鉴定表现出变色减轻的植物材料的方法，由此鉴定的植物以及该鉴定的植物用于生产表现出变色减轻的经济作物的用途

发明领域

本发明涉及与对照植物材料相比，鉴定植物材料中存在表现出变 色减轻尤其是伤口诱导的表面变色减轻的物质的方法。

本发明进一步涉及由此鉴定的植物材料、其在育种中的用途以及 由其获得的植物。

发明背景

产品的收获以及随后的加工、包装和储藏引起了植物材料的强烈 反应，这通常导致最终产品质量的快速下降。这里所述的质量指的是 由消费者作为新鲜度感知的几种属性，例如颜色、味道、气味、脆性。

产品针对加工的反应可以是导致萎蔫、变色和老化的物理、生化 和生理性质的组合。为了提高加工产品的质量，培育加工后表现出变 质水平减轻的植物品种变得日益重要。

目前，莴苣成为以加工过的形式(即切割、清洗、包装的形式) 越来越多地提供给消费者的新鲜产品之一。这种即食食品给消费者提 供了方便，此外还促使了新产品的研发，如不同叶型或其他类型蔬菜 的混合物。

莴苣加工和储藏期间发生的最重要的问题是伤口表面变色。这种 病症显示为在切割叶片的伤口表面的粉红色或棕色显色。尤其是中脉 部分在这方面表现出强烈的变色。这种负面的质量性状是在加工期间 需要控制的最重要的性状，因为消费者认为带有粉红色或棕色变色的 包装莴苣是变质的产品。

虽然采收后的处理，例如在受控大气压下的包装，可以防止变色， 并且提高新鲜切割的、包装莴苣的质量，但是遗传学的解决办法是优 选的。这是因为，尽管接受了这些处理，但是由于例如破坏性的包装 等原因，仍然损耗了相当一部分的产品。在由最终用户打开包装后的 保存期限也是非常短的。并且重要的是，这需要相当高的成本。

因此，具有改善的加工性状，尤其是减轻的表面变色的莴苣的培 育是莴苣加工产业中最重要的。同样适用于其他植物材料的加工，如 菊苣和茄子。

因而，本发明的目的是提供快速有效的植物材料鉴定方法，该植 物材料具有减轻的表面变色，用于生产不易于采收后变质的作物。

发明概述

伤口诱导的变色过程是植物保护自身抵抗病原体、害虫或物理因 素(风、雨、干旱、寒冷、热等等)通过伤口表面引起的损害的一种 方式。因此我们希望通过自然选择使得伤口诱导的变色的天然变异消 失。那些不能保护自己抵抗外部威胁的植物是脆弱的，并且因此很少 能从这些威胁下幸存。

然而，根据本发明令人惊奇地发现，基因库物质在变色方面，尤 其是在伤口诱导的变色方面具有显著变异。发明人通过与对照植物或 植物部分相比，使用检验表现出变色减轻或不存在的植物或植物部分 的方法能够证明这一点。该方法包括

a)提供获自表现出遗传变异的植物种群，特别是基因库的植物或 植物部分；

b)任选地在植物或植物部分上形成伤口表面；

c)培育植物或植物部分或其上形成的伤口表面，使得在其中或其 上发生变色；

d)观察植物或植物部分之中或之上的变色；

e)将观察到的变色与对照植物或植物部分中观察到的变色相比 较，以评价植物或植物部分与对照植物或植物部分相比是否表现出无 变色或变色减轻；和

f)将与对照植物或植物部分相比表现出无变色或变色减轻的植 物或植物部分鉴定为具有减轻的伤口诱导的表面变色性状的植物。

在该方法中，变色是内源性底物转变的结果。当植物或植物部分 在某些环境中培养一段时间后，这种变色会自然产生。这种情况中的 变色是伤口诱导的。本发明尤其涉及自然产生的酶促的粉红或褐变反 应。本发明的方法旨在鉴定与对照相比，没有表现出该反应或表现出 反应减轻的植物。

