一种制备香石竹和中国石竹杂交后代的方法

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，找到了一种培育香石竹(Dianthus caryophyllus)和中国石竹(Dianthus chinensis)原生质体不对称杂交后代的方法，即采用原生质体不对称融合培养法。本发明的方法通过杂交条件的优化，克服了现有技术中难以获得香石竹和中国石竹的原生质体不对称融合杂交后代的缺陷，首次培育出株型好、观赏性强、亩种植量高的新型杂交后代。

如本文所用，“原生质体(Protoplast)”：指除去细胞壁的细胞。由于植物细胞具有坚固的细胞壁，要进行体细胞杂交，首先要获得无细胞壁的原生质体；而且不对称杂交以后要进行杂交原生质体的再培养，获得完整植株才有希望成功。

如本文所用，“原生质体不对称融合”又称为细胞不对称杂交，通常指使两个不能正常交配的细胞进行融合产生杂种后代的一种技术。进行原生质体融合的程序是：两个属于同一种或不同种的细胞，除去细胞壁形成原生质体，然后加聚乙二醇和钙离子使两个细胞膜上某些区域的蛋白质移动，裸露的磷脂区进行融合。杂种体细胞增殖出现细胞壁。

尽管原生质体不对称融合法已经成功地应用于培育一些杂交植物，然而仅有少部分的植物物种可以通过原生质体融合法成功地获得杂交后代，这主要取决于植物自身的特性、种类、原生质体大小，还受到人为操作手段、操作条件等许多复杂因素的影响。特别是一些花卉品种难于通过原生质体杂交法培育出其杂交后代。

如本文所用，“原生质体不对称融合”是指杂交的两方原生质体中，只取各自的部分遗传物质进行融合；或一方取全部遗传物质，另一方取部分遗传物质(如包括正常的细胞核)进行融合。

鉴于中国石竹在花型外观上存在一定的缺陷，香石竹株型较大花头少，本发明人致力于开发香石竹和中国石竹的优势杂交后代，以获得观赏价值更高的品种。因此，本发明提供了一种制备香石竹和中国石竹杂交后代的方法，所述方法包括：

(1)分别获取香石竹和中国石竹的原生质体；

(2)将香石竹的原生质体与中国石竹的原生质体进行原生质体不对称融合，获得融合的原生质体；和

(3)培养所述融合的原生质体，使之再生为植株，所述植株是香石竹和中国石竹杂交后代。

原生质体的分离

本发明人研究中发现，香石竹与中国石竹的原生质体大小存在明显的差异，中国石竹的细胞的体积仅为香石竹的三分之一，这给原生质体的分离和融合带来一定的难度。经过深入研究，本发明人分别优化了香石竹和中国石竹的原生质体的分离技术，从而可获得高质量的香石竹和中国石竹的原生质体。

作为本发明的优选方式，获取香石竹原生质体的方法是：

(a)取香石竹苗顶部叶片；

(b)用高渗盐溶液处理所述叶片切条，使细胞发生细胞质和细胞壁的分离(质壁分离)；

(c)酶解细胞壁，分离出原生质体；和

(d)洗涤纯化该原生质体，获得分离纯化的原生质体。

优选地将叶片切成0.5-2mm的条状；更佳地切成1-1.5的mm的条状，这样有利于获得良好的质壁分离以及酶解效果。较佳地在对叶片切成条状之前，对香石竹苗顶部叶片进行短时萎焉处理，这对于获得良好的质壁分离和酶解效果也是有利的。

质壁分离采用调节细胞渗透压的培养基，通过改变细胞渗透压使得细胞质从细胞壁上分离开来。较佳地，所述的调节细胞渗透压的培养基是含有0.7±0.2mol/L甘露醇的CPW盐溶液；更佳地所述盐溶液pH 5.6±0.2。盐溶液处理的时间是1-2小时；较佳的是1.5小时。CPW盐溶液是本领域已知的用于细胞渗透压调节的基础培养基，本发明人优化了其中加入的甘露醇的用量。

