速筛查补肾壮阳类样品中添加化学成分的方法能够满足监督检验的要求。

三、采用理化反应试剂盒快速筛查

在没有近红外光谱仪或近红外光谱鉴别模型不适用的情况下，操作简单、检测成本低的理化反应是快速筛查的优选方法。在理化反应原理基础上制成的快检试剂盒，容易在基层推广应用。

本发明实施案例的十一种PDE₅型抑制剂的化学结构信息见表1，从化学结构来看，可以把PDE₅型抑制剂分为那非类和拉非类。那非类包括西地那非及其衍生物、伐地那非及其衍生物、红地那非及其衍生物、艾地那非及其衍生物等；拉非类包括他达拉非及其衍生物。由于那非类和拉非类的核心结构差异较大，他们相应的物理和化学性质也差异较大(如那非类PDE₅型抑制剂一般溶于酸溶液，而拉非类PDE₅型抑制剂一般不溶于酸溶液，溶于有机溶剂)，需要采用不同的理化反应方法分别检测。

本案例的PDE₅型抑制剂理化反应快速筛查方法如下：

1.步骤一：取胶囊1粒(片剂约1/2片；丸剂、颗粒剂、散剂等固体制剂约每次服用量的1/10量；溶液剂2ml)，置具塞试管中(片剂、丸剂需预先研细或剪碎)，加3％硫酸溶液8ml(溶液剂加6ml)，强力振摇约2分钟使溶散，静置片刻，滤过，取续滤液2ml，滴加0.04mol/L高锰酸钾溶液，边滴加边振摇，至溶液出现的紫红色在15秒内不褪色，静置片刻，待紫红色褪去至无色或浅棕色，滴加三硝基苯酚饱和溶液4～5滴(滴加时和滴完后切勿振摇试管)，观察是否产生黄色浑浊。若3分钟内出现黄色浑浊，静置后形成黄色沉淀物，即初步判断样品中含那非类PDE₅型抑制剂。

2.步骤二：若不呈上述阳性反应，则取胶囊剂1粒(片剂1片；丸剂、颗粒剂、散剂等固体制剂约每次服用量的1/2量)，置具塞试管中(片剂、丸剂需预先研细或剪碎)，加乙醇2ml，振摇约1～2分钟，静置约1分钟，取上清液作为供试品溶液。在试管中加入45％的稀硫酸1ml，滴加供试品溶液2滴，观察是否产生紫色。若3分钟内供试品溶液显紫色，则初步判断样品中含拉非类PDE₅型抑制剂。

3.检测结果为阳性的样品需要现场抽样，进一步用高效液相色谱法或液质联用法确证。

通过组合步骤一和步骤二两个理化反应方法，可以检测目前绝大部分已知的PDE₅型抑制剂。根据样品中添加PDE₅型抑制剂的实际情况，如样品以添加那非类PDE₅型抑制剂为主，则按上述组合操作；如样品以添加拉非类PDE₅型抑制剂为主，则也可以交换步骤一和步骤二的顺序使用。

从市场收集149个补肾壮阳类样品，采用高效液相色谱法和液质联用法检测发现其中102个添加那非类PDE₅型抑制剂，涉及6种PDE₅型抑制剂(分别为西地那非、羟基豪莫西地那非、红地那非、那红地那非、伐地那非和硫代艾地那非)；用本发明的理化反应步骤一的方法检测，出现假阳性样品3个，准确率为98.0％。从市场收集156个补肾壮阳类样品，采用高效液相色谱法和液质联用法检测发现其中17个添加拉非类PDE5型抑制剂，涉及他达拉非和氨基他达拉非两种PDE₅型抑制剂，用本发明的理化反应步骤二的方法检测，准确率为100％。由此说明本发明的理化反应快速筛查补肾壮阳类样品中添加化学成分的方法能够满足监督检验的要求。

四、高效液相色谱法进行确证

现有技术主要采用液质联用方法作为确证方法。高效液相色谱仪是国内检测实验室的常规检测设备，采用液相色谱法作为确证方法，在当地药品检测机构的实验室对初筛的阳性样品进行快速确证，符合国内药品检测机构的实际情况，有利于监督检验的有效实施。

本案例的液相色谱方法的主要分析步骤如下：

1.色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；二极管阵列检测器，检测波长为230nm，扫描波长范围为200～400nm；柱温35℃；流速1.0ml/min；流动相A为磷酸三乙胺溶液(取三乙胺7ml用水稀释至1000ml，用磷酸调pH至2.8)-甲醇-乙腈(60∶20∶20)，流动相B为磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈(8∶46∶46)，按表2进行梯度洗脱。