可选地，可以通过与对照植物或植物部分相比，使用检验表现出 变色减轻或不存在的植物或植物部分的方法来检验变色的变异，该方 法包括：

a)提供获自表现出遗传变异的植物种群，特别是基因库的植物或 植物部分；

b)植物或植物部分与可转变成有色颜料的底物一起培养，使得在 其中或其上发生变色；

c)观察植物或植物部分之中或之上的变色；

d)将观察到的变色与对照植物或植物部分中观察到的变色相比 较，以评价植物或植物部分与对照植物或植物部分相比是否表现出无 变色或变色减轻；和

e)将与对照植物或植物部分相比表现出无变色或变色减轻的植 物或植物部分鉴定为具有减轻的变色性状的植物。

在第二种方法中，变色是由外源性添加的底物的转变引起的，当 植物内发生反应时，该底物可以转变成有色底物，其可变成可视的。 这样的颜色反应可以是或者不是伤口诱导的。其还可以在例如完整的 种子的种皮中发生。本发明的筛选方法意在鉴定与对照相比没有表现 该出反应或表现出减轻反应的植物。

一旦通过这些方法中的任一种方法鉴定出具有减轻的变色性状， 尤其是减轻的伤口诱导的表面变色性状的合适植物材料，将根据本发 明来使用这种植物材料，以将这种特性引入到经济作物中。这种改良 的作物也是本发明的一部分。

因此，本发明是基于使用经检验的植物材料的特定来源。培养的 原料没有表现出太多关于变色的变异。出乎意料地发现了，相反地， 基因库里发现的种质，如登记入册的资源(accession)，在变色方面， 尤其是在伤口表面诱导的变色方面具有显著变异。登机入册的物质是 一个物种的一个样本，其具有给定的区域性。将登记入册的资源储存 在例如基因库或文库中。

在本发明的优选实施方案中，上述的变色测定用作筛选农作物物 种中自然发生的遗传变体的有效工具。本发明对于检验莴苣种质特别 有用，例如来自Lactuca sativa种以及相关的种如Lactuca seriola， Lactuca virosa等。

本发明还可以用于叶或茎部分用(苦苣，菊苣)、根或块茎用(马 铃薯，甘薯，块根芹菜)、果实部分用(茄子，苹果，香蕉，鳄梨， 桃子，梨，杏，芒果)，花或花部分用(朝鲜蓟，大丁草，菊花)的 作物和蘑菇。

在这方面也可以使用其他检验莴苣的变色，尤其是伤口诱导的表 面变色的测定，例如在不同成熟阶段加工的莴苣的目测。

通过使用这种测定，鉴定了不同登记入册的莴苣种，它们在特别 是叶的伤口诱导的表面变色方面具有显著变异。通过本发明所述方法 鉴定的、具有减轻的或不存在伤口诱导的变色的个体植物用于育种， 以培育在采收后加工特性方面，特别是伤口表面变色方面改善的莴苣 植物。这种品种尤其适用于便利市场。

此外，一组基因库登记入册的茄子的筛选也揭示了具有减轻的变 色的登记入册的资源。这些登记入册的资源在具有减轻的变色的茄子 的培育中的用途也是本发明的一部分。

本发明进一步涉及通过本发明的方法鉴定的植物作为减轻的伤口 诱导的表面变色性状的来源的用途。这种来源可以用作常规杂交的亲 本或作为成为该性状基础的遗传物质的供体。

发明详述

具有通过育种得到减轻的伤口表面变色的植物，以及最终的植物 变种的形成起初需要对该特性进行遗传变性的鉴定。本发明牵涉到该 初始鉴定步骤和进一步的将该特性引入到经济作物中的步骤。一旦提 供所需特性的第一代亲体植物得到鉴定，那么植物品种的培育就只是 熟练育种者的一个常规程序问题了。

伤口诱导的表面变色是经受切割或其他机械破坏的植物针对伤口 治愈和防御病原入侵的特殊反应。

伤口反应是植物对物理损伤的一种复杂生物反应，其表现为局部 地或全身地。局部反应主要是为了闭合伤口表面，其通过在切割表面 时或之后的局部细胞的坏死来完成。可以在许多植物品种中观察到伤 口表面的木质化或栓化，这形成了植物体和环境之间一道有效的新绝 缘屏障。