合适的酶的选择有利于较好地去除细胞壁且保留完整的、状态良好的香石竹原生质体，因此本发明人对酶解选用的酶、其用量及酶解条件进行了优化。作为本发明的优选方式，采用含有纤维素、离析酶、甘露醇的CPW盐溶液来酶解香石竹的细胞壁。较佳地，酶解液含有：2±0.3％纤维素酶，0.5±0.1％离析酶，0.5±0.1mol/L甘露醇。作为本发明的优选方式，酶解条件是：24±3℃，黑暗，静置；酶解时间是10-20小时，较佳的是12-14小时。

酶解完成后，酶解液过滤去除未酶解的组织残渣，获得含有原生质体的过滤液。原生质体的纯化是较为关键的，关系到最终获得的原生质体的质量，而试剂使用不当或操作(如离心操作)不当都将造成原生质体被破坏，因此本发明人优化了原生质体的纯化过程，找到了一种温和地纯化香石竹原生质体的方法。因此，作为本发明的优选方式，将含有原生质体的过滤液进行温和地离心，优选500rpm/min离心2-3min，去除酶解液；洗液洗涤原生质体，再温和地离心分离洗涤后的原生质体，用洗液重悬该原生质体，获得悬浮液；将悬浮液加入(优选缓缓加入)到含有0.5±0.1mol/L蔗糖的CPW盐溶液，以1000±200rpm/min的速度离心，离心后静置以形成两个液体相，吸取处于两个液体相中间的液面上的原生质体。较佳地，将获得的原生质体再用洗液洗涤一次。较佳地，所述的洗液是含有0.5mol/L甘露醇的CPW盐溶液。

作为本发明的优选方式，最终获得的香石竹的原生质体置于含有0.5±0.1mg/L 2，4-D和0.5±0.1mg/L NAA的KM8p中培养。更佳地将香石竹的原生质体密度调整为(5-10)×10⁵个/ml。

作为本发明的优选方式，获取中国石竹原生质体的方法是：

(a’)将中国石竹叶切块，诱导乳白色愈伤组织悬浮细胞系；优选细胞系的小细胞团不大于32个细胞；

(b’)酶解上述细胞系中细胞的细胞壁，分离出原生质体；和

(c’)洗涤纯化该原生质体，获得分离纯化的原生质体。

由于直接取中国石竹的愈伤组织悬浮细胞团进行操作，因此无需进行预先的质壁分离的预处理即可直接酶解。优选地，中国石竹愈伤组织酶解采用的酶解液是CPW盐溶液，其中还含有：1.5±0.3％纤维素酶，0.3±0.1％离析酶，0.1±0.02％果胶酶Y-23，5±1mmol/L MES，0.5±0.1mol/L甘露醇。优选的酶解条件是：24℃，60±10rpm/min摇动；酶解时间是2-6小时，较佳的是3-4小时。

酶解后，酶解液用300目尼龙网过滤，去除未酶解的细胞团块，获得含有原生质体的过滤液。本发明人优化了一种温和地纯化中国石竹原生质体的方法：将含有原生质体的过滤液进行温和地离心，优选500rpm/min离心2-3min，去除酶解液；洗液洗涤原生质体，离心，重复洗涤和离心2-3次；分离洗涤后的原生质体，再用原生质体培养基洗涤。

作为本发明的优选方式，最终获得的原生质体置于含有0.5±0.1mg/L 2，4-D和0.5±0.1mg/L NAA的KM8p中培养。更佳地将香石竹的原生质体密度调整为(5-10)×10⁵个/ml。

原生质体的融合

目前存在多种原生质体融合技术，本发明人经过广泛的研究后，发现不对称融合法特别适合于香石竹和中国石竹的原生质体融合。

作为本发明的优选方式，不对称融合的方法是：

(i)将香石竹的原生质体用碘乙酰胺处理，将中国石竹的原生质体用γ-射线处理；或将香石竹的原生质体用γ-射线处理，将中国石竹的原生质体用罗丹明-6G处理；或将香石竹的原生质体用罗丹明-6G处理，将中国石竹的原生质体用γ-射线处理；从而分别获得经诱变处理的香石竹和中国石竹的原生质体；

