溶胶-凝胶相可逆性水凝胶模板及其应用

相关申请的参考

本申请要求2007年9月27日提交的美国临时号60/995,693，和2008年2月19日提交的美国临时号61/066,376的权利，通过参考将其公开内容引入本文中。

发明领域

本发明涉及水凝胶模板及其在制造包含药物活性成分和诊断剂的纳米(nano)/微米(micro)结构中的应用。

发明背景

为了数日到数月范围内的长期药物递送，已经广泛使用处于纳米-或微米-级的肠胃外施用粒子。纳米/微米粒子易于利用常规针头施用。它们还已经用于多种药物的口服施用。尽管广泛应用纳米/微米粒子系统，但是临床有效产物的开发非常缓慢，且仅获得了有限数量的临床产物。如用于本文中时，“纳米”指纳米粒子和方法，其中级别在1纳米(nm)-1微米(μm)的范围内。如用于本文中时，“微米”指粒子和方法，其中级别在1微米(μm)-1000微米(μm)的范围内。当不需要在纳米和微米尺寸之间作出区分时，术语“微”一般用于指处于纳米-和微米-尺寸二者范围内的物体。

临床上成功制剂的缓慢开发归因于若干原因。例如，微粒子中的药物负荷效率一般非常慢；典型地对于大部分药物，特别是蛋白质药物，低于10％。即使对于具有较高负荷效率，例如，10-20％的那些药物，这些药物中的大部分在制备过程中损失。这对于低成本药物可能是可接受的，但是大部分蛋白质药物非常昂贵且这样的损失对于任何制剂而言是不愿接受的。关于这样的损失的原因之一是在微粒子在制备过程中通过乳化方法变固化之前，微粒子中的水溶性药物暴露于大量水，这是用于微粒子制备的最常用方法。另外，目前的乳化方法很难扩大规模以获得大规模生产并导致不均匀的粒子尺寸分布。近期在纳米技术，尤其是纳米/微米制造(共同地，微制造)和制造方法中的进展已经提供了制备药物制剂的新方法。

高分辨率微制造技术的发展已经在微电子学和微型仪器工业中引起根本改变。通过使用微制造方法，诸如照相平版印刷术和电子束(E束)平版印刷术，开发了具有微米和纳米特性的硅和玻璃模板。在最近几年中，发展了若干微制造方法作为能够在不危害特性完整性的条件下获得高分辨率的E束和照相平版印刷术的备选方案。另外，这些方法在材料和处理方法中具有比基于硅的微制造技术更大的多功能性。这些新印刷方法包括纳米压印平版印刷术[H.Schift]，步进闪光压印平版印刷术[V.Truskett，等]，分子转移平版印刷术[C.Schaper]，和软平版印刷术[Y.Xia，等]。这些方法使用微制造的硅或玻璃模板，或具有特殊性质的聚合模板，从而在不同底物上形成图案。

纳米压印平版印刷术(NIL)是高分辨率图案形成方法，其中将压印器上的表面图案通过机械接触和三维材料位移复制到材料中。NIL的主要优势是以高通量和低成本在很大面积上形成25nm以下结构的图案的能力。步进闪光压印平版印刷术(S-FIL)与NIL的区别在于是UV辅助的铸模可光致固化的液体的纳米压印技术，而非热辅助的聚合物-涂层片的成型。

分子转移平版印刷术(MxL)用于复制作为水溶性模板的表面图案。该模板通过在硅原始图案上旋转-浇铸聚(乙烯醇)(PVA)溶液来制备。使由此生成的水溶性模板干燥并然后利用介于其间的粘合层与另一种底物结合，所述粘合层通过光固化、热固化、或两部分反应方案而固化。该模板通过用水分解来以化学方式去除，从而在粘合层中产生成形的图案。参见，例如，授予Schaper的美国专利号7,125,639。

软平版印刷术是一组利用具有浮雕特性的弹性压印器产生微结构的非照相平版印刷微制造技术的总称。在软平版印刷技术中，微接触印刷术[Yan等]，微转移成型[Zhao等]，和微流体接触印刷术[Wang等]已经生成单独的聚合物结构。软平版印刷术方法使用疏水性聚合物(例如，聚(二甲基硅氧烷)，或PDMS)模板来压印。这些方法容许利用有机聚合物，生物聚合物，和无机材料来制备软材料模板。

