含有表达5HTR2C和/或ADAR的细胞的周围组织样品作为5HTR2C mRNA编辑机制改变的标记及其应用

本发明涉及一种用于体外预测病理的方法，所述病理涉及依赖ADAR的A至ImRNA编辑的mRNA编辑机制改变，特别是5-羟色胺2C受体(5HTR2C)的mRNA编辑机制的改变，其来自患者的含有表达所述mRNA例如5HTR2C mRNA和/或作用于RNA的腺苷脱氨基酶(ADAR)的细胞的周围组织样品，如皮肤和/或血液组织样品。本发明进一步包括一种用于鉴定试剂是否能够在体内修饰大脑组织中的5HTR2C mRNA编辑或控制用于预防或治疗涉及大脑组织中5HTR2CmRNA编辑机制改变的病理学的药物效能的方法，这些方法包括应用所述周围组织标记。在特别的方面，本发明涉及这样的方法，其中，当必要时，在通过PCR(优选巢式PCR)扩增含有编辑位点的特异mRNA片段后，通过单链构象多态性(SSCP)方法确定5HTR2C mRNA编辑速率或图谱，这使得在给定的分析条件下可能获得来自所述周围组织的该编辑的5HTR2C mRNA的编辑速率和/或图谱。最后，本发明涉及应用于所述巢式PCR的特定的核酸引物。

遗传相关性研究、敲除小鼠和尸体解剖分析显示：5-羟色胺2C受体(5HTR2C)参与神经精神失调。首先，5HTR2C的功能性等位基因多态性(Cys23Ser)与抑郁和双极人格异常(bipolar disorder)相关(Lerer等人，2001，Mol.Psychiatry，6：579-585)。第二，缺少5HT2C 5-羟色胺受体的小鼠表现出自发的惊厥、认知损伤和摄食行为的异常控制(Tecott等人，1995，Nature，374：542-546)。这些动物还对重复的压力超敏感(Chou-green等人，2003，Physiol.Behav.，79：217-226)。第三，患有双极人格异常或精神分裂症的患者的死后大脑中，5-HT2C 5-羟色胺受体的RNA表达下降(Iwamoto等人，2004，Mol.Psychiatry，9：406-416；Castensson等人，2003，Biol.Psychiatry，54：1212-1221)。

5HTR2C的RNA编辑也被认为涉及精神障碍的病理生理学和抗抑郁药的作用(Seeburg，2002，Neuron，35：17-20)。在5HTR2C的第二个细胞内环的编码区域中五个腺苷残基被编辑并且可以引起受体序列的三个不同位置上的氨基酸取代。这些氨基酸的取代组合产生多达24个不同的具有不同G-偶联效率的5HTR2C蛋白同种型(Price等人，2001，J.Biol.Chem.，276：44663-44668)。小鼠中，当与C57BL/6和129sv同系繁殖品系比较时，BALB/c品系显示出不同的基础前脑新皮层区(neocortical)5HTR2C前mRNA编辑模式，其可以是对压力反应性差别的基础。另外，BALB/c小鼠显示5HTR2C前mRNA编辑中的压力诱导的改变，类似于因抑郁自杀受害者的大脑中检测到的改变(Englander等人，2005，J.Neurosci.，25：648-651)。实际上，已经报道患有精神分裂症、抑郁和自杀的患者中的死后大脑中的5HTR2C改变的RNA编辑(Niswender等人，2001，Neuropsychopharmacology，24：478-491；Sodhi等人，2001，Mol.Psychiatry，6：373-379；Gurevich等人，2002，Neuron，34：349-356)。额外的干扰素用于丙型肝炎的治疗，但是抑郁症状经常作为患者中该分子的副作用出现，并且Yang等人证明该分子强烈改变5HTR2C的编辑(见Tohda等人，2006，J.Pharmacol.Sci.，100，427-432中的参考文献)。

在前研究显示5HTR2C主要表达于大脑，特别是在脉络丛、前额叶皮层、边缘区域、基底神经节和下丘脑(Tohda等人，1996，Neurosci.Res.，24：189-193；Julius等人，1988，241：558-564；Pasqualetti等人，1999，Neuroscience，92：601-611)。该大脑特异性表达模式将研究存在于5HTR2C RNA编辑和精神病状况之间的潜在联系限制在死后研究。在寻找更容易获得的组织时(所述组织可能反映CNS中的HTR2C编辑状态并允许定量分析具有不同精神病状态的患者)，Marazziti和合作者检测到静止淋巴细胞中的5HTR2C mRNA的存在(Marazziti等人，2001，Neuropsychobiology，43：123-126)。不幸的是在这些细胞中，如通过RT-PCR/Southern-blotting显示的5HTR2C表达水平太低，难以进一步定量分析RNA编辑。

最近，Slominski和同事显示人类皮肤和培养的源自皮肤的细胞具有将L-色氨酸转变至5-羟色胺的能力和将5-羟色胺代谢为N-乙酰-5-羟色胺和褪黑激素的能力(Slominski等人，2002，FASEB J.，16：896-898)。它们进一步通过巢式PT-PCR测试了编码该表皮血清素能/褪黑素能代谢途径受体的基因的表达。全部人类皮肤和正常和病理学培养的皮肤细胞主要表达编码5-羟色胺受体的5-HT2B和5HT7同种型的基因。其它5-羟色胺受体同种型的表达较不普遍，很少检测到5HTR2C(Slominski等人，2003，J.Cell.Phys.，196：144-153)。

ADAR(作用于RNA的腺苷脱氨基酶)基因家族成员涉及一种类型的将腺苷残基转变成肌苷的RNA编辑。RNA编辑过程是真核动物中引起mRNA中转录后碱基改变的普遍现象。哺乳动物中，已经鉴定不断增加数量的进行一种RNA编辑的基因，该RNA编辑的特征在于位点选择性的腺苷至肌苷的修饰。

A至I编辑底物有：编码谷氨酸盐受体AMPA类(如GluR2和GluR4)和G-蛋白偶联5-羟色胺受体(如5HTR2C)的大脑特异性转录本。在GluR亚基B(GluR-B)中，单个编辑位置(Q/R-位点)控制离子通道的Ca2+-通透性，而另一个位置(R/G-位点)调节受体的脱敏动力学。AMPA受体的这一性质对于正常大脑功能是重要的。因为正确的RNA编辑对正常大脑功能的重要性，编辑活性的反常调节可以影响病理生理学过程，如神经变性疾病或肿瘤发生(认知性癫痫、肿瘤、睡眠清醒、情感障碍饮食)的进展(Maas S等人(1996)J.Biol.Chem271，12221-26；Sergeeva OA等人(2007)Cell Mol Neurobiol.27：669-680)。

在T细胞水平鉴定出的作为磷酸二酯酶的同工酶的另一种ADARA至I编辑底物是磷酸二酯酶8A1。6至7个编辑位点已经被鉴定并可以在病理状态中(红斑狼疮)和药物作用(干扰素α)后被调节。

重要的是注意该同工酶存在于大脑(Orlowski RJ等人，8A1 genetranscripts of systemic lupus erythematosus T lymphocytes.Immunology2008in press；Wang P等人，phosphodiesterase 8A(PDEA8)splicevariants：cloning，gene organization and tissue distribution.(2001)Gene280 183-194)。

在这些ADAR大脑特异性底物中，5HTR2C mRNA的A至I编辑引起位于细胞内环II结构域中的三个氨基酸残基的替换，引起受体的G-蛋白偶联功能的显著改变(Yang W等人，Brain Res Mol Brain Res.2004，124(1)：70-78)。已经从哺乳动物中克隆了四个A至I的RNA编辑酶，称为ADAR1、ADAR2、ADAR3和ADAT1。ADAR1同种型和ADAR2广泛表达于各种细胞和组织中，在大脑和脾脏中具有最高的表达并且是参与5HTR2C mRNA编辑的重要的ADAR(只在大脑中鉴定了ADAR3，未确立其脱氨基酶活性，ADAT1靶向tRNA)。在五个位置紧密的腺苷残基上(称为A、B、C、D和E编辑位点)编辑5HTR2CmRNA，允许产生受体的32个不同的mRNA变体和24个不同的蛋白同种型，从未编辑的Ile156-Asn158-Ile160(INI)同种型至完全编辑的Val156-Gly158-Val160(VGV)同种型。已知ADAR1单独参与A和B编辑位点，ADAR1和ADAR2两者参与E和C的编辑位点，ADAR2单独参与D编辑位点(Dracheva等人，Molecular Psychiatry，2007，1-10)。