(ii)分别将密度为(1～15)×10⁵个/ml(优选(5～10)×10⁵个/ml)经诱变处理的香石竹原生质体与密度为(1～15)×10⁵个/ml(优选(5～10)×10⁵个/ml)经诱变处理的中国石竹原生质体以1∶1的比例进行混合，获得混合的原生质体；

(iii)在所述混合的原生质体中加入含有聚乙二醇的融合液进行融合；和

(iv)分离发生融合的原生质体。

碘乙酰胺(IOA)可以有效地阻止糖酵解在细胞质中进行，从而影响或破坏原生质体中的细胞质。碘乙酰胺的用量关系到原生质体的受影响程度以及后续的融合效果，因此本发明人优化了碘乙酰胺的用量。因此，作为本发明的优选方式，碘乙酰胺的浓度是4±1mmol/L；碘乙酰胺的处理方式较佳地是在0±2℃下处理12±3分钟。

罗丹明-6G可抑制其原生质体中线粒体中的葡萄糖的氧化磷酸化过程而失活，从而影响或破坏原生质体中细胞质。罗丹明-6G的用量关系到原生质体的受影响程度以及后续的融合效果，因此本发明人优化了罗丹明-6G的用量。因此，作为本发明的优选方式，罗丹明-6G的浓度是25±5μg/ml。

γ-射线可以使原生质体中的染色体形成片段、断片；断裂、抑制细胞有丝分裂，使原生质体的核失活。γ-射线的用量关系到细胞核的受影响程度以及后续的融合效果，因此本发明人优化了罗丹明-6G的用量。因此，作为本发明的优选方式，γ-射线的吸收剂量是60±10戈瑞(Gy)；较佳的是剂量率6.5±1Gy/分钟。

香石竹与中国石竹的原生质体大小存在明显的差异，中国石竹的细胞的体积仅为香石竹的三分之一，因此，本发明人考察了用于融合的两种原生质体的比例。优选地，经诱变处理的香石竹原生质体与经诱变处理的中国石竹原生质体以1∶1混合。

为了观察到原生质体融合的情况，如融合频率等，在进行融合前，可分别对两种原生质体进行染色。较佳地，采用罗丹明B染色中国石竹原生质体，采用荧光素二醋酸酯染色香石竹原生质体。

作为本发明的优选方式，采用含有PEG以及山梨糖醇、CaCl₂、MES的融合液进行融合，优选地，所述的融合液含有：35±5％PEG6000；0.185±0.02mol/L山梨糖醇，0.13±0.01mol/L CaCl₂，5±1mmol/L MES；较佳地，PH值是7.0±0.2。加入融合液过后，将融合液与原生质体充分混合。

加入融合液后，放置20±5分钟，原生质体形成网目状结构；之后，加入稀释液使网目状结构回复为原生质体形状(圆形或椭圆形)。优选地，所述的稀释液含有：0.185±0.02mol/L山梨糖醇，0.13±0.01mol/L CaCl₂，5±1mmol/LMES；较佳地，PH值是7.0±0.2。更优选地，加入2-3倍体积稀释液，放置5分钟，再加入2-3倍体积稀释液，放置5分钟，重复3次。加入稀释液使网目状结构回复为原生质体形状后，除去稀释液，回收融合的原生质体，将融合的原生质体在含有0.5±0.1mg/L 2，4-D+0.5±0.1mg/L NAA的KM8p基本培养基中培养(优选浅层培养)。

获得了融合的原生质体后，需要培养该融合的原生质体以使之再生成植株。作为本发明的优选方式，按(1-4)×10⁵个/ml(优选2.5×10⁵个/ml)融合的原生质体密度，每个直径为6cm的玻璃培养皿注入2±1ml培养液进行液体浅层暗培养(较佳地，培养温度24±2℃)。