目前可用的纳米和微米粒子药物递送系统这样通过乳化方法制备。乳化方法导致高度多分散粒子群，且它们的物理-化学特征，降解动力学，材料特性和药物释放模式仅代表所述粒子的平均值。由于所述粒子非常不均匀，所以很难检查尺寸对生物反应的影响，这归因于粒子尺寸的广泛分布。此外，比平均尺寸大得多的粒子的存在使其难于开发临床有效的递送系统。微制造技术容许单分散粒子的制备。已经结合剥离(lift-off)方法开发了若干基于软平版印刷术的策略，以制备均一的粒子。这些策略容许制造由包含药物的聚合物制成的微结构，尽管为了进行容易的大量收集，该过程需要充分改进。

已经开发了微接触热印刷术(μCHP)，以利用热塑性聚合物制备薄膜微粒子[Guan，等]。这种方法选择性地将聚合物特性从压印器上的连续膜转移到底物上。通过该方法，已经制备了热塑性聚合物，诸如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)，聚己酸内酯(PCL)，聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)，和聚苯乙烯的微粒[参见，例如，美国专利公开2004/0115279]。然而，该方法遭遇若干局限性。第一，控制微粒子的厚度非常困难，因为其取决于聚合物溶液从PDMS压印器到释放载玻片的完全转移。这导致具有不均匀厚度的微粒子的形成。尽管可以控制微粒子的侧面尺寸，但是微粒子的垂直尺寸(即厚度)不能得到严格的控制。第二，该方法仅对稀释的聚合物溶液(1-7％)有效，因为其涉及通过浸入聚合物溶液中来填充模板的微孔。在较高的浓度时，聚合物溶液是高度粘性的且难于填充所述孔，因为聚合物溶液倾向于在模板表面上形成连续的聚合物膜。第三，由于大部分聚合物仅可溶于有机溶剂，所以溶剂可以扩散到PDMS基质中，由此破坏压印器并阻止微粒子由孔中流畅地释放。

步进闪光压印平版印刷术(S-FIL)已经用于制造精确尺寸的纳米粒子。S-FIL是可商业获得的纳米成型方法，其利用石英模板的外形在硅片上将UV可交联的大分子单体成型为图案。[参见，美国专利公开2007/0031505]。尽管该方法产生纳米粒子，但是它具有严重的局限性。第一，它涉及石英模板中大分子单体的原位光聚作用。这可以导致关于为了临床应用而生产的粒子的纯度担忧。第二，一些光引发剂分子会在可以与人体中存在的其他生物分子反应的纳米粒子中保持活性，从而潜在地引起严重的副作用。第三，压印粒子在分离过程中向氧等离子体的暴露导致在纳米粒子表面上形成反应性离子并还能降解药物分子。

已经开发了不润湿模板上的粒子复制(PRINT)，以利用基于含氟聚合物的模板制备微粒子。已经通过该方法制造了聚(乙二醇二丙烯酸酯)、三丙烯酸酯树脂、聚(乳酸)(PLA)和聚吡咯的200nm以下到微米级别范围内结构的单分散聚合物粒子。PRINT使用化学抗性含氟聚合物作为成型材料，这消除在成型物体之间形成残留相互连接膜。[参见，例如，美国专利公开2007/0264481]。PRINT成型已经用于制造聚合物和蛋白质微粒子[Rolland，等，Kelly等]。PRINT法已经证明了基于含氟聚合物的不润湿模板用于制造用于多种应用的微粒子的应用。然而，PRINT法的粒子应用受到多步骤PFPE模板制备和费力的粒子捕获过程的限制。例如，PRINT粒子利用使用手术刀片的物理刮擦或通过使用玻璃载玻片的剪切力从所述片上收获，二者均不实际且可以损伤粒子，且因此它们可能不适合于大规模生产。而且，通过使用可原位聚合的氰基丙烯酸酯捕获膜捕获的PRINT粒子可以导致反应单体吸附到PRINT粒子上，由此引起表面污染。

