超表达重组霍乱毒素B亚单位的霍乱弧菌显示双重免疫原性

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2007年4月24日提交的第60/926,123号美国临时专利申请的优先权。

发明领域

本发明涉及用于递送抗原以在哺乳动物体内激发对抗霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的免疫应答的活减毒细菌载体。本发明公开了提供中和霍乱弧菌和大肠杆菌抗原两者的中和抗体应答的免疫原性组合物。

背景技术

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)被认为是发展中国家传染性腹泻的主导因素之一(参见，Black，Rev.Infect.Dis.，12 Suppl 1：S73-9(1990))。全世界范围内的ETEC感染发生率估计造成6.5亿例的腹泻和38万例的小于5岁儿童的死亡(Gaastra et al.，Trends Microbiol.，4(11)：444-52(1996))。ETEC也是旅行者腹泻的重要原因，在旅行至墨西哥(Adachi et al.，J.Infect.Dis.，185(11)：1681-3(2002)；Jiang et al.，J.Infect.Dis.，185(4)：497-502(2002)；Bouckenooghe et al.，J.Travel.Med.，9(3)：137-40(2002))、非洲(Wolf et al.，J.Clin.Microbiol.，31(4)：851-6(1993))、孟加拉国(Qadri et al.，J.Clin.Microbiol.，38(1)：27-31(2000))、和印度尼西亚(Oyofo et al.，Am.J.Trop.Med.Hyg，65(2)：120-4(2001))的地方流行性区域的人群中多达全部病例的60％由ETEC负责。ETEC常与驻亚洲(Serichantalergs et al.，J.Clin.Microbiol.，35(6)：1639-41(1997))和中东地区(Wolf et al.，1993，supra)的美国军事人员的腹泻爆发事件有关。虽然ETEC感染通常具自限性，并可用抗生素治疗，但ETEC感染还是能负面地影响感染者的生活质量，常常在恢复正常活动之前需要几天的时间。对于部署在较不发达国家的军事人员以及在ETEC流行的国家旅行的度假者来说，这尤其值得关注。

大部分ETEC病例是由于摄入了肠病原体感染的食物和饮料。摄入后，ETEC在诸多定居因子的协助下定居在上部肠道。一旦感染建立，ETEC分泌热不稳定肠毒素(LT)，或热稳定肠毒素(ST)或同时分泌两者。虽然这些毒素从抗原性来说是不同的，并结合不同的宿主受体，但两者都引起剧烈的水样腹泻产生。其他症状可以包括肠道痉挛、恶心，和偶尔地，更加严重的症状，如呕吐和发烧。在每年报导的750万到1000万旅行者腹泻病例中，大约200万是由表达LT的ETEC引起的(Steffen，R.，Clin.Infect.Dis.，41 Suppl.(8)：S536-40(2005))。

ST是一种小的、单体毒素，含有多个半胱氨酸残基，其二硫键为这些毒素热稳定性的原因。ST有两个不相关的类别，其结构和作用机理不同。两类毒素的基因都主要存在于质粒上，一些ST-编码基因也在转座子中找到。

LT是一种原型A-B型毒素，由效应子亚单位(LT-A)和细胞结合亚单位(LT-B)组成。LT-A通过激活宿主腺苷酸环化酶造成超生理水平的cAMP而使宿主上皮细胞中毒。LT-B形成五聚体复合物，其与LT-A非共价相互作用形成LT全毒素，LT全毒素与GM₁神经节苷脂结合，所述GM₁神经节苷脂与宿主细胞表面的脂膜筏相关(Hirst，Cholera toxinand Escherichia coli heat-labile enterotoxin，in：TheComprehensiveSourcebook of Bacterial Protein Toxins，Alouf and Freer，eds.(San Diego，Academic Press，1999)，pp.104-29)。一旦LT结合到宿主细胞并被内吞，LT-A将被运送到细胞质，在那里发挥毒性作用，引起氯化物、重碳酸盐和水分排出细胞以及自肠道的净液体丢失。

下表1显示从全球不同地理区域的旅行者身上分离出来的表达LT和ST的ETEC菌株的发生率表1％总LT＝仅LT+LT/ST菌株

从表1可以看出，自表达LT的ETEC菌株的疾病发生率变化很大，并取决于不同的地理位置。世界范围内，大约有一半的ETEC菌株产生LT(Wolf，Clin.Microbiol.Rev.，10(4)：569-84(1997))。在流行区域的当地人群通常最多地感染产ST的菌株(Qadri et al.，2000，同上引文；Oyofo etal.，2001，同上引文)。这可能是因为，甚至在LT-ETEC的感染率很高时，有症状感染的数量也会因为先前的暴露而减少(Steinsland et al.，Lancet，362(9380)：286-91(2003))，从而导致观察到产LT的菌株引起的无症状感染率典型地大于产ST的菌株引起的无症状感染率(Qadri et al.，Clin.Microbiol.Rev.，18(3)：465-83(2005))。

从发达国家到流行性区域的旅行者发生不同形式的ETEC感染。在世界许多地区，产LT的ETEC(仅LT和LT-ST)是大多数旅行者腹泻的原因(Bouckenooghe et al.，2002，同上引文；Wolf et al.，1993，同上引文；Estrada-Garcia，J.Travel.Med.，9(5)：247-50(2002)；Rockabrand et al.，Diagn.Microbiol.Infect.Dis.，55(1)：9-12(2006)；Steffen et al.，J.Travel.Med.，12(2)：102-7(2005))。从此分布上可以明显地看出，抗LT生产菌株的疫苗将可以向许多流行区域的旅行者提供对抗与ETEC相关的腹泻的保护作用。

大肠杆菌的LT为寡聚毒素，在结构和功能上非常接近霍乱弧菌表达的霍乱肠毒素(CT)(Sixma et al.，J.Mol.Biol.，230：890-918(1993))。和LT一样，CT是由一个A亚单位(CT-A)和形成五聚体的B亚单位(CT-B)组成，其中B亚单位与GM₁神经节苷脂结合。LT和CT共有许多特征，包括全毒素结构、蛋白质序列(约80％同一性)、主要受体的身份(primary receptor identity)、酶活性、以及在动物和细胞培养试验中的活性。另外，LT和CT在抗原性上具有交叉反应性(Hirst，1999，同上引文)。

减毒伤寒沙门菌(Salmonella typhi)已经用来运送产肠毒素大肠杆菌的B亚单位(LT-B)(Stratford et al.，Infect.Immun.73(1)：362-8(2005))。该构建体由自ssaG启动子表达的eltB的单个染色体拷贝组成。据报道，皮下或鼻内接种的小鼠产生了对LT-B的高效价反应。据报道，在I期临床实验中，67％的疫苗接种者在接种两个剂量后发生了血清转换(Khan etal.，Vaccine，25(21)：4175-82(2007))。然而值得注意的是，在相似的构建体中，大部分LT-B是与细胞关联的，仅在细胞裂解后才释放到周围介质中(Clements et al.，Infect.Immun.46(2)：564-9(1984))。由于LT-B及CT-B的免疫原性与它们和宿主表面受体相互作用的能力有关(Nashar et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(1)：226-30(1996))，所以，能够分泌LT-B或者CT-B的菌株将可能更加有效地引起抗LT-B/抗CT-B的免疫反应。本发明的一个目的就是探索是否能实现这种增加的免疫原性。

纯化的LT也已经被作为ETEC疫苗进行过实验。尽管口服及鼻内递送时是有毒的，但经皮给药已经表现出潜力。最近的一个研究中，自愿者通过持续6-8个小时使用一种装有50微克LT的臂贴，在21天内接种两次。据报道，所有接种者都发生了血清转换，并且血清中对抗LT的IgG效价平均增加了24倍(Glenn et al.，Infect.Immun.，75(5)：2163-70(2007))。据报道也检测到了抗LT的中和抗体。在其后的研究中，受试者通过臂贴接种了三次，分别在第0、21和42天接种，每次轮换接种不同的上臂(McKenzie et al.，Vaccine，25(18)：3684-91(2007))。每个受试者在18-26个小时后返回并去除臂贴。然后这些受试者接受野生型ETTC菌株攻击。所有接种者的血清都转换成LT，但是没有发现抗LT/ST ETEC攻击的保护作用。

口服递送的灭活ETEC是已尝试过的另一种方法，但是该方法未能显示诱导保护性免疫原性：在近期的一个实地研究中，应用一种口服灭活疫苗，它是由几种ETEC菌株和CT-B(1毫克/剂量)组成的，其中每种ETEC菌株分别表达不同的定居因子(Sack et al.，Vaccine，25(22)：4392-400(2007))。接种两个剂量的旅行者，旅行到墨西哥或危地马拉后，被持续监测几周。没有发现对抗疫苗可预防性腹泻的保护作用，虽然据报道疾病的严重性在接种者中减轻。