已知干扰素α(IFN-α)经常在由于慢性病毒性肝炎和某些恶性疾病而接受治疗的患者中造成严重的抑郁。已经观察到人类胶质母细胞瘤细胞系中IFN-α对RNA编辑的作用(Yang等人，Beyond theIdentification of Transcribed Sequences：Functional，Evolutionary andExpression Analysis，12th International Workshop，October 25-28，2002，Washington，DC，Intracellular Trafficking of A FewInflammation-Inducible ADAR1 Isoform)。还观察到，在Balb/c小鼠体内，施用干扰素α(已知其为体外人类胶质母细胞瘤细胞系中ADAR1150表达的有力的激活剂(Yang W.等人，2004))，还诱导背侧前额叶皮层中5HTR2C编辑图谱的后续改变。

为了允许快速和有效预测性的编辑过程一般性修饰的参数，还需要：

-提供一种允许从那些可以由待测患者中容易获得的生物样品中推测人类大脑组织中的这些ADAR底物，特别是谷氨酸盐受体AMPA类或5HTR2C mRNA的编辑速率或图谱改变的方法，并且其中优选的是在该生物样品中确定的这些ADAR底物的编辑速率或图谱可以与从大脑生物样品获得的这些ADAR底物的编辑速率或图谱相关，和/或

-鉴定存在于可以容易地从待测患者获得的生物样品中的标记，其中所述样品中的所述标记的定性和/或定量分析可以与大脑组织中的这些ADAR底物的编辑速率或图谱的改变相关，这样的生物样品和相关标记可以用作在CNS(中枢神经系统)中观察到的受体编辑的报告体。

这是本发明的确切主题。

本发明涉及单个生物样品或两种不同生物样品用于评估大脑组织中mRNA编辑的病理学改变的用途，或者是一种应用单个生物样品或两种不同生物样品来评估大脑组织中mRNA编辑的病理学改变的方法，所述样品选自含有细胞的周围组织组成的生物样品群组，并且其中所述mRNA编辑是依赖ADAR的A至I的mRNA编辑。

本发明还涉及下列的组织作为评估大脑组织中所述mRNA编辑的病理学改变的单个或相关报道样品的用途或应用下列的组织作为评估大脑组织中所述mRNA编辑的病理学改变的单个或相关报道体样品的方法：

-含有细胞的第一周围组织，如来自哺乳动物的皮肤样品，或/和

-含有细胞的第二周围组织，如来自哺乳动物的血液样品。

在优选的具体实施方式中，所述编辑的mRNA(其编辑是依赖ADAR的A至I mRNA编辑)，是选自编码谷氨酸盐受体AMPA类，编码G-蛋白偶联5-羟色胺受体和编码PDEA8的mRNA的mRNA。

在优选的具体实施方式中，大脑中的mRNA编辑的病理性改变是通过以下方式评估的：

-所述周围生物样品中的所述mRNA编辑形式的编辑速率或图谱；和/或

-所述周围生物样品中表达的ADAR的性质或/和数量。

在更优选的具体实施方式中，具有依赖ADAR的A至I mRNA编辑的所述mRNA是5HTR2C mRNA。

本发明人发现确定周围(如血液)的ADAR表达改变可以预测大脑中编辑的重要改变。

本发明人已经证明例如确定5HTR2C mRNA的编辑和/或确定在含有表达5HTR2C和/或ADAR的细胞的周围组织中，如皮肤和/或血液组织样品中表达的ADAR活性，可以用作大脑组织中5HTR2C mRNA编辑机制改变的报告体标记，用于评估CNS中表达的5-羟色胺能系统的多步代谢途径的病理性改变。

本发明人已经证明例如负责编辑哺乳动物5HTR2C的重要的ADAR(其为两种ADAR1同种型(ADAR1-150kD蛋白和ADAR1-110kD蛋白，以下命名为“ADAR1-150”和“ADAR1-110”)和ADAR2)都以足够的量在含有细胞的所述周围组织中表达，特别是在血液样品白细胞中，以便定性和/或定量分析并使用含有细胞的周围组织和ADAR作为用于评估CNS中表达的5-羟色胺能系统多步代谢途径的病理性改变的报告体样品和标记。

他们还证明：与用于皮肤样品的现有技术(Slominski等人，2003，J.Cell Phy.，196，144-153)中指示的相反，某些含有细胞，如皮肤样品细胞的周围组织，表达足够的要检测和分析的5HTR2C mRNA，以评估5HTR2C mRNA的编辑速率或图谱，并且可选地，用于评估所含ADAR的性质和/或量。

因此，

-确定含有表达这些ADAR的细胞的周围组织(例如含有细胞的皮肤和/或血液组织样品)中的ADAR酶特别是ADAR1同种型(特别是“ADAR1-150”和“ADAR1-110”)和ADAR2的改变的或正常的表达，和/或

-确定含有表达5HTR2C mRNA的细胞的周围组织(例如含有细胞的皮肤和/或血液组织样品)中的编辑形式的5HTR2C mRNA的5HTR2C mRNA编辑速率或图谱，

可以用作大脑组织中的5HTR2C mRNA编辑机制改变的报告体标记，因此用于评估患者的CNS中表达的5-羟色胺能系统的多步代谢途径的病理性改变。

最后，在含有细胞的一个或多个周围组织样品(如含有细胞的皮肤和/或血液组织样品)中单独确定ADAR酶的改变的或正常的表达，或与确定编辑形式的5HTR2C mRNA的5HTR2C mRNA编辑速率或图谱的确定联合确定ADAR酶的改变的或正常的表达，可以作为报告体样品和标记用于：

-体外鉴定患者是否出现病理或有发生与5-羟色胺2C受体(5HTR2C)的mRNA编辑机制改变相关的病理的风险；

-体外鉴定患者显示的病理是否与5HTR2C的mRNA编辑机制改变相关；

-选择能够调节大脑组织中的5HTR2C mRNA编辑的化合物，优选是能够恢复有需要的患者的大脑组织中的正常5HTR2C mRNA编辑的化合物；或

-在哺乳动物体外确定用于预防或治疗与5HTR2C的mRNA编辑机制改变相关的病理的药物的功效。

含有细胞的“周围组织”，在本文中用于指明除了大脑组织的组织，优选为容易收集的组织，例如在容易收集的器官或组织的一般生物活检、皮肤样品、完整血液样品、尿样、唾液样品、内颊组织样品、阴道或内颊脱落细胞或涂片中的组织。含有细胞的皮肤和/或血液样品是应用于本发明的优选的周围组织样品。

通过将这两种标记(ADAR和5HTR2C mRNA编辑)联合，旨在：可以在与用于确定5HTR2C mRNA编辑的细胞相同类型的细胞(例如皮肤细胞样品)中分析ADAR的表达；或者，可以在一种类型的细胞例如血液细胞样品中的细胞中分析ADAR的表达，而在另一种细胞中例如在皮肤细胞样品中确定5HTR2C mRNA的编辑。

如果确定该标记足以将其在含有细胞的周围组织样品(如含有细胞的皮肤和/或血液组织样品)中的表达与大脑组织中的5HTR2CmRNA的编辑速率或图谱相关联，还可以单独使用每个标记。

例如，对血液组织样品细胞，如白细胞中的ADAR改变的或正常表达的确定，可以单独用作大脑组织中5HTR2C mRNA编辑机制改变的报告体标记，如果用单独标记足以获得相关性。

另一个例子是对编辑形式的5HTR2C mRNA的5HTR2C mRNA编辑速率或图谱的确定或对含有表达5HTR2C mRNA和ADAR的细胞的皮肤组织样品中ADAR改变的或正常的表达的确定，还可以单独作为大脑中5HTR2C mRNA编辑机制改变的报告体标记，如果用单独使用的标记足以获得相关性。

关于选择能够调节5HTR2C mRNA编辑的化合物的方法，用于评估和选择这样的化合物的表达5HTR2C mRNA和/或ADAR的周围组织的细胞可以是细胞系或重组细胞系，其中已经按顺序改变了5HTR2CmRNA和/或ADAR的表达，以便例如模仿该5HTR2C mRNA和/或ADAR的病理学表达。皮肤或血液重组细胞或细胞系可以特别地用于这个方面。