上述方法，即μCHP，S-FIL，和PRINT，能够生产均匀尺寸和形状的微米-和纳米粒子，但是它们对于开发临床有效药物递送粒子的实践应用具有若干局限性。第一，该方法通常需要模板孔中大分子单体的原位聚合，同样见于S-FIL和PRINT。这引起关于用于人应用的微粒子纯度的担忧。第二，该方法不能控制微粒子的厚度，同样见于μCHP。第三，该方法仅适合某些材料。第四，该方法需要多步骤和费力的粒子捕获过程。用于使制造的微粒子释放到溶液中的严格调节，包括高度腐蚀性溶液和升高的温度，可以破坏已经引入到微粒子中的脆性化合物。因此，利用目前可用的制造方法制造微结构存在显著局限性。总之，为了在药物递送中应用，存在对开发新模板制备方法和用于制造具有不同尺寸和形状的均一微结构的新材料的关键需要。

发明概述

微粒子按照本发明的原则，通过使用具有许多孔/洞的溶胶-凝胶相可逆水凝胶模板制备。本发明的水凝胶模板最终由母模板(master template)形成，其优选由硅片利用常规照相平版印刷技术制成。这样的蚀刻技术可以用于设计具有广泛多样形状，例如，圆形、矩形、菱形等的母模板的柱，以使得水凝胶模板具有与硅母模板中的柱相同形状的孔。

本发明的水凝胶模板可以(i)直接由硅母模板，或(ii)间接通过中间聚合物模板形成。因此，关于水凝胶，由于具有所需大量孔的正象，选项(i)需要形成负象母模板。对于选项(ii)，母模板应该具有与水凝胶模板基本相同的正象(positive image)。具有负象(negative image)的中间聚合物模板方便地由常规成型聚合物，诸如聚(二甲基硅氧烷)，或PDMS形成。

使用母模板或任选的聚合物模板，在其上包被溶胶层。该溶胶然后转化为凝胶，从而形成与母模板或聚合物模板分离开的水凝胶模板。本发明提供溶胶-凝胶相可逆水凝胶模板，其中设计的洞具有约100nm-约1,000μm范围内，优选200nm-200μm范围内，更优选500nm-100μm范围内的尺寸。

在本发明的另一方面，纳米粒子或微米粒子通过这样的方法制备，所述方法包括用其中溶解有不溶于水的聚合物的非水溶液填充水凝胶模板中的许多孔，其优选还包含生物活性剂。所述不溶于水的聚合物在孔中通过蒸发溶剂从非水溶液中固化。纳米粒子或微米粒子可以再由水凝胶模板，例如，通过将水凝胶溶解在水溶液中来捕获。在另一个实施方案中，可以将包含微粒子的水凝胶模板切成适当的尺寸并冷冻干燥(冻干)，例如，在管中。后一个实施方案允许仅通过添加水溶液而迅速复原。

以前的微制造方法没有使用水凝胶模板来制备所需尺寸范围内的微粒子。本发明使其更容易得多地形成和收集纳米和微米尺寸的粒子，且简单的处理步骤容许简单的扩大规模。此外，本发明提供非常高的药物负荷效率，至多50％，这是使用常规方法所不可能的。负荷到所述粒子中的优选生物活性剂包括低分子量药物，诸如，紫杉醇，西罗莫司，普罗布考，和灰黄霉素，以及高分子量药物，例如，采用粉末形式的，诸如蛋白质药物包括免疫球蛋白，生长因子，胰岛素，干扰素和红细胞生成素。

附图说明

图1显示按照本发明原则的微粒子制造程序的示意性描述。该顺序表示制造硅片母模板(A)，形成水凝胶模板(B和C)，通过填充水凝胶模板中的洞形成微结构(D)，将水凝胶模板溶解在水溶液中(E)，和收集单个微结构(F)。

图2显示利用中间聚合物模板和水凝胶模板的微粒子制造程序的示意性描述。该顺序表示制造硅片母模板(A)，形成中间聚合物模板，例如，PDMS模板(B)，利用中间聚合物模板形成水凝胶模板(C)，和通过填充水凝胶模板中的洞形成微结构(D)。形成的微结构可以如图1的步骤E和F所述收集。

图3显示用于制造微粒子的制造程序的示意性描述，在所述微粒子中，水性中心由不溶于水的聚合物，例如PLGA覆盖。该顺序表示利用硅片母模板或中间聚合物模板形成水凝胶模板(A)，通过旋转包被或喷雾包被形成最初的PLGA层(B)，用水性小滴填充孔(C)，和用第二层PLGA覆盖洞，以密封水性中心。形成的微结构如图1所述通过溶解水凝胶模板收集。