经过鉴定发现，采用本发明的方法，香石竹中国石竹、中国石竹香石竹的异源融合率平均为3.8-6.9％。

植株的再生

在获得了融合的原生质体后，需要继续培养该原生质体，以获得再生的杂交植株。作为本发明的优选方式，再生植株的方法主要包括以下步骤：用培养液培养融合的原生质体，使之生成愈伤组织团块；用增殖培养基培养愈伤组织团块使之生成较大的愈伤组织；用芽分化培养基培养愈伤组织使之生成芽苗；对芽苗进行生根培养。优选地，对原生质体培养采用的培养液是含有0.5±0.1mg/L 2，4-D+0.5±0.1mg/L NAA的KM8p基本培养基；增殖培养基采用的是含有0.5±0.1mg/L BA和0.2±0.05mg/L NAA的Gelrite固化的MS增殖培养基；芽分化培养基采用含有1±0.2mg/L ZT和0.1±0.02mg/L NAA的MS芽分化培养基；生根培养基采用含有0.8±0.2mg/L IBA的1/2MS培养基。优选地，培养融合的原生质体使之生成愈伤组织团块的过程中采取暗培养；之后进行光照培养。

作为本发明的优选方式，在最后获得杂交植株后，还包括：对获得香石竹和中国石竹原生质体不对称杂交后代进行筛选，选择株型良好、观赏性好、且株型小于香石竹的杂交后代。

本发明的主要优点在于：

本发明首次使香石竹和中国石竹的体细胞原生质体不对称杂交，首次获得既不同于香石竹又不同于中国石竹的花型、花色及株型的杂种植株，创造了花卉品种的新种质或新品种。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另外注明，文中涉及的KM8p培养基、MS培养基、1/2MS培养基、CPW盐溶液等均与以下文献中提到的配方一样：Power，J.B和R.Davay，1980：Laboratory Manual：Plant Protoplasts.(《实验指南：植物原生质体》，英国，诺丁汉大学，Univ.of Nottingham，England)；或Murashige，T和F.Skoog，1962：A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue-culture.(用于烟草组织培养快速生长和生物鉴定的调整培养基，Physiol.Plant.15：473-497)；或Kao，K.N.，1977：Chromosomal behaviour in somatic hybrids of Soybean-Nicotiana glauca.(大豆-烟草Nicotiana glauca.体细胞杂交中的染色体行为，Mol.Gen.Genet.，150：225-230)。

实施例1.香石竹叶肉原生质体和中国石竹叶片愈伤组织悬浮细胞系原生质体的分离和纯化

1.香石竹原生质体的分离

以香石竹(Dianthus caryophyllus，种为Tuareg，红色花)扩增繁殖的试管苗为起始材料，取顶部三对伸展叶片，经短时萎蔫，用尖头镊子轻轻撕去下表皮或用解剖刀将叶片切成宽约1-1.5mm左右的细条，置于附加0.7mol/L甘露醇的CPW盐溶液(pH 5.6)中质壁分离1.5h。

质壁分离后换入过滤灭菌的酶解液【酶液组成为2％纤维素酶(Cellulase Onozuka R-10)，0.5％离析酶(Macerozyme R-10)，0.5mol/L甘露醇溶于CPW盐溶液中】。放入24℃培养箱中黑暗静置酶解12-14h。酶解后，将酶解液用无菌的200目的尼龙网过滤，去除未酶解的组织残渣。

将含原生质体的过滤液离心(500rpm/min，2.5min)，吸去酶解液，在含原生质体沉淀物的离心管中加入9ml新鲜的无菌洗液(其组成为附加0.5mol/L甘露醇的CPW盐溶液，pH 5.6)，使原生质体重新悬浮后再次离心(500rpm/min，2.5min)。吸去溶液后，再加入2ml新鲜的无菌洗液悬浮原生质体后，将此原生质体悬浮液缓缓加入到含8ml的附加0.5mol/L蔗糖的CPW盐溶液的液面上，以1000rpm/min的速度离心5min后，吸取界面上纯化的原生质体注入离心管中，再加入新鲜的无菌洗液再离心(500rpm/min，2.5min)洗涤一次后，加入10ml培养基(培养基为KM8p+0.5mg/L 2，4-D+0.5mg/L NAA)，将香石竹的原生质体密度调整为(5-10)×10⁵个/ml。