特别地，本发明包括表达5HTR2C mRNA和/或ADAR的周围组织，如来自哺乳动物，优选为人类、小鼠或大鼠的皮肤样品(皮肤细胞或组织，或生物活检)的周围组织的用途，其用于评估CNS中，如大脑中表达的5HTR2C mRNA编辑系统的病理学改变的单个或联合的报告体样品。

更特别地，本发明包括表达5HTR2C mRNA和/或ADAR的周围组织，如来自哺乳动物，优选为人类、小鼠或大鼠的皮肤样品的周围组织的用途，其用于评估表达于CNS，如大脑的5HTR2C mRNA编辑系统的病理学改变的单个或联合的受体样品，评估通过下列进行：

-确定周围组织样品中，如皮肤细胞中编辑形式的5HTR2C mRNA的编辑速率或图谱，或可选的如果用作联合的标记，

-确定所述周围组织样品中表达的ADAR的性质或/和数量。

在另一个优选的具体实施方式中，本发明包括第二周围组织样品例如来自哺乳动物的完全血液样品，优选人类、小鼠或大鼠血液样品，更优选白细胞的用途，其用于评估表达于CNS，如大脑的5HTR2CmRNA编辑系统的病理学改变的单独或联合的报告体样品。

更特别地，本发明包括第二周围组织例如来自哺乳动物的完全血液样品，优选人类、小鼠或大鼠周围组织样品，优选白细胞的用途，其用于评估表达于CNS，如大脑的5HTR2C mRNA编辑系统的病理学改变的单独或联合的报告体样品，评估通过下列进行：

-确定第二周围组织样品中，如血液细胞中编辑形式的5HTR2CmRNA的编辑速率或图谱，或可选的如果用作联合的标记，

-确定所述第二周围组织样品中表达的ADAR的性质或/和数量。

在第一方面，本发明针对一种用于体外鉴定患者是否出现病理或有发生与5HTR2C mRNA编辑机制改变相关的病理风险的方法，其中该方法包括下列步骤：

a)从待测患者获得含有包含细胞例如皮肤细胞和/或血液细胞的周围组织的生物样品；

b)确定含有细胞例如皮肤细胞和/或血液细胞的所述周围组织样品中的至少一种编辑形式或未编辑形式的所述5HTR2C mRNA的编辑速率和/或表达的ADAR的性质或/和数量；

c)通过将步骤b)中获得的含有细胞的所述周围组织样品中的编辑或未编辑形式的所述5HTR2C mRNA的编辑速率，和/或表达的ADAR的性质或/和数量与从正常患者中获得的或从表现出与该mRNA编辑机制改变相关的病理的患者中获得的特征性的5HTR2C mRNA的对照编辑速率或表达的ADAR的图谱进行比较，从而鉴定所述患者是否出现或有发生这样的病理的风险。

在优选的具体实施方式中，所述病理选自精神障碍、精神分裂症、抑郁、抑郁性自杀或异常摄食行为。

在第二方面，本发明涉及一种体外确定患者显示的病理是否与5HTR2C的mRNA编辑机制改变相关，其中该方法包括下列步骤：

a)从显示所述病理的患者获得含有包含细胞例如皮肤细胞和/或血液细胞的周围组织的生物样品；

b)确定含有细胞例如皮肤细胞和/或血液细胞的所述周围组织样品中的至少一种编辑形式或未编辑形式的所述5HTR2C mRNA的编辑速率和/或表达的ADAR的性质或/和数量；

c)通过将步骤b)中获得的所述周围组织样品中的该编辑或未编辑形式的所述5HTR2C mRNA的编辑速率，和/或表达的ADAR的性质或/和数量与从正常患者中获得的或从表现出已知与该mRNA编辑机制改变不相关的病理的患者中获得的特征性的5HTR2C mRNA的对照编辑速率或表达的ADAR的图谱进行比较，从而鉴定所述患者是否出现或有发生这样的病理的风险。

在总的方面，本发明针对：

一种体外鉴定患者是否出现病理或有发生与mRNA编辑机制改变相关的病理风险的方法，其中所述mRNA的编辑是哺乳动物中依赖ADAR的A至I编辑；

一种体外鉴定调节mRNA编辑的试剂的方法，其中所述mRNA的编辑是哺乳动物中依赖ADAR的A至I编辑；

一种体外鉴定调节患者中的药物功效的方法，所述药物用于预防或治疗与mRNA编辑机制改变相关的病理，其中mRNA的编辑是哺乳动物中依赖ADAR的A至I编辑；

一种确定患者是否对于由mRNA编辑机制改变所引起或激起的病理的治疗有反应或无反应的方法，其中mRNA的编辑是哺乳动物中依赖ADAR的A至I编辑；其中该方法包括下列步骤：

a)从待测患者获得含有细胞的周围生物样品，特别是含有血液细胞的生物样品；

b)确定所述周围生物样品中表达的ADAR的性质或/和数量；

c)将所述样品中表达的ADAR的性质或/和数量与对于正常患者或对于表现出与该mRNA编辑机制改变相关病理的患者获得的表达性ADAR图谱的特征性控制相比较。

在上述这些本发明的方法的优选的具体实施方式中，所述编辑的mRNA是选自编码谷氨酸盐受体AMPA类、编码G-蛋白偶联5-羟色胺受体和编码PDEA8的mRNA的mRNA。

在第三方面，本发明针对一种体外鉴定在哺乳动物中调节5HTR2CmRNA编辑的试剂的方法，包括下列步骤：

a)向所述哺乳动物施用候选的5HTR2C mRNA编辑的调节物；

b)从所述哺乳动物获得含有周围组织的生物样品，所述组织含有细胞，如皮肤细胞和/或血液细胞；和

c)通过将步骤b)的生物样品中获得的该编辑的或未编辑形式的编辑速率和/或表达的ADAR的性质或/和数量与从含有所述哺乳动物细胞的对照周围组织中获得的编辑速率和/或表达的ADAR的性质或/和数量比较从而确定所述调节物对于：

-所述5HTR2C mRNA至少一个编辑的或未编辑形式的编辑速率；和/或

-所述周围组织样品中，如皮肤细胞和/或血液细胞中表达的ADAR的性质或/和数量的效果。

在该第三方面，本发明还包括一种体外鉴定在哺乳动物中调节5HTR2C mRNA编辑的试剂的方法，包括下列步骤：

a)获得含有哺乳动物周围组织的生物样品，所述组织含有细胞，例如皮肤细胞系和/或血液细胞系，可选地，这些细胞可以是重组细胞或细胞系；

b)在调节所述5HTR2C mRNA编辑的候选试剂存在时接触所述生物样品；和

c)通过将步骤b)的生物样品中获得的该编辑的或未编辑形式的编辑速率和/或表达的ADAR的性质或/和数量与从所述哺乳动物的含有细胞例如皮肤细胞和/或血液细胞的对照周围组织中获得的编辑速率和/或表达的ADAR的性质或/和数量比较从而确定所述调节物对于：

-所述5HTR2C mRNA至少一个编辑的或未编辑形式的编辑速率；和/或

-所述周围组织样品中，如皮肤细胞和/或血液细胞中表达的ADAR的性质或/和数量的效果。

在该第三方面，本发明还包括应用这些上述方法而检测由治疗如抗抑郁、抗精神病、抗肥胖、抗病毒感染等治疗(其已经鉴定为对大脑编辑调节显示重要作用并引发鉴定的风险，如自杀、抗治疗、诱导的慢性化)所诱导的调节的编辑过程改变。

在第四方面，本发明包括一种在体外确定哺乳动物中的用于预防或治疗与5HTR2C mRNA编辑机制改变相关的病理的药物的功效的方法，包括下列步骤：

a)从所述哺乳动物中获得含有周围组织的生物样品，所述组织含有细胞如皮肤细胞和/或血液细胞，并确定所述周围组织样品，如皮肤细胞和/或血液细胞中的所述5HTR2C mRNA的至少一种编辑形式或未编辑形式的编辑速率和/或表达的ADAR的性质或/和数量；

b)向所述哺乳动物施用预期用于预防或治疗病理的药物；

c)从所述哺乳动物获得或/和在治疗后从所述哺乳动物获得所述周围组织样品的新样品，并确定步骤a)中所选定的所述样品的所述5HTR2C mRNA的至少一种编辑形式或未编辑形式的编辑速率和/或表达的ADAR的性质或/和数量；和

d)通过将获自步骤a)中生物样品的编辑速率和/或表达的ADAR的性质或/和数量与步骤c)中获得的比较而确定所述药物的功效，调节编辑速率和/或表达的ADAR的性质或/和数量引起编辑速率和/或表达的ADAR的性质或/和数量与对于正常个体观察到的接近或相等，是对治疗显著有效。