图4显示具有不同几何形状的微孔的明胶水凝胶模板的荧光图像。孔填充有掺有尼罗红，即荧光染料的PLGA溶液，以易于视觉化。所有的孔均为直径50μm且深度50μm。

图5显示按照本发明原则形成的双层PLGA微圆盘的荧光(左)和明视野(右)图像。该微圆盘含有2个不同层，即尼罗红染料(红，顶部)和非洛地平药物(蓝，底部)。

发明详述

现将参考下文所述的附图和实施例详细描述本发明。

制备硅片母模板

硅片母模板遵从充分确定的技术制造。用旋涂仪光致抗蚀剂(正向，AZ-1518)包被在干净、氧化的()Si片上。在正向光致抗蚀过程后，将Si片插入到缓冲的氢氟酸溶液中蚀刻二氧化硅。除去光致抗蚀剂后，将Si片浸没在四甲基氢氧化铵中蚀刻硅。蚀刻的Si片母模板用于进一步处理。在Si片上蚀刻的孔的尺寸是不同的，以获得具有不同直径和深度的孔。不仅孔的尺寸而且形状也可以是不同的。许多形状，诸如圆形、三角形、矩形和星形，应该非常有效地用于这样的应用中，其中基于形状的区别非常是重要的。

关于10μm和50μm图案的UV照相平版印刷术

不同尺寸和形状(例如，圆形、杆形、菱形和三角形)的照相平版印刷术掩膜可以通过使用自动CAD 2007程序，和由TR Electromask XX251仪制造的掩膜设计。用六甲基二硅氮烷(Mallinckrodt)，以3,500rpm，旋转包被覆盖有1μm厚SiO₂层的4″硅片(University Wafer)30秒(来自专业包被系统(Specialty Coating Systems)的SCS P6708旋涂仪)。然后，用光致抗蚀剂AZ9260(Microchemicals GmbH(显微化学GmBH))，以1000rpm旋转包被硅片30秒，以形成均匀10μm厚光致抗蚀剂膜。然后，将该片在90℃温和焙烤10分钟，以除去溶剂和湿气。利用掩模对准器(Karl SussMJB-3)，使光致抗蚀剂包被的硅片暴露于UV光(23m W/cm²)26秒，随后在持续搅拌的条件下，用AZ 400K显影剂(Microchemicals GmbH(显微化学GmBH))显影2分钟。显影的硅片用水冲洗并在氮气流中干燥。

关于50nm，100nm，300nm，500nm，和1μm图案的E束平版印刷术

UV-照相平版印刷术具有1μm尺寸分辨率的局限，并且不有效用于特征为低于1μm的纳米制造。另一方面，E束平版印刷术具有1μm-10nm的分辨率范围。E束平版印刷术使用高功率电子束产生非常高度集中的电子束，其可以以非常高的分辨率书写非常细微的特征。为了利用E束平版印刷术制造硅母模板，使用以下步骤。利用旋涂仪，以3,500rpm，对覆盖有1μm厚SiO2层的3″硅片(University Wafer)旋转包被300nm厚聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA，Microchem)光致抗蚀剂层30秒。利用莱卡VB-6超高分辨率，超宽视野电子束平版印刷术工具(以100KV，传输速度25MHz，电流5nA操作)，使包被的PMMA光致抗蚀剂层暴露于处于预编程模式的电子束。E束平版印刷后，使硅片在3∶1异丙醇∶甲基异丁基酮溶液中显影。利用Varian E束蒸发器，在该图案上堆积5nm Cr和20nm Au，随后在回流丙酮中剥离剩余的PMMA膜。通过反应离子蚀刻将该图案转移到下面的氧化硅上(STS反应离子蚀刻(RIE)系统)。硅母模板在场致发射扫描电子显微镜(FESEM，Hitachi S-4800)下检查，以表征图案的尺寸、形状、和完整性。