2.中国石竹原生质体的分离

中国石竹(种为兴安石竹D.Versicolor Fish ex Link，亦称变色石竹)叶切块诱导的乳白色愈伤组织悬浮细胞系(细胞系的小细胞团不大于32个细胞)。

在上述获得的细胞系中加入过滤灭菌的酶解液(酶解液组成为1.5％纤维素酶(Cellulase RS)，0.3％离析酶(Macerozyme R-10)，0.1％果胶酶(Pectolyase Y-23)，5mmol/L MES，0.5mol/L甘露醇溶于CPW盐溶液中)，置于平台摇床上(60rpm/min)24℃温育3-4h，过无菌的300目的尼龙网过滤，除去未酶解的细胞团块。

上述获得的过滤液离心(500rpm/min，2.5min)，吸去酶解液，加入9ml含0.5mol/L甘露醇的CPW盐溶液的洗液离心(500rpm/min，2.5min)清洗2-3次，再用中国石竹的原生质体培养基(培养基为KM8p+0.5mg/L 2，4-D+0.5mg/LNAA)清洗1次，再加入少量培养基，将中国石竹的原生质体密度调整为(5-10)×10⁵个/ml。

实施例2.香石竹和中国石竹原生质体不对称杂交的操作步骤

(1)材料分组

将前述获得的香石竹和中国石竹的两种原生质体各分成3份，每份2ml。

(2)原生质体的诱变处理

采取3种诱变处理方式，如下：

(A)取香石竹和中国石竹原生质体各1份，香石竹原生质体用4mmol/L碘乙酰胺(IOA)，碘乙酰胺在0℃下处理12min，阻止糖酵解在细胞质中进行。中国石竹原生质体用60Gy γ-射线(剂量率为6.5Gy/min)照射处理，使原生质体的染色体形成片段、断片；断裂、抑制细胞有丝分裂，使原生质体的核失活。将这两种处理的原生质体(香石竹中国石竹)按1∶1混匀，使原生质体的终密度达5-10×10⁵个/ml。

(B)取香石竹和中国石竹原生质体各1份，中国石竹原生质体用25μg/mlRhodamine 6G(罗丹明-6G)处理，可抑制其原生质体中线粒体中的葡萄糖的氧化磷酸化过程而失活。香石竹原生质体用60Gy γ-射线(剂量率为6.5Gy/min)照射处理，使原生质体的核失活。将这两种处理的原生质体(香石竹中国石竹)按1∶1混匀，使原生质体的终密度达5-10×10⁵个/ml。

(C)取香石竹和中国石竹原生质体各1份，香石竹原生质体用25μg/mlRhodamine 6G(罗丹明-6G)处理，可抑制其原生质体中线粒体中的葡萄糖的氧化磷酸化过程而失活。中国石竹原生质体用60Gy γ-射线(剂量率为6.5Gy/min)照射处理，使原生质体的核失活。将处理的香石竹原生质体5ml加0.1ml FDA【0.1mg/ml的FDA(荧光素二醋酸酯)】染料染色；将处理的中国石竹原生质体用Rhodamine B(罗丹明B)染色。再将这两种处理的原生质体(香石竹中国石竹)按1∶1混匀，使原生质体的终密度达5-10×10⁵个/ml。便于随后这两种原生质体不对称融合时，在荧光显微镜下观察并统计异源融合频率，同源融合频率及多源融合频率。

(3)取3支2ml的吸量管，做上标记(2号、3号、4号)分别吸取前述(A)、(B)、(C)的原生质体的混匀悬浮液1.5ml，按每滴0.125ml，分别滴4滴等间隔，置于直径为6cm的各三个玻璃培养皿的皿底上，使原生质体沉淀放置10min。