在这方面，本发明涉及一种确定患者对于由5HTR2C mRNA编辑机制改变引起或激起的病理治疗是否有反应或无反应的方法，进一步包括下列步骤：

e)通过与治疗开始前的编辑速率或图谱和/或表达的ADAR性质或/和数量比较而观测治疗后一段时期(即15天、30天、2个月、6个月等)编辑速率或图谱和/表达的ADAR的性质或/和数量的改变从而确定患者对于治疗有反应或无反应。

因此如果可能快速确定患者对该药物无反应，这样的方法允许避免延长不必要的药物治疗时期，或如果患者对该药物有反应，继续该治疗。

编辑是一种机制，通过该机制转录后可修饰基因中含有的信息。一般性术语“mRNA编辑”包括这些mRNA序列的修饰，这引起翻译中整合进入蛋白的氨基酸的关于性质或数量的改变，蛋白的序列不再可能从指导其合成的基因序列中推断出来。在将变成确定性mRNA(其指导位于5HTR2C的第二个细胞内环的氨基酸的整合)的部分，5HTR2C的前信使RNA可以进行特异性的某些腺苷(A)的酶修饰。事实上，初级转录本的第五外显子的末端部分和第五内含子的近端部分能够形成潜在地由两种酶ADAR1和ADAR2(依赖双链RNA的腺苷脱氨基酶)识别的颈-环结构，这使得在剪接前编辑前信使RNA成为可能。该编辑由A的脱氨基产生，然后A转换成肌苷(I)。一旦完成了剪接，含有该进行编辑的A的mRNA的部分现在含有I。当翻译5HTR2C mRNA时，认为I被读成G。事实上，在从那些进行A脱氨基至I的5HTR2C mRNA体外合成cDNA的过程中，逆转录酶在I对面整合dC，而不是正常情况下应该在A对面整合的dT。因此，在引起形成双链cDNA的第二链的合成过程中，在每个整合进入第一链的dC的对面引入了dG。由于进行编辑的mRNA中的最初A的脱氨基至I，所以对获得的双链cDNA的测序使得观察到将dA被dG替换成为可能。因此，mRNA的编辑引起密码子意义的改变，其中A被I替换，其因此被认为读作G(更特异地，关于人类5HTR2C的编辑，见Fitzgerald等人，Neuropsychopharmacology，1999，21(2S)，82S-90S)。

所以，通过控制皮肤样品中的编辑速率而确定5HTR2C mRNA编辑机制的改变还对于皮肤中表达的5-羟色胺能系统的多步代谢途径的改变是重要的并且这可以用作大脑中表达的5-羟色胺能系统的报告体。

因此，在第六方面，本发明还包括一种控制参与5HTR2C mRNA编辑的蛋白例如ADAR1和/或ADAR2酶的作用机制改变的方法，其使用本发明上述方法中应用的或描述的用于确定编辑或未编辑形式的所述5HTR2C mRNA的编辑速率的方法，通过确定来自含有细胞的周围组织例如皮肤样品或血液样品的该5HTR2C mRNA的编辑速率而进行。

重要的是注意本发明是针对编辑过程的周围标记的用途，其用于诊断和跟踪其调节的一般性改变，其在那些改变大脑和/或周围功能的病理中具有可预测的暗示。主要的目的是，作为非唯一性例子，达到在患者中预测和指引治疗的新的能力，在这些患者中已经建议编辑调节的改变参与它们的病理(例如在抑郁和自杀中)，无论是聚集的死后观察或非直接临床证据(例如由干扰素治疗诱导的抑郁状态)(特别参见实例1中的用于此目的而应用的策略)。

术语“编辑的RNA”本说明书中是指其中至少一个腺苷已经通过腺苷脱氨基酶脱氨基至肌苷的任何RNA序列。

“编辑速率”是指可包含至少一个编辑位点的每个编辑和未编辑形式的mRNA相对于所述相同样品中存在的编辑的或未编辑的mRNA形式的总数量的百分比。

编辑位点              A  B  EC    D

1      5HTR2C-0       ATACGTAATCCTATT  SEQ ID No.1

       I-N-I

2      5HTR2C-A       ITACGTAATCCTATT  SEQ ID No.2

       V-N-I

3      5HTR2C-B       ATICGTAATCCTATT  SEQ ID No.3

       M-N-I

4      5HTR2C-C       ATACGTAITCCTATT  SEQ ID No.4

       I-S-I

5      5HTR2C-D       ATACGTAATCCTITT  SEQ ID No.5

       I-N-V

6      5HTR2C-E       ATACGTIATCCTATT  SEQ ID No.6

       I-D-I

7    5HTR2C-AB    ITICGTAATCCTATT    SEQ ID No.7

     V-N-I    

8    5HTR2C-AC    ITACGTAITCCTATT    SEQ ID No.8

     V-S-I

9    5HTR2C-AD    ITACGTAATCCTITT    SEQ ID No.9

     V-N-V

10   5HTR2C-AE    ITACGTIATCCTATT    SEQ ID No.10

     V-D-I

11   5HTR2C-BC    ATICGTAITCCTATT    SEQ ID No.11

     M-S-I

12   5HTR2C-BD    ATICGTAATCCTITT    SEQ ID No.12

     M-N-V

13   5HTR2C-BE    ATICGTIATCCTATT    SEQ ID No.13

     M-D-I

14   5HTR2C-CD    ATACGTAITCCTITT    SEQ ID No.14

     I-S-V

15   5HTR2C-CE    ATACGTIITCCTATT    SEQ ID No.15

     I-G-I

16   5HTR2C-DE    ATACGTIATCCTITT    SEQ ID No.16

     I-D-V

17   5HTR2C-ABC   ITICGTAITCCTATT    SEQ ID No.17

     V-S-I

18   5HTR2C-ABD   ITICGTAATCCTITT    SEQ ID No.18

     V-N-V    

19   5HTR2C-ABE   ITICGTIATCCTATT    SEQ ID No.19

     V-D-I

20   5HTR2C-ACD   ITACGTAITCCTITT    SEQ ID No.20

     V-S-V

21   5HTR2C-ACE   ITACGTIITCCTATT    SEQ ID No.21

     V-G-I

22   5HTR2C-ADE   ITACGTIATCCTITT    SEQ ID No.22

     V-D-V

23   5HTR2C-BCD   ATICGTAITCCTITT    SEQ ID No.23

     M-S-V

24   5HTR2C-BCE   ATICGTIITCCTATT    SEQ ID No.24

      M-G-I

25    5HTR2C-BDE    ATICGTIATCCTITT    SEQ ID No.25

      M-D-V    

26    5HTR2C-CDE    ATACGTIITCCTITT    SEQ ID No.26

      I-G-V

27    5HTR2C-ABCD   ITICGTAITCCTITT    SEQ ID No.27

      V-S-V

28    5HTR2C-ABCE   ITICGTIITCCTATT    SEQ ID No.28

      V-G-I

29    5HTR2C-ABDE   ITICGTIATCCTITT    SEQ ID No.29

      V-D-V

30    5HTR2C-ACDE   ITACGTIITCCTITT    SEQ ID No.30

      V-G-V

31    5HTR2C-BCDE   ATICGTIITCCTITT    SEQ ID No.31

      M-G-V        

32    5HTR2C-ABCDE  ITICGTIITCCTITT    SEQ ID No.32

      V-G-V

*编辑位点“E”还被命名为“C’”

根据本发明的方法的优选的具体实施方式中，患者或哺乳动物是人类、小鼠或大鼠，优选人类。

根据本发明的方法的优选的具体实施方式中，皮肤细胞选自角化细胞、黑色素细胞、成纤维细胞、朗格汉斯氏细胞和默克尔氏细胞，皮肤组织选自表皮和真皮。

角化细胞可以来自人类无限增殖化细胞，如HaCaT细胞系，或黑色素细胞来自人类无限增殖化细胞或黑色素瘤。

根据本发明的方法优选的具体实施方式中，角化细胞来自新生皮肤、真皮或毛囊，黑色素细胞来自表皮或来自毛囊，成纤维细胞来自真皮或乳头状毛囊。

根据本发明的方法的更优选的具体实施方式中，皮肤细胞、培养的源自皮肤的细胞或皮肤组织来自眼睑或耳廓皮肤。

在根据本发明的方法的更优选的具体实施方式中，所述5HTR2CmRNA的编辑位点选自位于具有序列5’-AUA CGU AAU CCU AUU-3’(SEQ ID No.33)的人类5HTR2C mRNA片段的位置1、3、7、8和13的核苷酸。