由水凝胶模板制备预定几何形状的微粒子

本发明的关键方面是利用溶胶-凝胶相可逆水凝胶模板制备微结构。制备易于捕获制备的微结构的水凝胶模板一般程序示意性显示在图1中。步骤A-F显示利用水凝胶模板由母模板微制造微粒子：(A)在硅片母模板上形成图案；(B)将明胶溶液置于母模板顶上并降低温度以形成水凝胶压印(溶胶-到-凝胶相变)；(C)明胶层固化后，剥离明胶铸模暴露洞；(D)通过用刀片涂抹药物/PLGA溶液或膏剂填充水凝胶铸模中的洞；(E)通过升高水浴中的温度溶解明胶铸模(凝胶-到-溶胶相变)；和(F)通过离心收集单个粒子。

在图1中所述的方法的一种变化中，在制备水凝胶模板前，可以制造中间聚合物模板，诸如PDMS中间模板。如图2中所示，中间聚合物模板可以利用聚合物，诸如聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)(184硅弹性体)制造。弹性体单体和固化剂的比例为10∶1(w/w)的混合物充分混合。将该混合物倒至处于容器，例如玻璃Petri皿中的硅片母模板顶上。然后将该容器置于真空中10分钟，以除去气泡，并再转移到70℃的室中固化30分钟。将PDMS中间模板从Si母模板上剥离(图2B)，且PDMS中间模板用于制备水凝胶模板(图2C)。

水凝胶模板通过将形成水凝胶的物质的溶液应用到母模板表面或中间聚合物模板表面上来形成。水凝胶膜通过在所述表面上发生的溶胶-凝胶相变形成。溶胶-凝胶转化，例如，通过改变温度，引入多价离子，或干燥来诱导。一旦形成，简单地从母模板或中间模板剥离水凝胶模板。以这种方式形成的示范性水凝胶模板可以包括天然聚合物诸如明胶、琼脂糖、壳聚糖和藻酸盐。

如图1中所示，按照本发明的一种制备微粒子的方法包括将溶解在非水性溶剂中的生物活性剂和聚合物的混合物应用到水凝胶模板的许多孔中，以使得所述孔填充有药物/聚合物混合物。药物/聚合物混合物可以作为溶液或膏剂来应用，其随后可以，例如，通过溶剂蒸发而硬化。膏剂形式容许引入高浓度生物活性剂和聚合物，膏剂可以压填到水凝胶模板的孔洞中。然后，将填充的水凝胶模板置于水溶液中，以诱导由凝胶到溶胶的相变，从而释放单个药物/聚合物微结构，其可以随后通过过滤和/或离心收集。制造的微结构因此表现出充分确定的几何形状，该几何形状精确地对应于水凝胶模板的微孔。典型地，所述微结构具有约100nm-约1000μm，优选约200nm-约200μm，更优选约500nm-约100μm，和最优选约1μm-约50μm范围内的直径。

如图3中所示，按照本发明的另一种制备纳米-和/或微米粒子的方法包括将溶解于有机溶剂中的聚合物应用于水凝胶模板的许多孔的内表面，以使得所述孔包被有所述聚合物。例如，使用超声波喷雾器，将可以包含溶解在其中的生物活性剂的一个以上水性小滴提供到包被的孔中。参见，例如，美国专利号6,767,637，通过参考将其公开内容引入本文中。然后，用溶解在有机溶剂中的聚合物填充孔，以使得水性小滴被聚合物，例如，通过溶剂交换包封。参见，美国专利号6,599,627，通过参考将其公开内容引入本文中。最后，从水凝胶模板中，诸如通过将模板溶解在水中，去除聚合物包封的小滴，从而释放粒子。

如图1-3所示，形成的微结构通过简单地将水凝胶模板溶解在水溶液中来收集，且该过程使微结构的大规模生产比任何先前的方法更简单和容易。由该方法产生的微结构应该具有可忽略量的污染，即使存在，因为其涉及使用处于小量有机溶剂中的生物适合的形成水凝胶的聚合物，诸如明胶，和药物/PLGA，所述小量有机溶剂可以通过真空蒸发去除。制备本文中所述的微结构涉及填充开式铸模。开式铸模意指水凝胶模板中的孔是敞开的，以用于填充药物/聚合物溶液，且是敞开的，以用于蒸发所用的有机溶剂。在目前可用的方法，例如，S-FIL法中，将玻璃模板压到单体溶液中，形成闭式铸模，随后发生光聚作用。该闭式铸模导致膜形成，需要若干随后的处理步骤，并因此减小微结构生产效率。开式铸模可以减少微结构成型过程中所需步骤的数量和事件的顺序，并且其可以改进溶剂由前体材料中的蒸发速度，由此增加微结构生产的效率和速度。