除了这些可视的效应之外，已知诱导了其他反应，如增强的呼吸 作用或乙烯生成。在生化水平上，研究显示创伤可以导致苯基丙酸类 合成路径的诱发，这是多酚或木质素的生成尤其需要的。

该途径的关键酶是苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)，其在创伤时通过至 少一个PAL异型基因表达的诱导而增强。该反应导致多酚的形成，多 酚被多酚氧化酶(PPO)氧化。PPO位于质体中，并且在创伤时得到释 放和活化。多酚的氧化导致高反应性醌的形成。这些醌可以与氨基酸 或蛋白质反应，这将导致粉红色、棕色或者有时甚至黑色变色。

在莴苣中，也可以观察到这种反应。当切割的莴苣叶储藏在置于 空气中的塑料袋中时，切割的表面开始在伤口表面形成粉红色的部分， 这将在延期储存后逐渐变成褐色。详细的生化分析显示，该反应需要 多酚的重新合成，随后被氧化，引起一连串的反应，最终在伤口表面 观察到粉红色或棕色显色。

已经研发的并且目前应用于莴苣加工工业的采收后处理可以抵消 这种特殊反应。本发明提供了一种遗传学的方法以针对这种特殊反应， 其可应用于减少或消除针对伤口诱导的变色的采收后处理。

为了可以研发具有改良加工特性的农作物，使用了根据本发明的 方法，其可以有效地测定出表面变色，这种变色是创伤的切割农作物， 尤其是莴苣采收后变色的诊断特征。

这些方法在共同未决申请PCT/EP2007/000226和 PCT/EP2007/000230中已经有描述。

在优选的实施方案中，获得莴苣植物的叶盘，并且在浸湿的滤纸 之间将其培养。培养时，将会形成粉红色变色，这是加工莴苣的伤口 诱导的粉红色变或褐变的诊断特征。因此，该方法可以非常有效地筛 选具有遗传变异的莴苣种群，以确定具有减轻的伤口表面变色的遗传 变异的存在，从而提高加工质量。

通过这种个体植物的成功鉴定，它们可用于育种改良的莴苣植物， 并且最终培育出特别适合加工的莴苣品种。

为了鉴定具有减轻的伤口诱导的表面变色性状的植物，利用了自 然遗传变异。自然遗传变异是DNA一级结构中的变异，其发生在这些 品种的种质之中，并且其是复制期间出错的结果，同时保留在了生殖 细胞的DNA中。

这种种群中遗传多态现象的发生通过给定的遗传背景中的自发性 突变的适应性以及环境的选择而决定。

对于莴苣，这种天然变异存在于Lactuca sativa品种和其他莴苣 品种中，如Lactuca serriola、Lactuca saligna或Lactuca virosa。 因此，根据本发明鉴定的植物也可以在这些品种中被鉴定，并且用于 生产具有减轻的伤口诱导的表面变色的莴苣。基础的原因在于天然的、 种间杂交障碍并不是绝对的，如果需要的话，这可以通过本领域技术 人员所知的技术例如胚胎拯救所克服。

天然变异在育种公司或协会的植物材料中发生，如种子形式的基 因库中。为了确定具有减轻的伤口表面变色的变体的存在，植物材料 在常规条件下进行培养，例如在温室中或田间。在幼苗阶段，从个体 植物获取样品，例如叶盘，并且使用前述方法之一确定变色的程度。 这种鉴定具有减轻的伤口诱导的变色的莴苣或其他作物的方法相比较 作物已经长到成熟阶段、采收、加工并且对加工质量进行评价的方法 更加有效。

此外，种植的莴苣的野生亲缘植物可以以完全不同的方式培养， 这使得比较分析不太明显。因为发现了显示粉红色表面变色的叶盘反 应是采收后变色的诊断特征，本发明的方法可以根据生物化学反应在 早期发育阶段鉴定植物，这可以用于提高莴苣或其他作物采收后的特 性。

这种方法提供了不同植物型更简单和更可靠的对照。令人惊讶地 发现在莴苣属中可以观察到伤口诱导的变色的显著变异。

根据本发明获得的具有减轻水平的或不存在伤口诱导变色的莴苣 植物可以用于常规的育种程序以培育符合加工产业特定需要的品种。 在这样的育种程序中，育种者可以使用常规的、熟知的育种方法，例 如QTL图谱，标记辅助选择，和回交，以将减轻水平的伤口诱导的变 色与其他栽培用莴苣的所需特性相结合，例如抗病原和抗虫性，无抽 薹和顶烧，等等。