表2

2.对照品溶液的制备精密称取那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非对照品各10mg，置50ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取适量，用流动相A溶液稀释制成每1ml含50μg的溶液，即得。

3.供试品溶液的制备若样品为固体制剂，精密称取一次服用量，研细，置50ml量瓶中，加乙腈40ml，超声处理15分钟，冷至室温，用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过；若样品为液体制剂，精密量取一次服用量，置50ml量瓶中，加乙腈约40ml，振摇3分钟，用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液适量，根据样品中添加PDE₅抑制剂的量，用流动相A稀释至与对照品溶液浓度相当，摇匀，滤过，即得。

4.测定方法

(1)分别精密量取对照品溶液和供试品溶液10μl适量注入液相色谱仪，记录色谱图及紫外光谱图。

(2)将供试品的色谱图和对照品的色谱图进行比较，保留时间与对照品保留时间相近(误差范围为±0.2分钟)的组分即初步认为是相应的PDE₅型抑制剂。

(3)由于中成药、保健食品和食品种类繁多、成分复杂，不能完全排除存在干扰成分与PDE₅型抑制剂在同一时间出峰的情况，采用二极管阵列检测器可获得PDE₅型抑制剂的紫外吸收光谱图，将供试品的紫外吸收光谱图与对照品的紫外吸收光谱图进行比较，若两者的最大吸收波长、最小吸收波长等光谱特征一致，进一步确证供试品中含有PDE₅型抑制剂。如无法获得PDE₅型抑制剂的

对照品，可参考表3的紫外吸收光谱特征进行比较。表3

(4)根据供试品溶液的实际浓度，用流动相A稀释使其与对照品溶液的色谱峰面积相当，按外标法计算样品中添加化学成分的浓度，并按所附说明书计算出一次服用量所摄入的化学成分量。

外标法计算含量时一般采用相应的对照品计算含量。由于PDE₅型抑制剂存在很多西地那非、伐地那非和他达拉非的衍生物，获取这些衍生物的对照品十分困难，PDE₅型抑制剂的化学结构相似，在230nm的紫外响应值基本相当，在相应的对照品难以获得的情况下，也可以用容易获得的结构类似物(如西地那非)作为参考对照品测定相对含量。

(5)从上述十一种PDE₅型抑制剂中选择那红地那非、伐地那非、西地那非、他达拉非和硫代艾地那非作为代表性PDE₅型抑制剂进行方法学验证：3个浓度9份供试品溶液的平均回收率分别为99.1％、96.2％、105.0％、102.1％和103.0％；7次进样主成分峰面积的RSD分别为0.8％、0.8％、0.8％、0.6％和0.5％；检测限分别约为6ng、6ng、4ng、2ng和2ng，表明本发明的方法满足高效液相色谱含量测定的方法学验证要求。

(6)合理设置中成药、保健食品和食品中非法添加化学成分的限量水平对于区分人为添加和评估非法添加的危险程度具有重要的意义。西地那非类的起效剂量为50～100mg，伐地那非类和他达拉非类的起效剂量为5～20mg。按最低起效剂量5mg计算，设定人为添加的限量值为最低有效剂量的1/10，即0.5mg/次服用量。在评估添加化学成分对人体健康的危害程度时，该限量值可作为参考。即便每次服用0.5mg上述化学成分，在临床上也不会产生显著效果，从而使得非法添加用来牟取不法利益变得毫无意义。

从市场收集194个各种补肾壮阳类样品，其中132个添加PDE₅型抑制剂，涉及8种PDE₅型抑制剂。采用液质联用法对上述高效液相色谱法的测定结果进行验证，准确率为100％，表明高效液相色谱方法满足作为确证方法的要求。

五、液质联用法进行仲裁或确证

液质联用技术集液相色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度、高定性专属性于一体，尤其是多级质谱串联检测技术，可获得更多的化合物结构信息。在复杂混合物的定性鉴别分析方面具有许多优越性，是目前非法添加检测技术中最准确的方法。但是液质联用仪价格昂贵，维护成本高，在国内实验室的配置还不普及。对于配置液质联用仪的实验室，可以直接用该方法对初筛的结果进行确证，也可以对影响较大或存在争议的检测结果进行仲裁。