(4)取3支1ml的吸量管，吸取35％PEG6000高pH值高钙融合液(35％PEG6000溶于含0.185mol/L山梨糖醇，0.13mol/L CaCl₂，5mmol/L MES，pH7.0的无菌稀释液中)0.9ml，按每滴0.075ml的量，分4滴等间隔滴入含原生质体悬滴液之间的各三个玻璃培养皿皿底。

(5)用无菌的玻璃吸量管的尖端，顺时针方向移动上述PEG悬滴到原生质体悬滴中，使35％PEG6000高pH值高钙融合液充分地与原生质体接触，放置20min，形成网目状结构。

(6)每皿加0.4ml稀释液(0.185mol/L山梨糖醇，0.13mol/L CaCl₂，5mmol/L MES，pH7.0，过滤灭菌)，放置5min。再加0.5ml稀释液，放置5min，如此共连续3次，由网目状结构逐渐恢复成原生质体的形状，这主要是发生融合的过程。

(7)离心(500rpm/min，2.5min)除去稀释液，回收融合的原生质体。再加2ml稀释液悬浮融合的原生质体，离心(500rpm/min，2.5min)清洗，除去稀释液，回收纯化的融合的原生质体。加培养液(KM8p+0.5mg/L 2，4-D+0.5mg/L NAA，pH 5.8)，按2.5×10⁵个/ml融合的原生质体密度，每个直径为6cm的玻璃培养皿注入2ml培养液进行液体浅层暗培养(24℃)。经近三年共4批次的试验，香石竹中国石竹、中国石竹香石竹的异源融合率平均为3.8％-6.9％。

上面(A)、(B)、(C)三组采用不同的处理方式，融合率也存在不同，即：A组融合率为3.8％、B组融合率为5.1％、C组融合率为6.9％。由上述可知，在三种诱变方式中，C组可获得最高的融合率，因此是最为优选的处理方式。

实施例3.不对称杂交融合细胞的培养及再生

融合原生质体培养5-6天后，大部分原生质体开始长壁，细胞呈椭圆形，培养7天后可见到再生细胞开始第一次分裂，培养至10天时融合细胞的平均分裂频率达12.4％。

在暗培养过程中每隔10天加入新鲜的培养液(KM8p+0.5mg/L 2，4-D+0.5mg/L NAA，pH5.8)0.5ml以维持正常的渗透压，使分裂细胞持续分裂，直至形成小细胞团或小愈伤组织块，培养至90-95天时，肉眼可见到大量乳白色的小愈伤组织团块，用玻璃吸管将其一起吸到附加0.5mg/L BA和0.2mg/L NAA，0.2％Gelrite固化的MS增殖培养基上，经5-6周的光照培养(光照10小时，光强2500-3000Lux)，共获得杂种愈伤组织217块，当愈伤组织长到3-4mm大小时，将其转到含1mg/L ZT和0.1mg/L NAA的MS芽分化培养基上，初代培养共获得27个再生的芽苗，杂种愈伤组织的芽分化频率在8％左右。

经诱导生根试验的结果表明1/2MS+0.8mg/L IBA是最适宜的生根培养基，经15天生根培养后，已获得T₀代杂种植株27株(其中表型偏香石竹的有7株，偏中国石竹的有9株，呈中间型的有11株)。取中间型的7株经扩增繁殖T₁代，获20余瓶试管苗杂种植株，再取其中的7瓶经再繁殖获3000多株试管植株，移栽于温室大棚内种植。

香石竹和中国石竹原生质体杂交后代的获得流程可参见图1。

对获得的中间型植株观察发现，杂种植株株形、株高近似中国石竹，但花序数多头，近似香石竹，且其花色呈大红且色彩鲜艳。这些植株相对而言比香石竹和中国石竹更具有培育价值，株型更好，观赏性更强，且种植产量高。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。