本发明还涉及制备具有减轻的伤口诱导的表面变色植物的方法， 包括步骤：

a)将具有减轻的伤口诱导的表面变色的第一个亲本植物与第二 个亲本植物杂交获得F1种子；

b)培养F1种子获得F1植物，并且将F1植物自体受精以获得F2 种子；

c)选择伤口诱导表面变色水平至少低于第二个亲本植物水平的 F2植物作为具有减轻的伤口诱导的表面变色性状的植物。这些保留减 轻的伤口诱导的表面变色性状的植物以及后代就是本发明的植物。

优选，第二个亲本植物是具有农艺学可接受特性的栽培型亲本植 物，特别是莴苣。

在优选的实施方案中，第一个亲本选自列于表2中的植物。

第二个亲本植物可以是任何莴苣，但优选栽培型莴苣，例如球莴 苣Silvinas RZ。

当实施例1中所述的粉红色变试验中分数小于3，优选地小于2， 更优选地小于1时，这里所述的性状“减轻的伤口诱导的表面变色性 状”存在于植物中。

现在表明变异可以在天然发生的种群中发现，也可以由诱变作用 诱导。这产生了结合不同变异来源以产生不可预测的低水平伤口诱导 变色的可能性。不同减轻的伤口诱导变异来源的结合可以通过将它们 杂交完成，这形成了一种或多种杂种种子。如果来自那些种子之一的 杂种植物表现出更优异的减轻的伤口诱导的变色，那么它就可以直接 用于实践中。

无论如何，杂种植物可以自受精以获得F2种群。该F2种群可用 于测试等位性，即两种来源在相同的基因座提供表现减轻的变色的等 位基因。当不存在等位性时，就可能发现具有常规的、高水平伤口表 面变色的F2个体，以及相比两个亲本具有水平减轻很多的伤口表面变 色的F2个体。后一种F2植物带有来自两个亲本的减轻的变色等位基 因，可以用于进一步的育种。

减轻的变色的等位基因的结合过程可以得到分子标记的支持，如 AFLP、SFP，等等。用于辨别不同的变色减轻水平的其他测定，如成熟 植物储藏的切割叶片的目测，可以用于鉴定由不同来源的结合等位基 因获得的伤口表面变色高度减轻的植物。

本发明将通过下面的实施例进一步说明，并且只作为说明目的给 出。在实施例中，参考以下附图：

图1：莴苣登记入册资源的叶盘粉红色变测定。不同登记入册资 源之间观察到表现为不同程度粉红色变的反应差异。

图2：具有减轻的变色的07V.67586球莴苣头和具有常规变色的 cv.′Silvinas′的图片。

图3：新鲜切割茄子的褐变反应。左边显示的是切割后在室温下 储藏几个小时后的果实组织。右边显示的是在室温下培养了24小时后 的果实组织。可以清楚观察到种子的褐变。

图4：茄子的切割薄片和褐变反应。左边，两个半薄片于室温下 在50mM pH＝5.5的mes缓冲液中培养24小时。右边，半薄片在同 样的条件下培养，但添加了10mM L-半胱氨酸。

图5：茄子种子在含有4mM L-DOPA的溶液中培养的黑色变色。孔 1：阴性对照(只有缓冲液)，孔2-6：4mM L-DOPA，孔3-6：分别添 加了0.1、1.0、5.0和10mM L-半胱氨酸。

图6：基于具有PPO底物L-DOPA的种子的培养，种子相关的PPO 活性有变异的茄子遗传物质的筛选。柱2、4和6的孔含有4mM L-DOPA， 而柱1、3和5只含有缓冲液。在该平板中测定茄子种子形式的不同 遗传物质。将各批种子并排进行分析，在位置A1和A2，A3和A4， A5和A6，B1和B2，B3和B4，B5和B6，C1和C2，C3和C4，C5和C6， D1和D2，D3和D4，D5和D6具有和不具有L-DOPA。在位置C5和C6， D1和D2，D3和D4，D5和D6的批次表现出最高的种子相关的PPO活 性。