在根据本发明的方法的优选的具体实施方式中，确定了人类5HTR2C mRNA的至少1种，优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或32种编辑和未编辑形式的编辑速率。

在更优选的具体实施方式中，确定了所述5HTR2C mRNA的所有编辑和未编辑形式的(32种形式)编辑速率。

在根据本发明的方法的优选的具体实施方式中，所述5HTR2CmRNA的每个编辑和未编辑形式的编辑速率由包括下列步骤的方法确定：

A)从所述皮肤细胞样品，如皮肤细胞系、培养的源自皮肤的细胞或皮肤组织，或所述血液细胞，如白细胞中提取总RNA，接着，在适当时，通过纯化mRNA；

B)逆转录从步骤A)提取的RNA；和

C)使用对含有可以编辑的编辑位点的5HTR2C mRNA片段特异的至少一对引物通过PCR扩增步骤B)中获得的cDNA，选择这对引物以便能够扩增潜在存在于RNA提取物中的所有编辑形式和未编辑形式。

在根据本发明的方法的更优选的具体实施方式中，所述5HTR2CmRNA的每个编辑和未编辑形式的编辑速率由包括下列步骤的方法确定：

A)从所述皮肤细胞样品，如皮肤细胞系、培养的源自皮肤的细胞或皮肤组织，或所述血液细胞，如白细胞中提取总RNA，接着，在适当时，通过纯化mRNA；

B)逆转录从步骤A)提取的RNA；和

C)使用对含有可以编辑的编辑位点的5HTR2C mRNA片段特异的至少一对引物通过PCR扩增步骤B)中获得的cDNA，选择这对引物以便能够扩增潜在存在于RNA提取物中的所有编辑形式和未编辑形式，并且其中步骤B)的逆转录通过使用对5HTR2C基因特异的寡核苷酸引物实现。

在步骤B)的更优选的具体实施方式中，对5HTR2C基因特异的寡核苷酸引物具有序列5’-TTCGTCCCTCAGTCCAATCAC-3’(SEQ IDNo.34)。

在根据本发明的方法的优选的具体实施方式中，在步骤C)中，PCR扩增步骤是巢式PCR，其含有两轮PCR，其中第一轮PCR通过产生PCR核酸产物的一组引物进行，所述核酸产物具有200bp至300bp的长度，优选在225bp至275bp之间，更优选在240bp至260bp之间，250bp是最优选的。

在根据本发明的方法的更优选的具体实施方式中，在步骤C)中，PCR扩增步骤是巢式PCR，其包括两轮PCR，其中第二轮PCR通过产生最终PCR核酸产物的一组引物进行，所述核酸产物具有90bp至160bp之间的长度，优选100bp至140bp之间，更优选110bp至140bp之间。具有序列长度在110bp至138bp的最终PCR产物是最优选的。

在根据本发明的方法的更优选的具体实施方式中，在步骤C)中，PCR扩增步骤是包括两轮PCR的巢式PCR，其中第一轮PCR通过下列引物组进行：

对于人类：

PCR9正向：5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’，SEQ ID No.35；

PCR10反向：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’，SEQ ID No.36；对于小鼠和大鼠：

PCR9正向：5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’，SEQ ID No.35；

PCR10反向：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’，SEQ ID No.36，

其中第二轮PCR通过下列引物组进行：

对于人类：

PCR18正向：5’-ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC-3’，SEQ IDNo.37；

PCR2反向：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTA-3’，SEQ ID No.38；和对于小鼠或大鼠：

PCR1正向：5’-TTTGTGCCCCGTCTGGAT-3’，SEQ ID No.39；

PCR4反向：5’-GCCTTAGTCCGCGAATTG-3’，SEQ ID No.40。

本发明包括用于通过巢式PCR扩增人类编辑和未编辑的人类5HTR2C mRNA的所有同种型的两组下列引物，优选，用于第二PCR的引物组：

第一轮：

PCR9正向：5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’(SEQ ID No.35)；

PCR10反向：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’(SEQ IDNo.36)；和

第二轮：

PCR18正向：5’-ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC-3’(SEQ IDNo.37)；

PCR2反向：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTA-3’(SEQ ID No.38)。

PCR扩增步骤中所用的引物(如果有一轮PCR的话)，或者第二轮中所用的引物(如果是具有两轮PCR的巢式PCR的话)优选为标记的，更优选为以荧光基团，如C6-FAM(MWG)或VIC(Applied Biosystem)标记。

在根据本发明的方法的另一个更优选的具体实施方式中，所述5HTR2C mRNA的每个编辑和未编辑形式的标记速率通过能够为所述mRNA的每个编辑和未编辑的分开形式提供编辑图谱的SSCP方法确定，所述SSCP方法的特征在于在步骤A)、B)和C)之后包含下列步骤：

D)在适当时，纯化步骤C)中获得的PCR产物；

E)在适当时，定量步骤D)中获得的PCR产物；

F)将双链DNA分离至单链DNA，特别是通过加热而后骤冷；

G)通过毛细管电泳分离单链DNA；和

H)通过读出荧光而获得编辑图谱并且，在适当时，通过与荧光读数器相连开发系统获得图谱数据。

获得各种对应于含有五个编辑位点的5HTR2C cDNA片段的各种编辑形式的各种单链DNA的电泳迁移图谱在此被称为“编辑图谱”。

在优选的具体实施方式中，权利要求1至4的步骤c)中使用的用于确定病理、与5HTR2C mRNA编辑改变相关的病理或测试试剂的效果的对照或标准编辑速率或5HTR2C mRNA的编辑图谱，是用相同的方法和在与用于测试生物样品所用的条件相同的给定条件下对于所述mRNA的每个编辑和未编辑的单独形式而获得的特征性编辑速率或图谱。

以通常的方式，可以通过与按照相同方法(例如上述的SCCP方法)并在与测试生物样品所用的条件相同的条件下所获得的每个这些编辑和未编辑形式的已知定性和/或定量的混合物的编辑速率或图谱比较而评估待测生物样品中存在的每个编辑和未编辑的单独形式的质量和/或数量。

在另一方面，本发明针对分离的核酸，其中该核酸：

-含有或具有序列ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC(SEQ IDNo.37)并且，优选具有最多100个核苷酸，更优选90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、29、28、27和26个核苷酸；或

-含有SEQ ID N°37的片段nt5-nt14，优选SEQ ID No.37的片段nt4-nt14、nt3-nt14、nt2-nt14、nt1-nt14、nt5-nt15、nt5-nt16、nt5-nt17、nt5-nt16、nt5-nt17、nt5-nt18、nt5-nt19、nt5-nt20、nt5-nt21、nt5-nt22、nt5-nt23、nt5-nt24、nt5-nt25。

在更实施方式中，根据本发明的分离的核酸被标记，优选以荧光基团标记。

在该方面，本发明包括根据本发明的所述核酸作为引物或探针，优选作为PCR扩增方法中的引物，更优选作为巢式PCR中的第二引物的用途。

本发明涉及确定优选人类、大鼠或小鼠，更优选为人类中的哺乳动物5HTR2C mRNA编辑速率或图谱的试剂盒，其中所述试剂盒含有根据本发明的核酸。

在本发明的方法的优选的具体实施方式中，选择用于单独确定或联合确定表达的ADAR的性质和/或量的细胞是血液白细胞或白细胞或来自离心后获得的完全血样品的淡黄色层。

在优选的具体实施方式中，步骤b)中，ADAR表达产物是ADAR1，同种型150和/或110，和ADAR2基因表达产物，优选为小鼠、大鼠或人类编码ADAR1，同种型150-kD和/或110-kD蛋白和ADAR2蛋白的基因表达产物。人类是最优选的。

对于人类、小鼠或大鼠，编码蛋白同种型150kD和110kD的ADAR1mRNA核酸序列和编码ADAR2蛋白的ADAR2mRNA核酸序列及其氨基酸序列是技术人员熟知的。