这些研究显示CT-B可能用于促进抗LT/ETEC菌株的交叉免疫的用途。然而，这些研究也清楚地说明，以前的疫苗通过可以提供有用水平的抗LT免疫的途径或形式或数量来递送CT-B是失败的。

如同ETEC，霍乱弧菌，霍乱的发病原因，长期困扰着人类。已经有6次由“经典”生物型霍乱弧菌菌株引起的该疾病的全球大流行。引起最近的(第七次)大流行的病因属于‘El Tor’生物型。近期，第七次大流行已经延伸到新的地点，即南美洲。开始于1991年1月的霍乱流行已经在秘鲁、厄瓜多尔、哥伦比亚和智利造成了超过25万例病例和超过2000例的死亡。1992年11月，在印度和孟加拉国出现一种抗原性不同的、非O1形的霍乱弧菌，在8个月内，估计造成了50万新霍乱病例和6000例死亡。此新菌株被命名为血清组0139异名‘孟加拉’，其全球大流行可能性似乎是确定的并在所有发展中国家中引起新的关注。

由于霍乱的天然感染和自霍乱的恢复可以诱导持续至少3年的免疫(Tacket et al.，Cholera Vaccines，in Vaccines：New Approaches toImmunological Problems，Ellis，R.W.，ed.(Butterworth-Heinenann，Boston，1992)；Levine et al.，J.Infect.Dis.，143：818-820(1981))，所以大量的努力被投入以开发一种活的减毒霍乱疫苗，当口服时，其在免疫性质上可以模拟导致疾病的野生型菌种，但不会在免疫的个体中造成不利症状或者反应，即表现低的反应原性。开发这种疫苗的尝试典型地涉及缺失突变，以灭活编码霍乱毒素A亚单位的基因，该A亚单位是在该疾病中所看到的大部分腹泻的原因，其为一种蛋白质(Mekalanos et al.，P.N.A.S.USA，79：151-155(1988)；Mekalanos et al.，Nature，306：551-557(1983)；Kaper et al.，Nature，308：655-658(1984)；Kaper et al.，Biotechnology，2：345(1984))。尽管已开发了口服灭活的全细胞疫苗以及几种活的减毒霍乱疫苗，但是它们中最有前界的疫苗也提供很少的对抗霍乱弧菌E1 Tor生物型的保护作用，并很可能没有对抗0139血清型的保护作用。

霍乱弧菌仅当在小肠定居后才会致病。作为一种黏膜病原体，霍乱弧菌选择性地粘附胃肠道的M细胞(Owen et al.，J.Infect.Dis.，153：1108-1118，(1986))并对黏膜免疫系统产生强的刺激(Svennerholm et al.，Lancet，1：305-308，(1982))。对黏膜相关的淋巴组织(MALT)的定居，也是诱发局部免疫应答所必需的，该局部免疫应答的特征为局部产生的分泌型IgA，其为开发有效疫苗的一个重要方面(Holmgren & Czerkinsky，Nature Medicine Supp.，11(4)：S45-S53(2005))。由于在抗击霍乱弧菌(及ETEC)感染中引发黏膜免疫的重要性，故活的无毒疫苗株是尤其有意义的：灭活疫苗，虽然可能具有高免疫原性，但不能定居肠或者黏膜相关组织。对于有效的活的无毒霍乱疫苗，一个有前景的侯选者为CholeraPeru-15(由AVANT Immunotherapeutics，Inc.，Needham，Massachusetts开发中)。Peru-15是活的无毒霍乱弧菌株(基因型：ΔattRS1，ΔcoreΔrecA:htpG:ctxB，)，在400多例受试者中表现了良好的耐受性和免疫原性(US专利号6,203,799；Kenner et al.，J.Infect.Dis.172：1126-1129(1995)；Cohen et al.，Infect.Immun.70：1965-1970(2002))。

是一种口服灭活全细胞霍乱疫苗，包括添加的1毫克CT-B，是瑞典SBL Vaccin于二十世纪80年代开发的。在孟加拉国的妇女和儿童中评估该疫苗对抗霍乱的效力时，发现该疫苗也提供短期的对抗产LT/ST的ETEC的保护作用，而且该保护依赖于疫苗中含有CT-B(Clemenset al.，J.Infect.Dis.，158(2)：372-7(1988))。

在后来的研究中，旅行至摩洛哥的芬兰旅游者接受了两个剂量的获得了对抗由表达LT和LT/ST的ETEC引起的疾病的保护作用(Peltola et al.，Lancet，338(8778)：1285-9(1991))。具体地，据报道，对于在摩洛哥的芬兰旅游者，WC/rBS霍乱疫苗防止所有腹泻事件中的23％以及由ETEC引起的事件中的52％。然而，据报道，该保护作用未持续超过几个月的时间。虽然短期保护作用是有限的，但这些研究显示，CT-B，在对抗产LT的ETEC从而预防旅行者腹泻方面，是一种可能的有效免疫原。

从前面可见，为了解决ETEC和霍乱弧菌感染以及为了向流行性地区的居民或计划去那里的旅行者提供对抗衰弱性疾病的保护作用，已经投入了大量的努力。然而，仍然需要能有效引起对ETEC或者霍乱弧菌的有效黏膜免疫应答的组合物，或者理想的是，极为需要能够引起双重免疫应答，即，能够引起抗霍乱弧菌和ETEC病原体两者的中和抗体，的免疫原性组合物。可以口服施用和保留定居MALT组织的能力的、以活的减毒株形式提供双重免疫原性的潜在疫苗株，是特别值得期待的。

发明概述

本发明提供一种用于产生对抗霍乱弧菌和产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的双重免疫应答的免疫原性组合物。本发明的免疫原性组合物包含活的减毒霍乱弧菌，该细菌经改造而产生高水平的霍乱毒素B亚单位(CT-B)。本发明的菌株能产生和分泌高水平的CT-B，进而能引起抗LT的中和应答，本发明的菌株也保留定居黏膜相关淋巴组织(MALT)的能力从而又引起杀弧菌的中和抗体应答。有利的是，霍乱毒素B亚单位优选地通过用能产生大量CT-B的多拷贝表达质粒转化减毒霍乱弧菌宿主而实现表达。高表达CT-B的菌株——其中CT-B超表达对该细菌宿主细胞无毒——的发现，是令人惊讶而且有益的。一种具体的此类菌株，Peru-15(pCTB)，在下面详述。

本发明提供免疫原性组合物，其包含活的减毒霍乱弧菌细菌，该细菌含有表达重组抗原的多拷贝质粒，其中所述抗原是霍乱毒素B(CT-B)。

优选地，包含活的减毒霍乱弧菌细菌的免疫原性组合物在该细菌的染色体遗传基因座中含有突变，其中所述突变防止该基因座表达功能性蛋白质，并且其中所述质粒含有编码该蛋白的基因的功能性拷贝，由此弥补该微生物染色体上的此突变。当突变在基于质粒的该互补性基因不存在的情况下对细菌细胞是致死性的时，  该重组或者转化的细菌具有“平衡-致死”系统，只有在平衡质粒得到保持时，该系统才维持转化体的存活。因此，针对保持包含互补性基因的表达质粒的转化细菌，该平衡-致死系统提供了一种选择机制。

在含有活的减毒霍乱弧菌的免疫原性组合物中，用于这样的质粒互补的一个特别有用的基因为谷氨酰胺合成酶基因，即GlnA基因。其他平衡基因也适用，包括但不限于：asd，purB，thya等等。

本发明的组合物可以用能够用于肠道免疫引起黏膜抗霍乱弧菌应答的任何霍乱弧菌菌株制备。该菌株可以是任何生物型，即，经典的或者E l Tor。考虑到目前世界范围的感染的特性，一种特别有用的生物型是E lTor生物型的霍乱弧菌。

本发明的组合物可以用任何血清型的霍乱弧菌菌株制备，例如，Inaba，0139或者Ogawa血清型。根据本发明，优选使用的菌株为Peru-15(ATCC 55635)。

根据本发明的霍乱弧菌宿主菌株经转化而表达过量的霍乱毒素B亚单位(CT-B)。优选地，用指导CT-B在宿主中高水平表达的质粒转化宿主菌株，并且更优选地，CT-B以由宿主细胞分泌的形式表达。已经制备了一种Peru-15细胞系(活的减毒霍乱弧菌)，其进一步在天然GlnA基因中具有缺失，并且带有多拷贝表达质粒pMEG-2350，该质粒包括一个GlnA操纵子来补充染色体的GlnA缺失，并还含有在Ptrc启动子控制下的CT-B编码序列。该菌株在本文中称作Peru-15(pCTB)。