本案例的十一种PDE₅型抑制剂液质联用检测方法如下：

1.色谱条件以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；检测波长230nm；以含0.1％乙酸的0.02mol/L乙酸铵溶液为流动相A，甲醇为流动相B，乙腈为流动相C，按表4进行梯度洗脱：

表4

2.质谱条件电喷雾离子化源(ESI)，毛细管电压5.5kV，离子源温度400℃，离子喷雾气流速800ml/min，正离子检测方式，扫描方式为全扫描一级质谱、全扫描二级质谱，扫描范围50～600amu。

3.对照品溶液的制备取西地那非、他达拉非、伐地那非、红地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、那莫西地那非、氨基他达拉非、伪伐地那非、硫代艾地那非、那红地那非对照品约10mg，置50ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，用50％乙腈溶液稀释制成每1ml含5μg的溶液，即得。

4.供试品溶液的制备若供试品为固体制剂，精密称取一次服用量，研细后转移至50ml量瓶中，加乙腈约40ml，超声处理15分钟，冷至室温，用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过；若供试品为液体制剂，精密量取一次服用量，置50ml量瓶中，加乙腈约40ml，振摇3分钟，用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液适量，用50％乙腈稀释至与对照品溶液浓度相当，摇匀，滤过，即得。

5.测定法分别精密量取供试品溶液及对照品溶液各10μl注入液质联用仪，以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以含0.1％乙酸的0.02mol/L乙酸铵溶液为流动相A，甲醇为流动相B，乙腈为流动相C，按表1梯度洗脱程序洗脱；以电喷雾离子化源(ESI)离子化(毛细管电压5.5kV，离子源温度400℃，离子喷雾气流速800ml/min)，采用正离子方式，全扫描一、二级质谱，扫描范围50～600amu；记录液相色谱图和一、二级质谱图。

6.结果判断采用比较供试品与对照品的色谱图、一级质谱图和二级质谱图的方法进行定性分析，确定供试品中添加的化学成分。在没有对照品情况下，若供试品质谱图中出现表5中相应的准分子离子峰及三个以上二级质谱特征碎片离子时，确定供试品中添加了化学成分。

表5

六、添加已知化学成分同系物、衍生物或修饰物的检测程序及思路

当用理化反应法和近红外光谱法快速筛查未知样品的结果为阳性时，在采用高效液相色谱法或液质联用法进行确证时又发现该样品中明显添加了化学成分而该化学成分又不属于标准中的检测对象时，有可能是该样品中添加了已知化学成分的同系物、衍生物或修饰物，应该对该化学成分进一步详细分析。因为理化反应和近红外光谱是针对PDE₅型抑制剂中某种官能团或某类典型结构的通用型筛查方法。

本发明对未知化学成分的检测思路和方法为利用高效液相色谱-二极管阵列检测器和高效液相色谱-质谱联用检测技术，按照化学结构对化学成分进行分类，采用紫外吸收光谱特征和二级质谱特征检测已知添加化学成分的同系物、衍生物和改造物。本发明在上述十一种PDE₅型抑制剂的基础上，查阅了大量国内外文献报道的PDE₅型抑制剂的紫外吸收光谱和二级质谱特征，将已知PDE₅型抑制剂归纳总结分为西地那非类、红地那非类、硫代那非类、伐地那非类、他达拉非类等类。西地那非类包括西地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、那莫西地那非、艾地那非(Aildenafil)、伪西地那非(Piperidinosildenafil)等；硫代那非类包括硫代艾地那非、硫代西地那非(Thiosildenafil)、硫代豪莫西地那非(Thiohomosildenafil)等；红地那非类包括红地那非类、那红地那非、羟基红地那非(Hydroxyacetildenafil)、伪红地那非(Piperidinoacetildenafil)等；伐地那非包括伐地那非、伪伐地那非等；他达拉非类包括他达拉非、氨基他达拉非等。各类PDE₅型抑制剂的通用化学结构式见表6，紫外吸收光谱和二级质谱特征见表7。

表6

表7

如果检测出的未知化学成分符合表6的紫外吸收光谱和二级质谱碎片离子特征，那么就极有可能是PDE₅型抑制剂的同系物、衍生物或修饰物，需要将化学成分从样品中提取、纯化，用核磁共振、红外光谱、高分辨质谱、元素分析等分析手段解析其化学结构，并尽快将其纳入标准检测的范畴。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。