例如，可以特别列举Genbank中描述的在登录号下的以下序列：

对于ADAR1：

-对于人类：NM_001111.3；NM_001025107.1，

-对于小鼠：NM_019655.2；NM_001038587.2，

对于ADAR2：

-对于人类：NM_001112.2；NM_015833.2；NM_015834.2和NM_001033049.1，

-对于小鼠：NM_130895.2；NM_001024837；1NM_001024838.1；NM_001024840.1和NM_001024839.1。

在更优选的具体实施方式中，步骤b)中，ADAR表达产物是ADARmRNA。

因此，本发明针对根据本发明的方法，其中在步骤b)中，通过包括下列步骤的方法进行ADAR mRNA的确定：

A)提取所述血液样品细胞的总RNA，在适当时，接着纯化mRNA；

B)通过寡dT引物逆转录步骤A)中提取的RNA，和

C)使用对于需要定性和/或定量分析的每个ADAR mRNA特异的至少一对引物通过PCR扩增步骤B)中获得的cDNA。

在优选的具体实施方式中，对ADAR mRNAPCR扩增特异的引物对选自：

-对于人类ADAR-150同种型mRNA扩增：

EX1A 34p正向：5’-GCCTCGCGGGCGCAATGAATCC-3’(SEQ IDNo.41)，

EX2578m反向：5’-CTTGCCCTTCTTTGCCAGGGAG-3’(SEQ IDNo.42)；

-对于人类ADAR1-110同种型mRNA扩增：

EX1B 534p正向：5’-CGAGCCATCATGGAGATGCCCTCC-3’(SEQID No.43)，

EX2 804m反向：5’-CATAGCTGCATCCTGCTTGGCCAC-3’(SEQID No.44)；

-对于人类ADAR2 mRNA扩增：

ADAR2 1274p正向：5’-GCTGCGCAGTCTGCCCTGGCCGC-3’(SEQ ID No.45)，

ADAR21486m反向：5’-GTCATGACGACTCCAGCCAGCAC-3’(SEQ ID No.46)；

-对于小鼠ADAR1-150同种型mRNA扩增：

EX1A 19p正向：5’-GTCTCAAGGGTTCAGGGGACCC-3’(SEQ IDNo.47)，

EX2 646m  分反向：5’-CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC-3’(SEQ ID No.48)；

-对于小鼠ADAR1-110同种型mRNA扩增：

EX1B 72p正向：5’-TCACGAGTGGGCAGCGTCCGAGG-3’(SEQID No.49)，

EX2 646m反向：5’-CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC-3’(SEQID No.48)；和

-对于小鼠ADAR2mRNA扩增：

EX7 1281p正向：5’-GCTGCACAGTCTGCCTTGGCTAC-3’(SEQID No.50)，

EX9 1622m反向：5’-GCATAAAGAAACCTGAGCAGGGAC-3’(SEQ ID No.51)；

在根据本发明的方法的第二方面，在步骤b)中，ADAR表达产物是ADAR蛋白。

因此，在该方法的优选的具体实施方式中，ADAR蛋白的确定通过包括下列步骤的方法进行：

A)可选的，提取所述血液样品细胞中含有的总蛋白，在适当时，接着蛋白纯化步骤；和

B)通过应用能够特异性识别所述ADAR蛋白的抗体，优选标记的抗体确定所述血液样品细胞中含有的每个ADAR蛋白的存在、性质和/或浓度。

在可以用于该检测或/和定量的这些抗体中，可以列举但不限于下列抗体：

sc-33179抗-ADAR1(H-176)多克隆抗体(Santa-Cruz)；或

sc-33180抗-ADAR2(H-90)多克隆抗体(Santa-Cruz)。

Western印迹或Elisa方法可以用于分析或定量生物样品中的特异性蛋白表达。这样的方法对于技术人员是熟知的。

使用特异性针对小鼠、人类或大鼠ADAR1-150或ADAR1-110和ADAR2蛋白的不同特异区域或抗原决定簇的抗体检测印迹。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，如果需要可以被标记。可以使用重组ADAR蛋白或其片段作为免疫原在实验室开发这样的抗体。

可以选择下列实施例还有以下的附图和附图说明而向本领域技术人员提供完整的说明以便能够实现和使用本发明，这些实施例不用于限制本发明人考虑是其发明的范围，也不用于显示只有以下这些实验被实现。

附图说明

图1从人类个体对照组的每个单个前扣带皮质信号计算的电泳SSCP信号的平均值(黑线)(实验数据)。还显示了对应于这些信号的平均值+SEM的曲线(绿线)。横坐标代表10000点的时间基础(6.2点/秒)，纵坐标在标准化总信号后以荧光任意单位给出。显示的信号对应于FAM(左部分)和VIC(右部分)标记的线。一些以单独标准获得的电泳信号的典型的例子在其对应于FAM和VIC标记中作为阴性显示。在图的左和右部分，使用一个独特的基础时间，表格显示了以FAM(左)或VIC(右)探针标记的特定编辑的同种型的每个标准单链的不同主要电泳峰(最大)的位置。当间隔≥上述定义基础时间的15点时，可以分离两个最大鉴定的峰。注意来自一个标记链的电泳模式的一些非可分辨峰从其他中分辨出来(用相同的颜色鉴别这些情况)。

图2A和2B：人类和小鼠皮肤中的5-HT2cR的转录本的鉴定。(A)使用两个特异的引物PCR9和PCR10通过第一轮PCR扩增从人类眼睑polyA+RNA(泳道1-3)制备的cDNA。然后以引物PCR18和PCR2在这些第一产物上进行巢式PCR(泳道6-8)。在2％琼脂糖凝胶上分辨获得的产物。扩增产物的预期大小对于第一和第二PCR分别是250-bp和127-bp。对于每个引物组显示阴性(泳道4和9)和阳性对照(泳道5和10)。以M指示100-bp DNA梯子/标记。(B)使用两个基因特异的引物PCR9和PCR10通过第一轮PCR扩增从Balb/c小鼠皮肤polyA+RNA制备的cDNA(泳道1-6)。然后以引物PCR1和PCR4在这些第一扩增物上进行第二PCR(泳道9-14)。对于每个引物组显示阴性(泳道7和15)和阳性对照(泳道8和16)。将获得的产物在2％的琼脂糖凝胶上分辨。扩增产物的预期大小对于第一和第二PCR分别是250-bp和138-bp长。M是100-bp DNA梯子/标记。

图3A和3B：在Balb/c小鼠血样和皮肤中明确鉴定ADAR同工酶的mRNA。(A)以对组成型(p110)和可诱导形式的ADAR1(p150)特异的引物通过PCR扩增从全血RNA(泳道4)和皮肤RNA(泳道1-3，对应于3个不同时间的逆转录，即分别为30分钟、2小时和4小时)制备的cDNA。获得的扩增产物在2％琼脂糖凝胶上分辨分别为674-bp(p150同种型)和683-bp(p110同种型)长。显示阴性对照(泳道5)和100-bp DNA梯子/标记(M)。加强的对比度允许检测对应于全血细胞中转录的组成型形式的ADAR1的暗淡的条带(泳道4，p110)。(B)与(A)中相同，但是显示了对应于皮肤和全血中ADAR2转录本的PCR扩增物。PCR产物为366-bp长。再一次观察到对应于全血中组成型形式的ADAR1的非常暗淡的带(泳道4，p110)。

图4A和4B：人类白细胞中可诱导性ADAR1转录本的鉴定。(A)以对可诱导形式ADAR1(p150)特异的引物通过PCR扩增从人类周围血液白细胞总RNA(泳道10)和从人类血组分标准化库(泳道1-9)制备的cDNA。获得的产物在2％琼脂糖凝胶上分辨，扩增产物的预期大小为544-bp长。泳道1和6；2和7；3和8分别对应于静止的和激活的单核细胞、静止的和激活的CD4+，和静止的和激活的CD8+细胞。泳道4和5：静止的CD14+和CD19+细胞。泳道9：激活的CD19+细胞。泳道11：用作对照的来自人类胎盘的cDNA。以M指示100-bp DNA梯子/标记。显示PCR阳性(用人类胎盘cDNA的G3PDH引物，泳道13)和PCR阴性对照(泳道12)。(B)(A)的重复。泳道1-9与(A)的泳道1-9等同。泳道10：人类胎盘cDNA。