Peru-15(pCTB)超表达CT-B，但是也保留定居MALT的能力，呈现引起高效价杀弧菌和抗LT中和抗体的能力。Peru-15(pCTB)的样品按照布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，马纳萨斯，维吉尼亚20110美国(专利保藏号PTA-9130)。

本发明也提供在哺乳动物受试者体内引起双重免疫应答的方法，其中所述双重免疫应答的特征在于产生识别霍乱弧菌和ETEC抗原的中和抗体，该方法包括给哺乳动物施用本发明的免疫原性组合物。

本发明也提供一种保护易感宿主对抗ETEC和/或霍乱弧菌感染的方法，包括给宿主接种一定量的本发明免疫原性组合物，其中所述量足以引起抗LT和/或抗霍乱弧菌的免疫应答，其中保护宿主意味着在此接种后产生LT中和抗体和/或杀弧菌抗体，以致于与未接种的个体相比，阻止ETEC或者霍乱弧菌导致的疾病的发展或减轻其严重性。本文提供的关于本发明免疫原性组合物的数据说明，本发明的实施方案用来免疫人类对抗ETEC和霍乱弧菌之任一或者两者是合适的。

附图简述

图1为pMEG-2350的质粒图谱，该质粒为一种高拷贝数的质粒(pSC101 ori)，具有CT-B基因位于组成型强Trc启动子(Ptrc)控制下。一个GlnA拷贝位于质粒中以弥补染色体上GlnA的敲除。

图2显示Peru-15和Peru-15(pCTB)的CT-B表达。培养物在M9-V肉汤中生长到OD₆₀₀值为1.0。浓缩上清液，在15％SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳。图2(A)为考马斯染色的凝胶；图2(B)为用抗CT-B作为探针探测的Western印迹。泳道1显示低分子量标记；泳道2为Peru-15；泳道3为Peru-15(pCTB)；泳道4为纯化的CT-B(1微克上样于(A)中，0.1微克上样于(B)中)。图2(C)显示经电泳上清液样品(加热和未加热的)证实的分泌的CT-B的五聚体化。未加热的样品电泳呈现出一个大的复合物，如针对五聚体CT-B所预期的，该复合物通过加热被破坏。泳道1和泳道8为高分子量彩虹标记；泳道2和泳道7为0.1微克的CT-B；泳道3和泳道6为Peru-2；泳道4和泳道5为Peru-15(pCTB)。

图3为28代生长后Peru-15(pCTB)分离菌的菌落印迹。Peru-15对照菌株和Peru-15(pCTB)菌株在经设计以模拟生产条件的条件下生长。菌落被点在M9-V板上并用抗CT-B抗体探测。

图4显示口服接种一个剂量的Peru-15或一个剂量的Peru-15(pCTB)的兔子的抗CT-B血清IgG效价。

图5显示口服接种一个剂量的Peru-15或Peru-15(pCTB)的兔子的抗CT-B血清IgA几何平均效价。

图6显示口服接种一个剂量的Peru-15(pCTB)的兔子的抗LT血清IgG几何平均效价。对于所有接种Peru-15的兔子，其抗LT效价均小于50(未显示)。

图7显示口服接种一个剂量的Peru-15或Peru-15(pCTB)的兔子的杀弧菌效价。

定义

为了更全面地理解本发明，对以下术语进行定义。

本文中用到的‘减毒’、‘减毒的’及类似的术语是指在特定的宿主生物体如哺乳动物体中细菌天然毒力的消除或减小。“毒力”是指病原微生物在宿主生物中引起疾病的程度或能力。一种细菌可能对一种宿主生物物种(如小鼠)是有毒性的，并对另一宿主生物物种(如人类)不具有毒性。因此，广义地，减毒细菌或细菌菌株将对易于被该细菌或该细菌菌株的毒性形式感染和致病的宿主生物的至少一个物种具有减弱的毒力。

本文中术语“遗传基因座”是一个广义术语，包括基因组(一个生物体的所有遗传内容)中、或染色体或者复制性核酸分子(如质粒)的特定核苷酸序列中的任何指定位点，包括但不限于：基因、核苷酸编码序列(编码蛋白质或RNA)、操纵子、调节子、启动子、调控位点(包括转录终止子位点，核糖体结合位点，转录抑制剂结合位点，转录激活剂结合位点)、复制起点、顺反子间区、及其中的部分。遗传基因座的鉴定和表征可以用本领域可得的任何体内和/或体外方法，包括但不限于：接合研究，交换频率，转化分析，转染分析，限制酶作图法，核酸杂交分析，聚合酶链式反应(PCR)，核酸酶保护试验，和直接核酸序列分析。

本文中，术语‘感染’具有本领域技术人员通常使用和理解的含义，包括伴有或不伴有疾病表现的、微生物入侵宿主生物和在宿主(“宿主”、“个体”、“患者”)体内或其上复制(见，上述‘毒力’)。感染性微生物包括病原细菌，例如霍乱弧菌和产肠毒素大肠杆菌(ETEC)，其在感染未受保护的个体时能造成严重的疾病。感染可以在个体体内或其上的一个或多个位点发生。感染可以是无意的(例如，无意的摄入，吸入，伤口污染等)或者有意的(例如，施用活的疫苗细菌株，用病原细菌株进行实验性攻击)。在脊椎动物宿主生物，例如哺乳动物中，感染的位点包括但不限于：呼吸系统，消化道(肠)，循环系统，皮肤，内分泌系统，神经系统，和细胞间隙。一定程度和形式的微生物复制或增殖是感染性微生物存留在感染位置所需的。然而，复制可以在感染性微生物之间差别很大。相应地，感染性微生物的复制包括但不限于：微生物持久而连续的复制和微生物在特定位点短暂或暂时的维持。宿主被病原微生物‘感染’，这是不希望发生的，因为潜在的造成宿主疾病的可能性；但使用活的疫苗，包括本文中所述的经基因修饰的减毒霍乱弧菌菌株，感染宿主个体，是期望的，这是因为该细菌株能够引起针对在人类中造成感染性腹泻的霍乱弧菌和产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的抗原的保护性免疫应答。

本文中用到的术语‘疾病’和‘病症’具有本领域技术人员通常知道和理解的含义，包括宿主个体的身体机能或健康的任何异常情况。特定疾病或病症，例如感染性腹泻，的诊断可通过健康护理专业人员直接检查和/或考虑一种或多种诊断检测结果来确定。

根据本发明的“活的免疫原性组合物”、“活的双重免疫原性组合物”或者“活的细菌免疫原性组合物”或类似的术语，指该组合物含有活的霍乱弧菌菌株，该菌株已经利用遗传工程技术进行过修饰，由此：1)与能够诱导霍乱的野生型霍乱弧菌菌株相比为无毒(减毒)的；2)能够表达(优选地超表达)和分泌重组霍乱毒素B亚单位多肽(CT-B)，且数量比本发明修饰菌株所源自的天然霍乱弧菌菌株的CT-B表达水平高(即，高至少10倍，优选地高至少25倍，更优选地高至少50倍)，而且该经修饰的菌株，在给哺乳动物受试者施用后，可以引起具有双重功效的免疫应答，也就是，引起杀弧菌的(即，介导杀死霍乱弧菌病原体)或者中和霍乱毒素的、并且也中和ETEC热不稳定性毒素(即，中和性抗LT抗体应答)的抗体应答。本发明霍乱弧菌菌株的优选实例引起黏膜免疫，并且优选地，本发明组合物在通过肠道，尤其是口服施用时是有效的。

本发明的经修饰的霍乱弧菌菌株是提供对抗霍乱弧菌和ETEC感染的保护作用的人用疫苗的良好候选者。本文中提到的针对霍乱弧菌和/或ETEC感染“提供保护作用”，或提及本发明的“免疫保护性组合物”，是指对霍乱和/或ETEC提供至少部分免疫，也就是，当霍乱弧菌或ETEC感染发生时，该免疫可以有效地阻止相关疾病表现，或者，与暴露于相同霍乱弧菌或ETEC病原体的非免疫个体相比，可以有效地减轻疾病的严重程度。该至少部分免疫可以通过任何可观察或可检测的状况得到证实，包括但不限于：一种或多种疾病症状(例如腹泻，发烧，疼痛，出血，淋巴结发炎，虚弱，不适)的减轻，更短的疾病持续期，组织损伤的减轻，健康组织的再生，病原微生物自个体中的清除，以及个体的健康感觉的增加。虽然高度期望，但本领域技术人员明了，没有一种免疫原性组合物预期可以在每一个接受该组合物的个体中诱导对疾病的完全保护，或者预期保护性免疫可以持续个体的整个生命期而无需定期“加强”施用免疫原性组合物。也可以理解，在健康护理人员的判断下，可以给如下个体施用包括本文中描述的细菌的活免疫原性组合物，所述个体还未呈现感染性腹泻的症状，但被认为具有感染危险，或者知道已经暴露过霍乱弧菌或产肠毒素大肠杆菌——例如，通过旅行、接近或者接触感染患者或者细菌污染的空气、液体或表面。