实施例

实施例1

减轻的伤口表面变色的莴苣种群的筛选

对可能显示伤口诱导的变色的莴苣登记入册资源进行筛选。使用 标准条件在温室中含有盆栽土壤的盘子中使种子萌芽，以长成莴苣。 使用木塞穿孔器将形成3-4片真叶的幼株进行采样。将由此所得的叶 盘在容器中在6℃下在浸湿的滤纸之间培养。大约一周以后，以1-5 的尺度对粉红色变进行打分，其中1表示没有可检验的粉红色变，而 5表示非常清楚、最大水平的粉红色变。结果显示在表1中。该表显 示了内部参考及其各自的分数。以下鉴定了证实具有减轻的粉红色变 的登记入册资源。

使用粉红色变叶片测定的、在不同登记入册资源的粉红色变反应 中观察到差异的实例显示在图1中。

令人惊讶地，发现了一些登记入册的资源表现出减轻的变色。这 是出乎意料的，因为认为该形状在天然和种植条件下是一个缺点，因 为认为导致变色的过程是保护植物对抗通过创伤点进入的不利的生物 和非生物的威胁因素。

根据上述相同的实验方案对该测试中最令人感兴趣的登记入册资 源进行再播种和再测试。证实编号651968(L.virosa；plot nr.366， NCIMB 41489)为粉红色变减轻。根据上述相同的实验方案对另外的登 记入册资源进行了测试，并再测试以进行确认。发现并证实编号 650147(L.saligna；NCIMB 41485)粉红色变减轻。发现的具有减轻 的伤口诱导表面变色的资源列于表2中。

熟知的例如′Iceberg′和′Salinas′的登记入册资源在该测试中 没有表现出任何粉红色变减轻的征象。

表2

具有减轻的伤口表面变色的登记入册资源的概况

编号651968、650147和07V.67586的种子由NC IMB Ltd， Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen， Scotland，AB21 9YA，UK.保藏。

表1

不同莴苣登记入册资源的粉红色变分数。各区域的数字涉及单个 登记入册资源。对每种登记入册资源的两个植物进行采样。分数表明 了粉红色变的水平：1＝无粉红色变至5＝强烈的粉红色变。如果这两个 植物粉红色变不同，则给出两个分数。如果给出了一个分数，则说明 这两个植物在测试中反应相同。

Vold nr.   Score     Vold nr.   Score      _Vold nr.     Score    Veld nr.      Score