图5A和5B：人类背部前额叶皮层、皮肤和CD4+和CD8+血液细胞中ADAR1 p110、ADAR1 p150和ADAR2转录本的鉴定。(A)使用两组分别对于ADAR1 p110和ADAR1 p150特异性的引物EX1B534p/EX2 804m和EX1A 34p/EX2 578m通过PCR扩增来自人类CD4+和CD8+血组分标准化库(泳道1和2)的cDNA；从DPFC总RNA(泳道3和4)和从人类眼睑polyA+RNA(泳道5)制备的cDNA。将获得的产物在1.75％琼脂糖凝胶上分辨。扩增产物的预期大小为270-bp(ADAR1 p110)和566-bp(ADAR1 p150)。对于每个引物组显示阴性(泳道6)和阳性对照(泳道7，人类胎盘cDNA)。以M指示100-bp DNA梯子/标记。(B)使用分别针对ADAR2和G3PDH(阳性对照)的两个基因特异性引物组ADAR21274p/ADAR21486m  和G3PDH-F/G3PDH-R通过PCR扩增与(A)中相同的cDNA。获得的产物在1.75％琼脂糖凝胶上分辨，ADAR2的预期大小为212-bp长。

图6A-6C：在t零(20000IU)进行干扰素α2a小鼠干扰素单IP注射后通过QPCR测定的前额叶皮层(图6A)、皮肤(图6B)和血(图6C)样品中ADAR1的特异性mRNA的浓度进展。效果用相对于标准化至1的对照值而增加的倍数表示。*p＜0.05。

实施例1：应用的策略

这样的策略的确认涉及：

1)在给定病理中人类大脑中编辑过程的重要改变的鉴定，并通过在小鼠和/或大鼠中获得的汇聚的病理模型中作出的死后观察而验证其在该病理中的致病性暗示。

2)鉴定可以用于诊断性和治疗性调整的容易在非侵入水平获得的周围组织或细胞性。

在本发明中通过下列获得该策略的验证：

A-测定全部或部分暗示编辑调节来说足够的编辑过程的标记：5-HT2cR mRNA编辑图谱、编辑酶的不同同种型：ADAR1-150，ADAR1-110，ADAR2表达的标记。

作为获得结果的例子而验证本发明，表1确定了所建议的标记物组(在它们从所建议的人类个体和实验动物或细胞系来源中被鉴定出之后)：

表1：5HT2cR和编辑酶的表达水平。我们注意到可以容易地确定血液样品中该编辑酶的表达水平。在皮肤样品中5-HT2cR被表达并且其受ADAR1和2的编辑活性的影响并且可以完成大脑样品中该受体的编辑调节的一般状态的研究。

对于每个标记，特别小心地快速提取样品以允许可能完成mRNA表达水平、编辑图谱的确定，和以western印迹从相同组织或细胞样品中确定蛋白标记物。

表2总结了用于确定使用的生物标记的表达水平的优选过程。

下列实施例举例说明典型程序和结果。

实施例2：从大脑组织的一个样品获得完整的编辑图谱(图1)。

根据生产者的说明书(Qiagen RNeasy，小试剂盒)从组织或细胞提取物中提取和纯化总RNA。通过以GeneQuant分光光度计(PharmaciaBiotech)确定260nm吸收和260/280nm吸收比率而评价提取RNA的数量和纯度。为了去除基因组DNA的可能污染，然后在室温以1单位的DNase I(Invitrogen)在最终体积10μl中处理8μl每种RNA(88ng至1.3μg之间)。通过加入1μl的25mM EDTA终止反应然后于65℃加热10分钟。使用15单位的ThermoScript逆转录酶(ThermoScript RT-PCR系统，Invitrogen)和Oligo(dT)引物以2.5μM的终浓度进行DNAse I处理的RNA(10μl)的逆转录。

然后在1μl逆转录产物上以0.2单位的铂Taq DNA聚合酶(ThermoScript RT-PCR系统，Invitrogen)和特异性引物(正向引物：5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’(SEQ ID No.35)和反向引物：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’(SEQ ID No.36)；每种引物终浓度为0.2μM；引物分别位于人类5-HT2cR cDNA的外显子IV和外显子V上)进行第一PCR反应(终体积25μl)，形成250bp的片段。于95℃变性3分钟后，35个循环后PCR达到其终点(95℃15s；60℃30s；72℃20s)，最终延长步骤为72℃2分钟。使用扩增产物的等份在2％琼脂糖分析凝胶上检查产物。

第二PCR和通过毛细管电泳(CE)分离单链cDNA片段

使用1μl的1/50稀释的RT-第一PCR产物，或从包含人类5-HT2cR(或5HT2CR)同种型的32个标准的质粒扩增的250bp cDNA为模板用于附加的巢式PCR。这32个标准对应于人类5-HT2cR的非编辑(NE)和编辑的同种型。以HPLC纯化的荧光引物(正向引物：FAM-ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC-3’(SEQ ID No.37)；反向引物：VIC-GCAATCTTCATGATGGCCTTA-3’(SEQ ID No.38)；引物终浓度为每种0.2μM)和0.2单位的铂Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)以终体积20μl进行扩增。

VIC标记的反向引物与人类、小鼠和大鼠中相同的5-HT2c受体的互补序列杂交。另一方面，虽然与人类样品一起使用，FAM-标记的正向引物被设计成与小鼠的尽可能接近。更精确的，将人类寡核苷酸序列(人类参考U49516的位置1133和1134)位置5和6的T残基分别改变成G和C。

用Kinefold服务器(kinefold.curie.fr)实现以两个上述引物获得的PCR产物的两条链的随机折叠途径的模拟。其显示对于正向和反向链获得的最低自由能结构-插入颈-环结构的环中的编辑区域，并能够与茎折叠后位于全结构其它地方的互补序列杂交-与成功用于小鼠样品的小鼠巢式PCR产物计算的非常接近。显示这组引物对于通过单链构象多态性(CE-SSCP)通过非变性毛细管电泳进行的人类5HTR2CmRNA编辑的构象分析是最优的。

扩增片段为127bp长。对于RT-PCR，94℃初始变性步骤5分钟后，以35个循环(94℃15s；55℃30s；68℃20s)使扩增反应达到终点，最终延长步骤为68℃2分钟。再一次，在继续在3100Avant遗传分析仪(Applied Biosystem)中分析前，在2％琼脂糖凝胶上评估127bp长扩增片段的质量。

将对应于标准同种型(DEPC处理的水中1μl的1/100稀释物)和稀释于11μl去离子甲酰胺的样品(1μl的1/30稀释物)的荧光PCR产物加入覆盖电泳图谱保留时间全范围的ROX标记的迁移标准(MWG-BIOTECH，AG)(每个0.5μl)的混合物。这些ROX标准用于CE校正和随后获得标准物和样品峰的正确重叠。于95℃变性2分钟后，将样品立即在冰上冷却。通过充满7％“POP构象分析聚合物”(AppliedBiosystems)、1X TBE且无甘油的80cm长的毛细管在ABI PRISM3100-Avant遗传分析仪(Applied Biosystems)上进行非变性CE。在15kV进行预运行3分钟后，于2kV注射样品15秒，于20℃的控制温度于15kV进行电泳105分钟。在这些条件下，明确分辨32种可能同种型的每种，其作为以FAM-标记或VIC-标记链获得的单一ssDNA构象的结果。

鉴定和相对定量每个大脑样品中的每种同种型

然后使用内部软件处理电泳信号。首先，使用迁移标准的ROX-标记链调整每个样品的电泳图谱的时间基础。这允许FAM-和VIC-标记链以独特的时间基础精确去卷积标准物和样品信号。然后调整并减去背景，然后标准化每个信号下的总面积。

通过大脑样品的每个去卷积和标准化分析信号的最佳拟合处理每种同种型的相对比例。通过由32个相似的去卷积和标准化标准分析信号所代表的积分信号的反复调整而进行。计算基于下列假设：SSCP信号$S\left(t\right)=\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{g}_i{R}_i\left(t\right),$其中具有i∈{1，..，N}的R_i(t)，是标准信号，gi是信号中其每种的％。最佳拟合最小化误差平方和(SSE)$\mathrm{SSE}=\int {[S\left(t\right)-\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{g}_i{R}_i\left(t\right)]}^2$并通过最小平方统计分析而控制。

在计算r²值如$r^2=1-\frac{\mathrm{SSE}}{\mathrm{SSM}}$其中SSM是平均值相关平方和，如$\mathrm{SSM}=\underset{i=1}{\overset{t}{\Sigma }}{(S\left(t\right)-\bar{S})}^2$之后进行该最佳拟合的统计学评估结果。最大理论最佳拟合将给出r²＝1。

所有的实验在不知情条件下进行，在相同批次的RT-PCR和第二PCR反应中分析所有的样品。最佳拟合结果产生对于每个单个样品特异的编辑图谱，其通过总分析信号的每种编辑和未编辑形式的百分比而确定。这些最初值用于统计学分析。