术语‘肠的’、‘通过肠的’、‘非胃肠外的’、‘通过非胃肠外方式的’等等，指通过沿消化道的途径或方式给个体施用化合物或组合物。肠道施用包括口服、舌下、口腔、鼻咽、食管、胃肠以及直肠施用途径。疫苗组合物的“口服”施用途径的例子包括，但不限于，从口吞咽液体或固体形式的疫苗组合物，通过鼻空肠管或胃造口管施用疫苗组合物、十二指肠内施用疫苗组合物。直肠施用的例子包括，例如，使用栓剂将本文所述活细菌疫苗株释放到消化道的下部肠道。

术语‘重组’用来描述被非天然地改变或操作的核酸、被转化、电穿孔、或者转染了外源和/或内源核酸的细胞、以及以非天然方式(例如，通过操作分离的核酸和转化细胞)表达的多肽。术语“重组”尤其包括已经，至少部分地，在体外通过基因工程技术构建的核酸分子；该术语“重组”作为形容词用来描述分子、构建体、载体、细胞、多肽或多核苷酸时，明确地排除这些分子、构建体、载体、细胞、多肽或多核苷酸的天然形式。

术语‘平衡-致死宿主载体系统’或者‘平衡致死系统’指在转化的细胞群中维持质粒的一种技术，如并入本文作为参考的美国专利号5,672,345中所描述的那样。通常，平衡致死系统的特征在于能作为遗传稳定性群体维持的遗传改造的宿主细胞，其中该宿主细胞表达期望的重组基因产物。这个群体中的宿主细胞特征性地具有已失活的天然基因，所述天然基因编码细胞存活所必需的产物，例如酶。例如，对于平衡-致死系统的缺失靶标而言，如下编码基因的缺失或失活是一个良好的选择，所述编码基因表达催化必要组分，例如细胞壁，的生物合成步骤的酶。另外，缺失或失活的天然基因的功能由，例如在质粒表达载体上，导入的重组基因代替，该重组基因的表达可以提供该必需基因产物，从而允许细胞存活。因此，只有维持该平衡质粒的转化宿主细胞才能存活。有利的是，该质粒也可以包含用于期望基因产物的胞内生产的表达系统，或者优选地，必需基因产物的表达与期望基因产物的表达可操作地连接。本发明中，期望基因产物为重组CT-B，平衡致死宿主-载体系统有利地允许从通过该平衡致死系统而维持在转化细胞中的质粒载体产生重组CT-B。术语‘平衡致死表达载体’指能够指导期望产物(在本例中为重组CT-B)在宿主细胞中表达的表达质粒，该表达质粒也能够指导对应于宿主染色体中的缺失或失活基因的平衡基因表达。

提及‘重组CT-B的表达’是指通过向宿主细胞导入外来遗传物质而遗传操作宿主细胞从而表达霍乱毒素B亚单位或者其免疫原性部分，该术语不涉及并且排除由于可能存在或者保持在宿主细胞中的任何未修饰的染色体霍乱毒素B亚单位遗传基因座而自然表达的天然霍乱毒素B的表达。

本文中用到的其他术语的定义为本领域技术人员所理解和使用，和/或对于本领域技术人员而言其是从本文的用法中可以清楚的。

发明详述

本发明提供产生对抗霍乱弧菌和产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的双重免疫应答的免疫原性组合物。本发明的免疫原性组合物包含活的减毒霍乱弧菌细菌，该细菌经转化表达重组霍乱毒素B(CT-B)。在优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含遗传改变的霍乱弧菌菌株，该菌株已经被减毒到无毒并被转化而表达并优选地分泌重组CT-B。已经发现本发明的免疫原性组合物：.能定居胃肠道MALT，并能引起分泌型IgA免疫球蛋白的产生，其中IgA为期望的黏膜免疫产生的指示物，.能表达高水平的免疫原性CT-B多肽，例如，与霍乱弧菌亲本株(即，本发明的减毒转化霍乱弧菌所制备自的菌株)或致病的野生型霍乱弧菌株的CT-B产生量相比，该水平超过至少10倍，.能够表达该水平的CT-B而对于细菌宿主细胞没有毒性，以致于可以保持MALT定居所必需的细胞存活力，.能引起抗霍乱弧菌抗体，包括识别LT的抗CT-B抗体，产生，其中该抗体应答不仅与LT是交叉反应的，而且是中和抗体应答(也就是，该反应性抗体主动促进清除或者中和LT毒素功能)，另外，该抗霍乱弧菌抗体应答包括杀弧菌抗体，由此使得该组合物呈现双重免疫原性，即，对抗霍乱弧菌和ETEC抗原两者。

本发明的组合物可用任何能用于肠免疫以引起黏膜抗霍乱弧菌应答的霍乱弧菌无毒株制备。重要的是，选择的菌株能存活足够长的时间以定居胃肠MALT及引起免疫球蛋白的产生，并在宿主受试者中保持无毒和无反应原性以致于不诱发不能耐受的疾病症状。该菌株可以是任何生物型，即，经典型或El Tor。本发明的组合物可用霍乱弧菌的任何血清型制备，例如，Inaba，0139或Ogawa血清型。

霍乱弧菌已被公认为特别可以用作为口服疫苗的活“宿主”载体，这是因为这些细菌是肠道生物，当摄入后，能够感染并持久存留于人及动物的消化肠(尤其是肠道)中。因此，当给个体口服施用时，本文所述经基因改造可以超表达CT-B的活霍乱弧菌具有在消化道中建立群体(感染)的固有能力，由此可以提供期望的免疫原性CT-B抗原多肽的来源，在个体黏膜组织中引起免疫应答。已知大量的霍乱弧菌对于多数宿主具有高毒性，例如在人类和其他哺乳动物中导致霍乱或严重的腹泻，故对于接受疫苗组合物的靶个体而言，必须减弱霍乱弧菌菌株对该个体的毒力。细菌毒力的减弱不限于任何特定机制的消除或者抑制，并且可以通过霍乱弧菌基因组(可以包括染色体的及非染色体的遗传物质)中一个或多个基因的突变来实现。因此，‘减毒突变’可包括单一位点的突变或多个突变，其中，对于多个突变而言，这些突变可以一起提供针对接受活疫苗组合物的特定宿主个体的减毒表型。

近年来，已经开发了多种对个体致病性毒力减弱的霍乱弧菌，这些霍乱弧菌被提议用于开发各种活的细菌疫苗(参见例如美国专利号6,203,799；5,631,010；5,874,088；6,036,953；都以引用方式纳入)。对于霍乱弧菌菌株，稳定地消除微生物产生功能性霍乱毒素的能力的突变一直为减毒工作的焦点。因此，一直以来第一重要的是，通过缺失或失活ctxA基因以去除至少CT-A亚单位，并结合其他缺失或者突变以使该ctxA突变永久且不可逆转。因此，在任何情况下在基因组中伙同缺失recA基因、RS(长末端重复)序列和att噬菌体附着位点是尤其有利的。编码CT-B的ctxB基因也可缺失，以减少毒力；然而，由于缺少CT-A时功能性霍乱毒素无法形成，而且由于CT-B本身具有有用的免疫原性，故可能有利的是保留CT-B基因，或者，如本发明，可以通过遗传工程技术向宿主导入CT-B基因以产生过量重组CT-B作为补充免疫原。例如，Peru-15的减毒方式是采用大的基因缺失，从基因组中去除整个ctx遗传元件，但是将ctxB重新插入recA基因中，使recA的功能丧失，同时为了呈递抗原，保留一些CT-B的表达。参见如美国专利号6,203,799，以引用方式纳入。而且，我们的实验显示侯选疫苗分泌的增量的CT-B还可以在黏膜免疫中发挥相当佐剂的作用。

许多活的无毒霍乱弧菌疫苗株已经在文献中有过公开，其可以用于构建本文所述的免疫原性组合物以产生抗霍乱弧菌和产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的双重免疫应答。对于本发明的用途，优选的菌株是Peru-15(ATCC 55635)；然而，可以使用公开在美国专利号5,874,088中的其它优选菌株，例如，Peru-2、Peru-3、Peru-4、Peru-5、Bang-2、Bang-3、Bang-5、Bah-2、Bah-4或Bah-5。

如上述，重要的是，选择的菌株是无毒的，或者经遗传改变而是无毒的。本发明的突变菌株任选地包括引入以改善疫苗的安全性(例如，稳定的无毒性)和/或免疫原性的其它突变。这些其它突变包括但不限于，失活参与DNA重组的一个或多个基因、例如recA基因和基因组中存在的所有att噬菌体附者位点(见例如WO95/18633)。

