番茄植株地上部人工接种根结线虫的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种番茄根-根结线虫互作体系，具体涉及番茄植株地上部人工接种根结线虫的方法。

背景技术

根结线虫(Meloidogyne spp)可以寄生2000多种植物，给农作物生产带来严重损失。抗病育种是防治该病害的最根本措施。植物根结线虫病的典型症状是，在寄主植物的根部形成根结。组织病理学研究表明：根结内部除有不同龄期的根结线虫外，还有由寄主细胞演变成的巨型细胞，根结线虫固着寄生在植物体内，从巨型细胞内吸收营养成分，直到完成生活史。根结内巨型细胞的体积是正常根细胞大小的50～400倍左右，其含有的植物核酸、蛋白质成分成倍增加。

近年来，根结线虫与寄主植物相互作用是国内外研究的热点，国内外对与根结的形成和维持密切相关的基因进行了较为深入的研究。对部分基因沉默效果表明，基因沉默后，会降低寄主植物的根结百分率，这为利用转基因技术培养抗根结线虫的植物品种开辟了新的途径。

番茄是全世界的重要蔬菜，番茄根结线虫病普遍发生，第一个植物抗结线虫Mi基因在野生番茄植株中发现以后，各国都在开展番茄抗根结线虫研究。以番茄根结线虫病为对象开展的新型杀线剂药效评价，也一直在进行中。

番茄根-根结线虫互作体系一直是人们开展以上研究的重要对象。为了便于观察接种结果，相继建立了砂培、水培、组织培养的番茄根-根结线虫接种技术。这些接种体系各有所长，但分别存在如下缺陷：

1、番茄根-根结线虫砂培技术

番茄根-根结线虫砂培技术是广泛使用的技术，主要技术环节是将番茄种在砂土中，将根结线虫接种在番茄根部。该技术的缺陷是接种部位的不确定性，由于采用将根结线虫悬浮液浇灌在植株根部进行接种，所以到底那个根尖会形成根结，难以预料。要检查根结时，必须将根从土中取出来，洗干净后，才能观察，这样往往会损坏植株的根，导致根不能再生长。另外，在接种中，由于根系生长过程不直观，人们往往只能接种1次，要重复接种和定点接种几乎是不可能的事情。由于接种体系中根结线虫侵染时间的不确定性，往往只能30天之后，才能检查接种结果。

2、番茄根-根结线虫水培技术

为了能够观察根结的发展过程，人们利用水培技术来培养番茄根-根结线虫体系。该技术的主要环节是将接种后的番茄植株培养在营养液中，该技术具有易于观察根结发展过程，但与砂培技术同样存在着难以重复接种和定点接种的缺陷，同时水培技术也比砂培技术复杂。

综上所述，现有技术都是将2龄根结线虫接种到番茄根部，诱导番茄根部形成根结。由于根的生长需要各种各样的基质，根部一旦进入基质，形成的根结不易重复观察，要进行番茄根部根结线虫的多次重复接种和定点定量接种，几乎是不可能的事情。鉴于番茄植株地上部位可以连续生长，因此急需要开发一套成熟的番茄植株地上部位人工接种根结线虫技术，满足科研和生产部门的需要，为建立快速的、环保的根结线虫防治措施做出贡献。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，尤其是针对番茄对根结线虫的抗性评价、防治根结线虫药效检测、番茄与根结线虫互作信号检测的番茄根-根结线虫互作体系中所遇到的接种结果不直观、操作繁琐、培养体系容易污染、难以定点、定量接种等技术问题，提供一种番茄植株地上部人工接种根结线虫的方法，建立容易操作、接种结果直观、可以重复接种和定点定量接种的番茄叶、芽、茎部根结线虫接种方法。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

提供一种番茄植株地上部人工接种根结线虫的方法，将番茄地上部接种部位表面消毒后，将根结线虫2龄幼虫悬浮液接种到接种部位，保湿一定时间后即可检查接种效果。

优选地，番茄地上部接种部位可选择移栽2周后的番茄植株的顶芽下的第3张番茄叶片、移栽2周后的番茄植株的顶芽下的第1张番茄嫩叶片叶柄与茎交界处或移栽2周后的番茄植株地上部位2cm高度的主茎。

本发明方法具体包括以下步骤：

(1)培育接种用番茄苗；

用0.5％的高锰酸钾浸泡育苗盘24h，进行表面消毒。感病番茄种子用6％的次氯酸钠表面消毒10min后，用75％的酒精表面消毒2min，用灭菌水洗5次，播种在装有已消毒混合基质的育苗盘中，种子发芽2周后，将番茄苗移栽到装有已消毒混合基质的塑料盆中，塑料盆直径优选为20cm，每盆移栽1棵，每天浇水，每周施浇氮(N)∶磷(P)∶钾(K)为20∶20∶20的营养液(NPK)1次。移栽后的番茄苗放置在温室内(25℃～31℃，相对湿度65％～95％)。所述混合基质为沙和土按照体积比例为4∶1混合的混合物。