该方法给出每种表达的mRNA同种型的比例，以作为提取物中存在的总5-HT2c受体百分比来表示。

作为例子在此给出了32种人类同种型鉴定的表格，其中每种FAM和VIC标记链的给出一组保留时间(见图1)。容易注意到使用两条链可以解决32种标准同种型的总鉴定。

该过程的主要优点是在给定浓度的5HT2cR mRNA中给出5HT2cR同种型(编辑图谱)表达分布的完全定量估计。这获自单个分析并允许容易地确定给定情况下该图谱的特征。有了该技术，在一组六个已经自杀的抑郁患者中鉴定一种特异性标志成为可能，所述标志为抑郁组患者的特征。该标志给出关于发生在大脑背部前额叶区域的编辑过程失调的有趣信息并强烈支持开发抑郁患者皮肤和血液样品中编辑酶稳定状态的兴趣。

实施例3：人类和小鼠皮肤中的5HT2CR表达

因为皮肤存在5-HT2c受体和编辑酶，皮肤可以是用于周围确定5-HT2cR编辑和编辑酶表达水平的有趣来源。

图2代表从人类(A)或小鼠(B)皮样品中提取polyA+RNA后进行的RTPCR的典型对照。

应用毛细管电泳分离第二巢式PCR产物的SSCP产物导致获得证明：人类和小鼠皮肤中，ADAR1和ADAR2编辑酶是活性的，病理或生理病理状态可以在该周围组织中修饰5-HT2cR的编辑调节。

实施例4：ADAR1和ADAR2同种型表达的位置和性质

如通过在前验证实验预测的，发现ADAR1和ADAR2同种型表达于小鼠和人类皮肤的皮肤样品中。

图3显示在提取小鼠总血液或皮肤RNA后进行的实验中ADAR1150、ADAR 1110和ADAR 2的RT/PCR鉴定对照例子。

在人类中也可能在收集小体积的血液后鉴定并容易地定量编辑酶的表达水平。

通常为每ml新鲜收集血液产生1-2x10⁶个白细胞，5ml的体积允许分离足够的用于逆转录反应的总RNA。将血液样品(5ml)收集至加肝素的管中。必须立即在无菌条件下进行规程的下列步骤。以等体积的0.9％NaCl无菌溶液或1X PBS无菌溶液或RPMI 1640无菌培养基稀释抗凝样品材料。必须在临使用前将分离培养基(例如Ficoll-PaquePlus，GE Healthcare Bio-Sciences AB，ref.：17-1440-02或17-1440-03)加热至室温并防光照。将3ml分离培养基加入15ml LeucoSep管(GreinerBio-One，ref.：163289或163290)。于室温1000g离心30秒(然后分离培养基在管的多孔屏障以下)。当使用预注入分离培养基的LeucoSep管时，可以取消前述步骤(ref.：163288or 227288)。简单地加热管子至室温。将抗凝稀释材料样品(在平衡的盐溶液或RPMI 1640中1∶2稀释，见上面)小心地倒入15ml LeucoSep管中。在室温和1000g离心10分钟，或在吊桶式转头中在室温和800g离心15分钟。

关闭离心制动

离心后，通过巴斯德移液管收集富集的细胞组分(淋巴细胞/PBMC＝白色环)。以10ml 1XPBS无菌溶液洗涤富集的细胞组分，随后于250g离心10分钟。重复洗涤步骤两次。最后一次离心，必须通过重悬于1ml 1XPBS无菌溶液将沉淀收集至微量离心管中(1.5mlEppendorf管)。在最后一次离心后(于室温250g离心10分钟)弃去上清液并快速以RNAlater RNA稳定试剂(Qiagen，ref.：76104或76106)覆盖“干的”富集细胞组分的沉淀。如果将浸没的沉淀储存于2-8℃，淋巴细胞/PBMC基因表达图谱可以在该温度下稳定至4周。如果将样品转移至RNAlater试剂，要确保沉淀总是维持浸没在该试剂中。或者在运输中保持管子直立或以稳定溶液完全充满该管子。在运输过程中，管子可以保持在充满蓝冰袋的聚苯乙烯盒中。更好的溶液可以直接将富集细胞组分的沉淀于1ml TRIzol试剂中(Invitrogen，ref.：15596-026)裂解，于室温保持并发送。由于该裂解试剂含有酚，样品管必须密封。事实上，如furnisher(Invitrogen)所述，TRIzol试剂中的白细胞裂解液(见上面)允许以后提取总RNA(水相)和蛋白(有机相)。可以于室温或干冰中发送管子。

验证的例子在图4中给出，其中显示了人类大脑、皮肤和CD4和CD8血液细胞样品中编辑酶的RTPCR产物的对照。

因此在人类中可以正确分析大脑(死后研究)、皮肤和血液样品(诊断研究)中的编辑酶的表达，如显示在图5中对照实验所图解的。

所有表2中的元素被验证，可能阐释皮肤中的血液和皮肤编辑酶表达和5-HT2/C编辑图谱分析的精确条件和限制，以来自足够生理或药理-生理学模型的深度验证作为诊断和治疗人类中的几种病理状态的生物标记。

实施例5：与患者对照样品比较分析自杀抑郁患者死后5-HT2c受体的同种型。

图1中图解的分析过程允许分析死后大脑样品中所有5-HT2c受体的同种型。对6个患者对照和精心挑选的自啥抑郁患者的研究显示：(1)特异大脑区域显示编辑和未编辑5-HT2CR同种型分布的特异模式和(2)该分布模式在人类前扣带皮层和背部前额叶皮层中显著改变，这参与主要抑郁的病理生理学。这些同种型标志的改变在表3中图解，表3显示前扣带皮层中观察到的效果。重要的，该技术可以测定同种型普遍性相对于对照的两个方向(上升或下降)上的动态改变，提供该改变下的潜在酶功能障碍的见解。此处，例如ADARI活性(其特异性编辑A和B位点和较不特异编辑C位点)上调。

表3：对照和自杀抑郁患者中获得的编辑图谱。在两组患者中确定总编辑图谱(每组n＝6)。结果代表同种型普遍性，作为所有同种型的百分比和作为平均值±SEM给出。通过ANOVA II分析标志的两方面-所有同种型的分布和根据个体编辑位点的分布。

实施例6：小鼠中干扰素α2治疗诱导血液中ADAR1表达的显著增加。还在皮肤和大脑中鉴定该周围效果。

实验在Balb/cJ小鼠中进行。通过IP途径注射20,000IU剂量的小鼠α干扰素，小鼠组(n＝8)在注射后3、6和8小时处死。在时间零处死对照组(n＝8)。快速处理血液、皮肤和大脑以避免RNA降解。从每个组织样品中提取总RNA并使用GAPDH内源性基因作为参考通过QPCR定量编码可诱导ADAR1的特异性mRNA。结果在图6中总结。其明确地显示当观察到干扰素处理小鼠的血液样品中ADAR1表达的显著增加时，也观察到皮肤样品和前额叶皮层中的扩增反应。

另外，根据在前所述的方法(见实施例2)确定了在8小时的时候处死的对照和干扰素处理小鼠的前额叶区域中5-HT2cR的编辑图谱。表4中容易地看出：

1)在快速发生于大脑的ADAR1表达的诱导之后，在这些实验条件中，在8小时见到5-HT2cR编辑过程的显著早期改变。发现包括ABCD和ACD同种型的12个编辑同种型的组显著增加。其代表30％以上的总5-HT2cR mRNA。

2)分析该组中编辑位点的比例明确显示发现编辑的A、B和C位点的比例显著增加。其可以被解释为主要由于ADAR1较大的活性。当将分析限于专一地由于ADAR1活性的该组的同种型时，其得到证实。

表4：干扰素处理后5-HT2cRmRNA编辑图谱改变的分析。在每个个体中，作为受体的总特异性mRNA中每种编辑的同种型的比例而测量编辑的总图谱。显示的结果为注射后于8小时处死的对照和干扰素处理的小鼠的平均值±SEM。从Student检验计算p值。因此显示：干扰素处理组中发现增加的编辑的同种型的和，该组同种型中发现编辑的A、B、C、D和E位点的比例，和由该组同种型所代表的mRNA的相对比例(其为ADAR1特异性作用的专一结果)。

最后合理的建议测定周围(血液)的ADAR表达的改变可以预测大脑中编辑重要改变，这可以解释几个治疗领域中的几个已经应用的治疗的状态的次级效应。