如前提及的，重要的是，选择的霍乱弧菌菌株能够引起对抗霍乱弧菌(和ETEC)感染的黏膜免疫，由此活的无毒疫苗株是尤其有意义的。作为黏膜病原体，霍乱弧菌选择性地粘着胃肠道M细胞(Owen等，1986，同上引文)，并是黏膜免疫系统的强刺激物(Svennerholm等，1982，同上引文)。对黏膜相关淋巴组织(MALT)的这种定居可以特别有效地诱导局部免疫应答，该局部免疫应答的特征在于局部产生的分泌型IgA——开发对抗诸如ETEC和霍乱弧菌等病原体的有效疫苗的一种重要方面。(Holmgren&Czerkinsky，2005，同上引文)。

Peru-15已经在400多例受试者中被证实具有良好的耐受性(即，无反应原性)和免疫原性，诱导特征在于局部产生的分泌型IgA的强局部免疫应答(美国专利号6,203,799；Kenner等，J.Infect.Dis.172：1126-1129(1995)；Cohen等，Infect.Immun.70：1965-1970(2002))，并因此是尤其优选的菌株。

在优选实施方案中，本发明免疫原性组合物不仅包含已经减毒的遗传改变的霍乱弧菌菌株，而且还被转化以表达或超表达重组CT-B。甚至更优选地，该活减毒双重免疫原性菌株保持其分泌CT-B的天然能力。

CT-B已经被证实是引起抗霍乱弧菌免疫原性应答的有效抗原(美国专利号6,203,799；也参见)，同时其也是引起抗ETEC免疫原性抗原的有效抗原。这是因为大肠杆菌的热不稳定性毒素(LT)是在序列上与致病性霍乱弧菌表达的霍乱肠毒素(CT)紧密相关的寡聚毒素。与LT一样，CT由一个A亚单位(CT-A)和形成五聚体的B亚单位(CT-B)组成，该CT-B结合GM₁神经节苷酯。LT和CT共有许多特征，包括全毒素结构、蛋白质序列(＞80％序列同一性)、主要受体的身份、酶活性、和在动物和细胞培养物试验中的活性。此外，LT和CT具有部分抗原性交叉反应(Hirst，1999，同上引文)。

鉴于存在诱导产生表现CT/LT交叉反应性的抗体的这种可能性，我们制备了减毒霍乱弧菌以表达增量的CT-B并同时保持该免疫原性宿主的其它有利性质，由此提供用于产生抗霍乱弧菌和产肠毒素大肠杆菌(ETEC)双重免疫应答的疫苗候选物，和由此提供能够对霍乱弧菌和ETEC病原体两者赋予免疫保护作用的单菌株。

转化细菌宿主细胞以引起重组目的蛋白表达的方法是本领域熟知的。优选地，对于本发明的免疫原性组合物，通过导入能够指导CT-B在宿主细胞中表达的表达质粒，转化霍乱弧菌宿主细胞。在优选实施方案中，编码CT-B免疫原的结构基因包括分泌信号的编码序列，由此从宿主细胞排出可溶性CT-B。在其它实施方案中，CT-B免疫原在有力的组成型启动子例如Ptrc的控制下表达，以便在接种的受试者被感染后CT-B免疫原可以持续地产生(和分泌)。在其它优选实施方案中，霍乱弧菌宿主在其染色体中敲除了必需基因，例如glnA，而质粒CT-B表达载体还包括功能性互补基因(例如glnA)以平衡染色体中该基因的缺乏，由此提供可以用于在细胞复制时保持该表达质粒的选择压力，又称作平衡-致死宿主载体系统。

优选地，用于本发明的CT-B表达质粒经改造在宿主霍乱弧菌中过表达和分泌CT-B。在本文所述细菌菌株中，表达质粒还可以在质粒上含有一个或多个临近特定核苷酸序列3’末端的转录终止子，以防止转录不期望地进入质粒的另一区域。该转录终止子由此起到防止转录延伸至和潜在地干扰其它关键质粒功能(例如，复制或平衡基因表达)的作用。可以用于本文所述抗原编码质粒中的转录终止子的实例包括但不限于，来自5S核糖体RNA细菌基因的T1和T2转录终止子(Brosius和Holy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6929-6933(1984)；Brosius，Gene，27(2)：161-172(1984)；Orosz等，Eur.J.Biochem，201(3)：653-659(1991))。

如Ryan等，Infect.Immun.68(1)：221-6(2000)之前所述的，表达质粒可以通过使用平衡-致死系统，基于对染色体基因中的突变的弥补，而维持在减毒细菌宿主菌株中(也参见，Nakayama等，Bio/Technology，6：693-697(1988)和美国专利号5,672,345，并入作为参考)。如前所述，平衡致死系统的特征在于能够作为遗传稳定群体维持的遗传工程化宿主细胞，其中该宿主细胞表达期望的重组基因产物。该群体中的宿主细胞特征性地具有失活的天然基因，该天然基因编码对细胞存活必需的产物，例如酶。此外，该缺失的或失效的天然基因的功能由在质粒表达载体上导入的重组基因代替，由此，重组基因的表达可以提供该必需基因产物，从而允许细胞存活。因此，只有维持该平衡质粒的转化宿主细胞才能保持存活。优选地，该质粒还含有用于产生期望基因产物的表达系统，或者优选地，该必需基因产物的表达与该期望基因产物的表达可操作地连接。在本发明中，期望基因产物是重组CT-B，平衡致死宿主载体系统有利地允许该重组CT-B自通过该平衡致死系统而保持在该转化细胞中的质粒载体上产生。

本文所述CT-B表达质粒包含一个或多个编码CT-B或其免疫原性部分的核苷酸序列，其中该CT-B或其免疫原性部分引起与LT免疫交叉反应的抗体产生。CT-B的编码序列是已知的。见Mekalanos等，Nature，306：551-557(1983)。该编码序列与转录启动子可操作地连接，其中当霍乱弧菌细菌菌株被哺乳动物受试者摄取或者以其它方式接受时，所述转录启动子在该菌株中将是有功能的。已知多种天然的、重组的、和半合成的启动子可以在肠道细菌中发挥作用，例如λPR(λ噬菌体)和来自噬菌体P22和T4的启动子。可用于本发明的启动子(P)包括但不限于熟知的和广泛使用的基因表达启动子，例如，lac操纵子的天然Plac和半合成的Ptrc(见例如，Amman等，Gene，25(2-3)：167-178(1983))和Ptac(见例如Amann等，Gene，69(2)：301-315(1988))。

已知一些启动子是调节型启动子，为了起始与其可操作连接的编码序列转录，其需要某种激活物或诱导分子的存在。然而，一些启动子可以在大肠杆菌中是调节型或诱导型启动子，而在霍乱弧菌中作为不受调节的启动子起作用。此类启动子的一个实例是熟知的trc启动子(“Ptrc”，见例如Amman等，1983，同上引文)。与Plac和Ptac一样，Ptrc在大肠杆菌中作为诱导型启动子发挥作用(例如，使用诱导分子异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷，“IPTG”)，而在无lacI阻遏物的霍乱弧菌细菌中，Ptrc是有效的组成型启动子，可以容易地指导本文所述质粒上存在的编码CT-B多肽的结构基因转录。因此，为了在霍乱弧菌中表达CT-B抗原，此类组成型启动子并不依赖于激活物或诱导分子的存在。

可用于本发明的CT-B表达质粒还包含复制起点(ori)，其使得该质粒可以在细菌细胞中以多拷贝维持。本领域已知许多可以在霍乱弧菌细菌中复制的多拷贝质粒，还已知各种可以用于维持质粒多拷贝的复制起点。在本文所述多拷贝抗原表达质粒中使用的优选复制起点包括来自多拷贝质粒pBR322的复制起点(“pBR ori”，见例如Maniatis等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，1982)，pp479-487；Watson，Gene，70：399-403，1988)和pUC质粒的复制起点(“pUC ori”)，例如质粒pUC18上的复制起点(见例如Yanish-Perron等，Gene，33：103-119(1985))。

如前所述，尤其优选的是本文公开的本发明菌株，与用于制备本发明疫苗候选物的亲本菌株相比，或与病原性野性型霍乱弧菌相比，过表达或超表达CT-B。如本文所述，此超表达对于引起如下抗CT-B抗体产生是重要的，该抗CT-B抗体也识别LT，而且其不仅与LT交叉反应，还可以中和LT功能。本文公开的菌株能够表达高水平免疫原性CT-B多肽，例如，该水平，与本发明减毒转化霍乱弧菌所制备自的亲本霍乱弧菌菌株的CT-B产量相比，或者与野生型致病性霍乱弧菌的CT-B产量相比，高至少10倍、至少25倍、至少35倍、至少50倍、或者更多。例如，如以下本实施例所显示的，本发明Peru-15(pCTB)实施方案，与Peru-15亲本菌株相比，产生多大约30-60倍的CT-B抗原。CT-B的相对表达水平可以通过本领域已知的标准方法，例如抗原捕获ELISA(如Ryan等，Infect.Immun.65(8)：3118-25(1997)所述)，测量。