(2)制备接种用根结线虫2龄幼虫悬浮液；

将根结线虫的卵囊用0.5％的次氯酸纳进行表面消毒5min后，加5倍体积的灭菌水稀释，以8000转/分种速度离心5min，灭菌水洗4次，放在室温下孵化48h，以3000转/分的速度离心4min，收集2龄幼虫，用灭菌水配制成2000条/mL的浓度，现配现用。

(3)于番茄叶上进行人工接种根结线虫：

优选移栽2周后的番茄植株的顶芽下的第3张番茄叶片，用70％的酒精表面消毒30s后，用灭菌水洗4次，室温下自然风干后，用灭菌的细针沿叶脉刺破叶的表皮5～6处，不要刺穿叶片，每叶滴加50μL步骤(2)制备的根结线虫2龄幼虫悬浮液，其中含100条活根结线虫2龄幼虫。用保鲜膜包裹整个叶片进行保湿。优选地，在叶柄部位放置加有灭菌水的棉球加强保湿，每4h往棉球上加水一次，保湿4天。

或者于番茄芽根进行根结线虫人工接种：

优选移栽2周后的番茄植株的顶芽下的第1张番茄嫩叶片叶柄与茎交界处，用70％的酒精表面消毒1min后，用灭菌水洗4次，室温下自然风干后，用灭菌后的微量注射器，注射50μL步骤(2)制备的根结线虫2龄幼虫悬浮液，其中含100条活根结线虫2龄幼虫，注射深度不超过所注射部位顶芽直径的的一半，用保鲜膜包裹整个芽进行保湿。优选地，在注射孔的下部放置加有灭菌水的棉球保湿，每4h往棉球上加水一次，保湿4天。

或者于番茄茎部位进行根结线虫人工接种：

选择移栽2周后的番茄植株地上部位2cm高度的主茎，用70％的酒精表面消毒2min后，用灭菌水洗4次，室温下自然风干后，用灭菌的细针在茎的同一方向刺3个小孔，每孔深度不超过所刺部位茎直径的的一半，每两孔之间的距离优选为3.0mm，用灭菌后的微量注射器，给最上孔注射50μL步骤(2)制备的根结线虫2龄幼虫悬浮液，其中含100条活根结线虫2龄幼虫，用保鲜膜包裹接种部位，三个孔全部进行包裹保湿。优选地，在最下面注射孔的下部放置加有灭菌水的棉球保湿，每4h往棉球上加水一次，保湿4天，保鲜膜包裹部分棉球。

接种后的番茄苗放置在温室内，温室内25℃～31℃，相对湿度65％～95％。

保湿几天后进行接种结果的检查。具体是在人工接种番茄叶8天后就可以在叶面上见到形成的微小根结线虫虫瘿，以后虫瘿逐渐增大，至27天后，可进行完整的观察。可见叶面沿叶脉有典型的米粒状虫瘿，在40倍解剖镜下，剥开虫瘿，可见白色根结线虫雌虫虫体和黄色卵囊。

人工接种番茄芽27天后，可见接种处的茎和叶柄上，形成根结线虫虫瘿，在40倍解剖镜下，剥开虫瘿，可见白色根结线虫雌虫虫体和黄色卵囊。

人工接种番茄茎27天后，可见接种处的茎上形成根结线虫虫瘿。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种全新的番茄植株地上部人工接种根结线虫的方法，克服现有技术的局限，尤其是针对番茄对根结线虫的抗性评价、防治根结线虫药效检测、番茄与根结线虫互作信号检测的番茄根-根结线虫互作体系中所遇到的接种结果不直观、操作繁琐、培养体系容易污染、难以定点、定量接种等技术问题，本发明选择合适的根结线虫接种材料配合番茄植株不同的叶、芽、茎部生长期材料，提供了接种用根结线虫悬浮液的制备以及接种番茄的培育方案，确定了表面消毒、人工接种和保湿技术，建立了容易操作、最早接种8天后即可直观结果、并可以重复接种和定点定量接种的番茄叶、芽、茎部根结线虫接种方法，简单易行，易于推广。

附图说明

图1番茄叶-根结线虫接种结果

图2番茄芽-根结线虫接种结果

图3番茄茎-根结线虫接种结果