          1      5          195     5en 4          257       4           319         4

          2      3          196         5          258       4           320         5

          3      3          197         5          259       5           321     5en 2

          4      3          198         5          260       5           322     5en 2

          5      5          199         5          261       4           323     2en 1

          6      5          200         5          262       4           324     4en 3

          7      5          201         5          263       4           325         5

          8      4          202         5          264       4           326         6

          9      4          203         5          265       4           327         4

          10     4          204         5          266       4           328         2

          11     3          205         5          267       5           329     2en 3

          12     4          206         5          268       4           330         1

          13     5          207         5          269       4           331         2

          14     5          208         5          270       4           332         3

          15     5          209         5          271       5           333 2en 3en 6

          16     5          210         5          272       5           334         5

          17     3          211         5          273       5           335         5

          18     5          212         5          274       6           336         5

          19     5          213         5          275       5           337         3

          20     5          214         5          276   1en 3           338         6

          21     2          215         5          277   2en 5           339         4

          164    5          216         5          278   1en 4           340         5

          165    5          217         6          279       5           341         3

          166    5          218         6          280       5           342     2en 1

          167    5          219 plentnog ta kleln  281       5           343         4

          168    5          220         4          282       5           344         5

          169    4          221         4          283       5           345         5

          160    5          222         4          254       3           346         5

          161    5          223         4          285       5           347         4

          162    5          224     3en 4          286       5           348         5

          163    5          225         4          287   3en 5           849         5

          164    4          226         4          288       5           350         5

          165    5          227         4          289       5           351         5

          166    5          228         5          290       5           352         5

          167    5          229         5          291   3en 6           353         4

          168    5          230         5          292       5           354         5

          169    5          231         4          293       5           355         4

          170    5          232         4          294       5           356         5

          171    5          233         4          295       5           357         4

          172    5          234         4          296       5           358         4

          173    5          235         4          297   5en 4           359         3

          174    5          236     2en 4          298   2en 4           360         4

          175    5          237         2          299       4           361         4

          176    4          238         4          300   2en 3           362         4

          177    2          239         4          301       4           363         3

          178    5          240         4          302       4           364         3

          179    2          241         4          303       4           365         3

          180    5          242         4          304       5           366         2

          181    6          243         4          305       6           367         2

          182    5          244         6          306       5           368         3

          183    5          245         6          307       6           369         2

          184    3          246         6          308       5           370         4

          185    5          247     3en 4          309       5           371         4

          186    5          248         4          310       5           372         3

          187    5          249         5          311       5           373     3en 2

          188    5          250         4          312       5           374         3

          189    5          251         4          313   2en 5           375         4

          190    5          252         4          314   3en 5           376         5

          191    5          253         4          315       5           377         5

          192    5          254         4          316       5           378         5

          193    5          255         4          317   5en 3           379         6

          194    5          256         4          318       5           380         5

实施例2

田间筛选

通过切割的结球莴苣头的目测进行田间筛选。在一个登记入册的 资源中，观察到减轻的伤口表面变色(图2)。该登记入册资源具有 编号07V.67586。通过以下田间试验中的目测对其进行再试验，并且 确认具有减轻的变色。该目测在切割后一天完成。令人惊讶地，根据 实施例1中所述的实验方案进行的追踪试验并没有表现出减轻的粉红 色变。这可能表示编号07V.67586变色减轻的遗传原因不同于实施例 1中所述的其他登记入册的资源。

实施例3

茄子中减轻的变色

在切割并且包装的茄子果实中，可以观察到快速的褐变反应。切 割的果实组织的伤口表面快速转变为褐色，这减轻了产品的质量。更 重要的是，包裹在果肉中的种子表现出强烈的褐变，在图3中相对背 景而突出。

对于新鲜切割茄子的工业使用或茄子作为新鲜产品的使用来讲， 需要防止种子的褐变。为了确定切割的茄子果实的棕色变色的生化特 性，在使用或不使用L-半胱氨酸时观察褐变反应，L-半胱氨酸是多酚 氧化酶(PPO)的强烈抑制剂。该分析的结果显示于图4中。

图4所示结果表明，褐变反应可以通过外源提供的PPO抑制剂L- 半胱氨酸得到抑制。因此，褐变反应明显地是PPO介导的。

为了使用遗传方法来防止由种子引起的茄子褐变，为种子相关的 PPO活性变异而筛选遗传物质。为了达到该目的，使用了依赖于底物 如L-DOPA转变成有色颜料如黑色素的方法。

将茄子种子培养在含有作为PPO底物的左旋多巴(L-DOPA)的溶 液中时，可以清楚地观察到以黑色变色表现的黑色素形成。这种黑色 变色是PPO介导的，因为其可以被L-半胱氨酸完全抑制，这显示于图 5中。

这种L-DOPA介导的茄子种子变色用于鉴定具有减轻的种子相关 PPO活性的遗传物质。该筛选致成了表现出种子相关PPO活性显著减 轻的遗传物质的鉴定。这种筛选的结果显示于图6中。

通过筛选方法获得的并且在种子相关PPO活性方面表现出强烈减 轻的茄子原料概括于表3中。在该筛选中，某些育种品系表现出种子 相关PPO活性的显著减轻(13、14、42、49)，而其他的表现出强烈 的褐变(7、27、34、47)。

表3

通过显示出种子相关PPO活性减轻的两个品系之间的杂交，从而 获得更适于工业和新鲜市场使用的杂种。此外，发现了野生登记入册 资源与茄子(19)近缘而与(22、24、25)远缘，并且种子相关PPO 活性表现出强烈的减轻。将这些登记入册资源用作回交程序的起始物 质，从而获得更适合产业和新鲜市场目的的品系和杂种。在回交程序 中，上述筛选方法用于帮助选择最强烈的种子相关PPO活性减轻。