然而，本领域熟知，重组多肽的超表达，更特别地毒素的重组表达，常常被证明对细菌宿主细胞是有毒的(见Galen等，Trends Microbiol.9(8)：372-6(2001))。如前提及的，关键的是本文公开的菌株存活足够长的时间以便能够定居MALT和产生及分泌增加的CT-B以引起特异免疫球蛋白产生。

其次，有时观察到，当细菌宿主细胞用于超表达重组蛋白(例如，异源抗原)时，细菌宿主细胞的生存力可能会受到不利的影响，或者宿主细胞的代谢机器可能会因重组表达系统而过度负荷，而这又可能导致转化的宿主细胞成为无效免疫剂。

然而，尽管存在这些已知缺陷，但是已经发现本文公开的菌株，虽然与亲本菌株相比超表达CT-B，却具有令人惊奇的稳定性。鉴于据信这种增加的毒素表达，即CT-B的超表达，可能被证实对菌株是有毒的，故这一发现是尤其令人惊奇的。而且，该超表达CT-B的菌株保持了引起杀弧菌免疫应答的能力，即，对宿主霍乱弧菌的转化并没有造成该宿主产生抗霍乱弧菌免疫应答的能力丧失。

本文所述和下面实施例中进一步阐述的霍乱弧菌，经修饰而增加地表达CT-B，其在哺乳动物受试者体内引起强抗体应答，导致高的杀弧菌抗体效价以及令人惊奇地高的LT毒素中和效价。来自两个体内动物模型的数据显示，该菌株提供了引起对抗霍乱弧菌和ETEC(LT)感染的期望双重抗体应答的免疫原性组合物。

为了更为全面地说明本发明，提供以下非限制性实施例。

实施例

实施例1

细菌菌株和生长培养基

如先前已经描述的(参见例如WO 95/18633)，Peru-15是一种减毒O1 El Tor Inaba霍乱弧菌菌株。Peru-15ΔglnA为Peru-15的glnA缺失衍生物。大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Carlsbad，CA)及MGN7027，JM105的一种ΔglnA衍生物(Yanisch-Perron C.et al.，Gene，33(1)：103-19(1985))用于克隆。LB(Luria-Bertani)培养基是从Difco实验室(Difco，Detroit MI)获得的。LB-V，一种以植物为基础的丰富培养基，每升含有20克的HiVeg Luria肉汤(HiMedia Laboratories，PVT.LTD.，孟买，印度)和5克氯化钠。为了保持GlnA平衡致死质粒，细胞在M9V中培养，该培养基每升含有M9基本盐(Difco，Detroit MI)，2mM MgSO₄，0.5％葡萄糖和5克HiVeg酸水解物——一种植物来源的培养基(HiMedia实验室，PVT.LTD.，孟买，印度)。对于固体培养基，加入1.6％的琼脂。接种动物的细菌在M9V培养基中37℃生长到OD₆₀₀为1.0，在PBS中浓缩到需要的剂量，并同天给药。

Peru-15ΔglnA平衡致死宿主菌株的构建

Peru-15ΔglnA用同源重组方法构建，基本上如Ryan et al.，2000，同上引文中的描述。同源重组需要在Peru-15上已缺失的功能性recA基因。由此，向Peru-15中引入带有功能性recA拷贝和作为选择性标记的四环素抗性基因的质粒pLAFR-recA，以产生Peru-15(pLAFR-recA)。

自杀质粒pKEK70带有一个通过PCR技术来源于霍乱弧菌经典Ogawa菌株0395的glnA基因拷贝，该基因拷贝在其内具有354bp的缺失，去除了氨基酸134到251(Ryan et al.，2000，同上引文)。另外，质粒pKEK70编码bla(氨苄青霉素抗性基因)和sacB(赋予蔗糖敏感性的基因)。将质粒pKEK70通过接合，导入Peru-15(pLAFR-recA)中，选择氨苄青霉素抗性。重组子在氨苄青霉素不存在的情况下生长并铺在含有10％蔗糖的LB平板上。选择蔗糖抗性、氨苄青霉素敏感并需要谷氨酰胺用于生长的菌落。为了消除pLAFR-recA质粒，将分离的菌落培养在补加谷氨酰胺的抗生素培养基#3上。从培养板上刮下细胞，悬浮于PBS中，并铺于LB培养板上，在37℃孵育过夜。菌落影印于含有四环素的LB培养板上，以鉴定指示该质粒丧失的四环素敏感性菌落。鉴定了四环素敏感的菌落，并通过对紫外光的敏感性确证为recA阴性。质粒的丧失也通过DNA小量提取分析证实。这种无质粒、对氨苄青霉素和四环素均敏感的分离菌称为Peru-15ΔglnA。ΔglnA的缺失通过使用在该缺失序列外杂交的引物经PCR技术验证。

质粒pMEG-2350和Peru-15pCTB的构建

通过PCR，以CT1146-PacI(CGACTTAATTAACCCGGCTTCATC GATCAGTAATACTTGCG)(SEQ ID NO：1)和CT1664-BamHI(GACGGATCCCTTAATTTGCCATACTAATTGCG)(SEQ ID NO：2)为引物，使用从霍乱弧菌菌株C6709制备的染色体DNA为模板，克隆ctxB基因。PCR产物按照生产厂家的建议克隆入质粒pCR-Blunt-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)，通过电穿孔法导入大肠杆菌TOP10细胞中。DNA序列分析证实所选择的克隆具有预期的序列。ctxB基因作为537 bpEcoRI-BamHI片段亚克隆入质粒pMEG-2106(一种低拷贝数的GlnA+平衡致死表达载体)中，产生质粒pMEG-2350(图1)。质粒pMEG-2350的特征包括：P_cat启动子控制下的glnA基因，pSC101复制起点和par基因座，以及P_trc启动子控制下的ctxB基因。

质粒pMEG-2350通过电穿孔法导入Peru-15ΔglnA，选择在谷氨酰胺缺乏的M9V琼脂培养基上生长的菌落。通过如下方式验证质粒的存在：使用QIAprep miniprep spin试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany)从过夜培养物中制备质粒DNA，并用琼脂糖凝胶电泳法评估该DNA。选择了一个分离菌并命名为Peru-15(pCTB)。

细胞上清液的SDS-PAGE和Western印迹、菌落印迹和定量ELISA

培养物在M9V肉汤中生长到600nm光密度(OD₆₀₀)达到1.0。离心去除细胞。再次离心上清液，去除任何残余细胞。上清液中的蛋白质通过三氯乙酸(TCA)沉淀法浓缩60倍。将TCA沉淀悬浮于上样染料中，取10μl上样在15％SDS-PAGE凝胶上，电泳，接着用GelCode Blue Stain(Pierce)染色。为了评估五聚体化，无细胞的上清液用Pierce iCON浓缩器浓缩70倍。对于Western印迹，将一式两份凝胶转移到硝化纤维素上。在含有0.1％Tween-20和5％奶的PBS中过夜封闭。在带有5％奶的PBS中加入多克隆兔抗CT-B抗体(Accurate Chemical and ScientificCorporation，Westbury，NY)，室温孵育2小时。用PBS-Tween洗涤过滤器，加入二级HRP缀合的抗兔抗体(KPL)。用ECL检测试剂(AmershamCorporation，Louisville，CO)检测特定的条带。

用抗原捕获ELISA方法，如Ryan et al.，1997，同上引文中所述，测定分泌到培养物上清液中的CT-B的量。

通过在染色的考马斯蓝染色凝胶(图2A)上评估TCA沉淀的培养物上清液和通过Western印迹(图2B)，验证了CT-B的表达。在细胞沉淀物中没有检测到CT-B。分泌的CT-B的五聚体化通过电泳加热和未加热的上清液样品(图2C)得到证实。未加热的样品电泳呈现出大的复合物，而如针对五聚体CT-B所预期的。加热破坏了该复合物。用定量ELISA测量Peru-15(pCTB)和Peru-15指数生长中期培养物的上清液中的CT-B量。以CT-B/OD₆₀₀/毫升来表示结果以校正光密度差异。带有一个ctxB染色体拷贝的Peru-15分泌0.16微克/毫升CT-B，而Peru-15(pCTB)却令人惊奇地分泌4.9微克/毫升的CT-B。这个差别说明CT-B表达和分泌的30多倍增加。以每个细胞为基础，与Peru-15产生0.17微克/1×10⁹细胞相比，Peru-15(pCTB)产生6.8微克/1×10⁹细胞。

生长Peru-15(pCTB)用于稳定性实验

在初始稳定性实验中，稍微融化一管冷冻贮存物，取5微升转移到含2毫升M9V肉汤的培养管，通气37℃培养6个小时。取5微升转移到含50毫升新鲜M9V培养基的250毫升摇瓶中，通气培养细胞20-24个小时。取5微升细胞转移到50毫升新鲜培养基中。第三轮转移(40代)后，培养物铺在M9V琼脂板上，过夜孵育。随机挑选10个菌落，划线于M9V板上。10个分离菌之每一个在M9V肉汤中生长过夜培养物。对TCA沉淀上清液进行Western印迹，测量了CT-B的表达。

对于模拟生产条件的稳定性实验，一式三份地在37℃利用M9V培养基进行所有生长。冷冻贮存物划线于M9V平板上，过夜孵育。取单菌落接种于含8毫升肉汤的50毫升三角瓶中。过夜孵育，取0.25毫升接种于含25毫升肉汤的250毫升三角瓶中。三角瓶强烈通气直到培养物的OD₆₀₀达到1.0。加入丙三醇至15％，将1毫升的等分试样转移到冻存管中，-80℃过夜保存。

第2天，融化2个小管，取1.6毫升接种到含50毫升新鲜肉汤的250毫升三角瓶中。培养物过夜静置培养，然后以1∶20稀释度接种到含300毫升肉汤的1升三角瓶中。通气生长到OD₆₀₀达到1.0。加入丙三醇至15％，将1毫升等分试样-80℃冻存。再一次重复该过程。

最后的小瓶为25代生长，将其融化并铺于琼脂平板上。将来自该一式三份试样的该3轮操作的98个菌落点在M9V平板上，过夜孵育。也包括Peru-15作为对照。用如上针对Western印迹描述的相同抗体，通过菌落印迹法评估了CT-B表达。用ECL检测试剂检测了CT-B表达菌落(Amersham Corporation，Louisville，CO)。

通气培养大约40代，并如前述方法铺板。随机挑选10个菌落，过夜培养，用Western印迹法评估分泌的CT-B。所有十个菌落的CT-B表达水平与起始培养物相比均无区别。

在如上所述一式三份运行的第二实验中，在设计以模拟用于产生cGMP种子库(Seed Bank)和最终药物产品(Final Drug Product)的生产过程的条件下，在M9V中生长细胞总共大约28代。最后的培养物铺于平板上，并进行菌落印迹分析。测试的所有菌落(100％，294个中的294个)保留了与Peru-15(pCTB)起始培养物无差别的表达水平，并且很容易与Peru-15呈现的低水平表达区分开来(参见图3)。这些数据说明，在用于Peru-15(pCTB)生产的严格条件下，CT-B表达令人惊奇地稳定，  尤其是考虑到与亲本菌株相比CT-B表达水平的30倍增加时，更是如此。这是弧菌中该表达的第一个实例。这种稳定性是令人惊奇的，这是因为据认为增加的毒素表达，也就是，CT-B超表达，对于该菌株将被证明是有毒的(Galenet al.，Trends Microbiol.，9(8)：372-6(2001))；然而，如同在本实施例中所证实的，该菌株在至少28代以后仍保持稳定并继续超表达CT-B。

Peru-15(pCTB)和Peru-15在鼻内免疫的小鼠中的免疫原性

具有5只BALB/c小鼠的组(Charles River，Wilmington，MA)在第0天用1×10⁹ CFU测试生物于20微升PBS中进行鼻内免疫，并在第28天接受加强免疫。在第21天和42天通过尾部取血，采取血清样品。最后的血清样品在第56天于终止小鼠生命后通过心脏穿刺收集。用酶联免疫吸附实验(ELISA)分析血清IgG。96孔聚苯乙烯板用纯化的CT-B(每孔100纳克)(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO)包被，4℃过夜。室温用2％酪蛋白Tris-HClpH 7.6封闭孔30分钟。用酪蛋白Tris-HCl pH 7.6中的100倍初始稀释物的2倍系列稀释物，测定终点效价。血清稀释物在板上于室温孵育2个小时。洗涤孔，然后加入山羊抗小鼠IgG碱性磷酸酶缀合的抗体(KPL，Gaithersburg，MD)，室温1个小时。加入BluePhosMicrowell底物(KPL Gaithersburg，MD)使该试验显色，室温保持10分钟后，于630nm波长读数。

接种Peru-15(pCTB)的小鼠出现高抗CT-B效价，到第42天几何平均效价(GMT)为3200(见表1)。所有接种Peru-15的小鼠的抗CT-B效价在所有检测时间点都少于100；在两种免疫菌株之间观察到血清IgG应答的最低32倍的差异。重复该实验两次，获得相似结果(到56天，Peru-15(pCTB)的GMT≥3,200；Peru-15的GMT＜100)。这些数据强烈地证实，增加分泌型重组CT-B的量可以导致抗CT-B抗体免疫应答成比例的增加。这个观察结果也有点令人惊奇，因为抗原对抗体的关系并非是线性的，也就是，在一定程度的抗原暴露之后产生的抗体的量会趋向于达到平台。增加抗原的量并不能总是导致免疫应答的增加；然而，如本文中所示，Peru-15pCTB中CT-B表达的30倍增加导致了血清IgG几乎相等的32倍差异。

表1：来自Peru-15或Peru-15(pCTB)免疫的小鼠的抗CT-B几何平均血清IgG效价

Peru-15(pCTB)和Peru-15在口服免疫的兔中的免疫原性

已经证实口服兔模型可用于在人类研究之前评估Peru-15的免疫原性(Linnetz et al.，Contemporary Topics，43(4)：58(2004))。开展两个实验，给兔通过口胃途径施用单剂Peru-15或者Peru-15(pCTB)。

新西兰白兔(Milbrook Breeding Labs，Amherst，MA)在免疫之前不供给食物和水过夜。时间为0(t＝0)时，肌内施用由50mg/kg氯胺酮和3mg/kg甲苯噻嗪组成的麻醉药。在t＝20分钟时，静脉注射甲氰咪胍(50mg/kg)。甲氰咪胍用无菌盐水稀释到5毫升施用体积。在t＝35分钟时，用一次性塑料动物饲管(Tyco Healthcare，Kendall Company#155722，饲管，8fr×15”，无菌)，经口灌喂，给予每只兔子10毫升0.5M NaHCO₃(pH 8)。在t＝50分钟时，给予另10毫升重碳酸盐缓冲液，紧跟着给予10毫升剂量的于重碳酸盐缓冲液中的新鲜生长的细菌。在t＝80分钟时，腹膜内施用吗啡(5mg/kg)(用无菌盐水稀释到5毫升施用体积)。

特异于CT-B和LT的兔抗体的检测试验

血清抗体用下面描述的ELISA方法检测。96孔微滴定多孔板(Nunc，Rochester，NY)孔用神经节苷酯(GM₁)以每孔100纳克在碳酸钠包被缓冲液中4℃包被过夜。温育以后，轻轻倒出GM₁，用CT-B或者LT(List Biological Laboratories，Inc.，Campbell，CA)用相同的方式包被微量滴定板。然后，板子于室温用于TBS稀释剂中的酪蛋白试验缓冲液封闭。兔血清用试验缓冲液进行系列稀释，从1∶100到1∶204,800；每孔加入100微升稀释的血清，板于室温孵育2个小时。每个板还加有一个阳性对照以确保试验的有效性。在所有添加之间，用含有0.1％Tween 20的TBS洗涤板。于室温加入HRP山羊抗兔IgG(KPL，Inc.，Gaithersburg，MD)1个小时，之后加入TMB过氧化物酶底物(KPL，Inc.，Gaithersburg，MD)，室温10分钟显色。用硫酸(H₂SO₄)终止反应，之后，板在Versamax微板读数仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上于450nm读数。抗体效价测定为在450nm产生的吸光度超过背景吸光度2倍的最大稀释度的倒数。

用相似程序在ELISA中使用特异的IgA第二抗体试剂测量了血清抗CT-B IgA抗体

在两个实验中，到第19天在接种Peru-15(pCTB)的动物中观察到对CT-B的高血清IgG效价，比接种Peru-15的动物高大约30倍(见图4)。在第43天，Peru-15(pCTB)的峰GMT是＞5000，然而Peru-15的峰GMT是141。直到第93天，当实验终止时，血清IgG效价仍保持高水平。巧合地，在第19天，接种Peru-15(pCTB)的动物的血清IgA效价也达到峰值(见图5)，并直到第43天仍保持高水平。Peru-15诱导了略微低的IgA效价，该IgA效价在第30天达到顶峰，但遵循着相似的时间进程。

也测量了抗LT全毒素的血清效价(见图6)。出乎意料的是，在接种Peru-15的动物中引起的效价小于50，除了在第43天时效价为56。相比较，用Peru-15(pCTB)免疫的动物的抗LT效价在第43天达到713的峰GMT，之后效价缓慢下降。

杀弧菌抗体试验

血清杀弧菌抗体效价在微量测定试验中进行了测定。受试血清的内源补体活性通过在56℃加热血清1个小时而被灭活。在无菌96孔组织培养板孔中加入50微升受试血清的系列两倍稀释物和PBS。向每个血清稀释物中加入50微升在具有22％豚鼠补体的PBS中的10⁸CFU/ml霍乱弧菌N16961培养物，在37℃孵育板1小时。然后，每孔中加入150微升脑心浸液液体培养基，在37℃孵育板2.5小时。测量OD₆₀₀值。以孔中产生‘不生长’的最高稀释度的倒数表示效价。

用Peru-15(pCTB)免疫的兔的杀弧菌抗体GMT大约是用Peru-15免疫的兔的两倍(见图7)。Peru-15和Peru-15(pCTB)引起的免疫应答的动力学是相似的，在整个实验过程中在第19天达到顶峰并逐渐地减弱。

热不稳定性毒素(LT)中和试验

也在组织培养物模型中对来自Peru-15或Peru-15(pCTB)免疫的小鼠组的血清中和LT全毒素的效力的能力进行了评估。使用Y1肾上腺细胞在毒素中和试验中测量了免疫动物的血清中和LT活性的能力，操作见Tauschek et al.，Proc.Natl Acad.Sci.U SA，99(10)：7066-7(2002)中的描述。简而言之，将250pg于DMEM中的LT加入孔中，该孔含有一系列开始于1∶40的稀释至DMEM中的血清稀释物，并将孔在37℃温育1小时。将该混合物加入含有2×10⁴Y1细胞的孔中，过夜孵育，目测确定了每孔中圆形细胞的数目。

在来自两组小鼠的合并的放血前(pre-bleed)样本中不含有可检测的功能性或中和性抗体。然而三个实验中，接种Peru-15(pCTB)的小鼠的血清GMT倒数为从1158到2660(见表2)。这些数据支持之前的观察结果，即抗CT-B抗体与LT交叉反应，并说明Peru-15(pCTB)引起的免疫应答可以产生功能性LT毒素中和抗体。有趣地是，接种Peru-15的小鼠的中和抗体GMT为83-110，这是令人惊奇的，因为我们用ELISA没有检测到任何抗CT-B。

当我们检查来自兔实验的第56天血清中和LT的能力时，发现两个实验中用Peru-15免疫的动物具有252和272的GMT。Peru-15(pCTB)接种导致了6400和6912的GMT，大约增加了25倍。这与在该相同时间点观察到的抗CT-B ELISA效价的增加是相关联的。

表2：用Peru-15(pCTB)或Peru-15接种的动物的几何平均LT毒素中和血清效价^＊Peru-15未包括在本实验中。

以上结果显示，经遗传改造能稳定表达高水平的CT-B的活减毒霍乱/ETEC疫苗侯选物Peru-15(pCTB)，与其亲本菌株Peru-15相比，在两种不同的动物模型中都诱导实质上更高效价的CT-B和LT特异性抗体。在鼠免疫原性实验中，鼻内给予两个剂量的Peru-15(pCTB)造成了高血清效价，而使用Peru-15得到的效价低于检测限。在兔免疫原性研究中，单个剂量的Peru-15引起了100至200之间的峰值抗CT-B效价，而Peru-15(pCTB)免疫引起了高10-25倍的效价，由此在抗原的较高水平表达和免疫应答的增加之间建立了强联系。

兔模型中获得的双重免疫原性数据对于开发有用的人类疫苗具有重要意义，因为该临床施用是口服单剂量方案。与Peru-15或者接种动物的放血前(pre-bleed)相比，用Peru-15(pCTB)接种兔后，获得抗CT-B平均血清IgG效价的最高50倍增加(见图4)以及抗LT平均效价的最高14倍增加(见图6)。抗LT效价的此14倍增加比在接受单剂含有1毫克CT-B的口服全细胞霍乱疫苗的自愿者中看到的3.3倍抗LT效价增加(Glenn et al.，Infect.Immun.，75(5)：2163-70(2007))要大。这些结果说明，由本公开的双重免疫原性微生物导致的CT-B生产水平足够引起有些相当于1毫克单个大剂量(bolus dose)CT-B的免疫应答。

抗CT-BIgG效价比抗LT IgG效价高大约7倍(见图4和图6)。对于观察到的此差异，一个原因是，虽然CT-B与LI-B非常类似，但它们并不相同，可能存在只特异于CT-B的一些抗体。尽管无庸置疑地该解释可以部分地说明观察到的此差异，但是可能还存在一个显著的影响因素，即，由在ELISA实验中使用单独的B亚单位和全毒素之间的结构差异所造成的影响。这个观点从如下发现中获得支持：当在这两个试验中评估用纯化的LT超免疫的兔的血清时，发现抗CT-B效价比抗LT效价高8倍。因此，可能地这些试验不足以灵敏地检测CT特异性抗体；然而，令人鼓舞的是，在这些实验动物中产生的抗CT-B抗体与抗LT全毒素所产生的抗体具有相似的行为。

在兔中观察到的杀弧菌效价说明，Peru-15中高水平的CT-B表达没有减小Peru-15(pCTB)作为免疫原性组合物引起抗霍乱保护作用的效力。实际上，杀弧菌效价在每个时间点都几乎高2倍，尽管在第57天(p＝0.02)之前该差异不具有统计学显著性((p＞0.05)。

以前提及过，来自活载体中的质粒的保护性抗原的超表达对于宿主可能是有害的(Galen et al.，2001，同上引文)。几个因素能增加新陈代谢的负担，因此影响表达抗原的活细菌疫苗的健康状况和稳定性，包括质粒的大小，质粒的拷贝数，密码子使用，以及表达系统(Galen et al.，2001，同上引文)。结果是，引起减少的基因表达的点突变或缺失会发生累积，造成一群细胞丧失表达免疫原性量的抗原的能力。在本文中，在实验条件下培养40代后以及在模拟的cGMP种子库和终药物产品生产条件下培养28代后，评估了Peru-15(pCTB)的表达。惊奇的是，在两种情况下，分离菌都没有丧失分泌高水平的CT-B的能力，显示Peru-15(pCTB)对于生产及临床开发具有合适的稳定性。

在以前的一个研究中，接种灭活全细胞霍乱疫苗的大学生到第35天产生了152的抗CT-B倒数几何平均效价——基线上12倍的增加(Scerpella et al.，J.Travel Med.，2(1)：22-27(1995))。该实验中，接种Peru-15的自愿者到第21天获得了48的效价(Sack et al.，J.Infect.Dis.，176(1)：201-5(1997))。如果从我们的动物实验数据外推，用Peru-15(pCTB)免疫，与接种Dukoral或Peru-15相比，可能诱导更高的效价，从而导致改善的双重免疫原性的疫苗侯选物。而且，用Peru-15、CVD 103-HgR或实现的CT-B血清转换不是100％(见Scerpella et al.，1995；Sacket al.，1997；Cryz et al.，Vaccine，8(6)：577-80(1990))。这与本文公开的Peru-15在两种动物模型中的结果是一致的(见表1和图4)。没有小鼠发生血清转换，6只兔中只有3只到第56天发生了血清转换(效价＞100)。相对照，当用Peru-15(pCTB)接种时，令人惊奇地所有小鼠到第42天都已经发生了血清转换，所有兔到第19天都已经发生了血清转换，这说明Peru-15(pCTB)双重免疫原性微生物可以在受试者中导致更高的CT-B IgG效价和更高的血清转换率。

这些研究证实Peru-15(pCTB)作为一种遗传改造的活减毒霍乱弧菌疫苗侯选物的优越性，其具有双重免疫原性，可以用于提供抗霍乱弧菌和产肠毒素大肠杆菌感染两者的保护作用。

以上说明书中引用的所有专利、专利申请和出版物均并入此处作为参考。

基于前述公开，本文描述的本发明的其它变体方案和实施方式对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本文描述的具体实施方案的所有这些明显变型方式均落入后附权利要求所描述和定义的本发明的范围内。

微生物保藏

依据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(2004年12月2目)，以下霍乱弧菌菌株中的一个或多个保藏在美国典型培养物保藏中心(10801University Blvd.Manassas，Virginia，20110-2209USA)：霍乱弧菌菌株Peru-15(ATCC保藏号55635)(已有保藏)和霍乱弧菌菌株Peru-15pCTB(ATCC保藏号PTA-9130，2008年4月8日保藏)。