用可调融化温度制造水凝胶模板

大规模生产包含亲水性大分子药物，诸如蛋白质药物、酶、DNA和siRNA的微结构是非常挑战和困难的，因为这些类型的生物分子对于处理条件，例如，高温或长期暴露于有机溶剂，高度敏感。本发明的水凝胶模板策略精确和完美地解决了这些问题，并且其可以方便地用于大规模生产敏感的生物分子微粒子，而不使其变性。通过使形成水凝胶的明胶溶液掺有某些无机盐、合成聚合物、或生物分子，可以调节明胶模板的融化温度，以适合特定微粒子生产需要。此外，由于粒子的捕获步骤在水或水性缓冲溶液中进行，所以可以最小化或避免微粒子中敏感生物分子的变性，由此保持其生物活性。使形成水凝胶的溶液掺有其他物质可以降低明胶水凝胶模板的融化温度。因此，无机盐(诸如LiCl，NaCl，KCl，CaCl₂，和MgCl₂)，合成聚合物(诸如PVA，PEG，聚乙烯亚胺，聚(丙烯酸))，生物分子(诸如牛血清清蛋白，和组氨酸)，可以降低明胶模板的融化温度，如以下实施例中所示。

结果和讨论

将微制造技术成功转化为药物递送应用需要开发仅使用温和条件处理和使用生物适合物质，并足够简单以进行规模扩大的生产的新方法。所述方法还导致高药物负荷效率和控制药物释放动力学的能力。生物活性剂可以负荷到约1-约80wt％，优选约5-约50wt％范围内的微粒子中。本发明提供出乎意料地简单、便宜、和有效的用于制造预定尺寸和形状的聚合物微结构的水凝胶模板策略。形成水凝胶的物质已经首次用于制备用来制造各种均匀尺寸和形状的微结构的压印模板。

任何可以形成溶胶-凝胶相可逆水凝胶的物质可以用于制备本发明的水凝胶模板。示范性凝胶包括明胶、琼脂糖和果胶。一些聚合物在较高温度时形成水凝胶且在较低温度时融化。这些称为反向热可逆水凝胶，且实例包括甲基纤维素和聚(环氧乙烷)/聚(环氧丙烷)/聚(环氧乙烷)三嵌段共聚物。可以在存在有机盐的条件下形成可逆水凝胶，诸如在存在钙离子的条件下由藻酸钠形成水凝胶的其他聚合物，也可以用于制备水凝胶模板。优选地，使用明胶，因为其具有对于利用水凝胶模板法制造微结构理想的特性。明胶具有特性，诸如水溶液的可逆凝胶-到溶胶转变，不溶于冷水而完全溶于温水，和起保护胶体作用的能力的组合。起保护胶体作用的能够是明胶非常有用的特性，其在利用水凝胶模板法制备微结构中非常有效，因为明胶可以吸附到微结构表面上，从而通过位阻排斥保护它们免于在水性溶液中聚集。

形成水凝胶的物质已经用在组织工程、药物递送、诊断中，并用作医疗和生物学传感器。然而，水凝胶材料以前没有用于形成饰有微小图案的牺牲模板。一般认为，水凝胶在机械方面太脆弱，以致于不能用作制备微结构的模板。水凝胶通常含有10％以上的水，且那些含有多于95％的水的水凝胶称为超吸收剂。明胶水凝胶含有40-90％的水。因为存在大量水，所以通常认为水凝胶非常脆弱，且因此，认为水凝胶不能用作用于制备微粒子的模板。然而，出人意料的是，明胶水凝胶提供对于处理充足的机械强度。

水凝胶模板策略的主要优势如下。(1)形成水凝胶的物质的溶胶-凝胶相可逆性质，即，热可逆，或pH可逆，或刺激物响应属性容许更简单的模板制备和颗粒捕获方法。(2)水凝胶模板可以制备为高度弹性和在机械方面强壮的，以抵挡变形和破裂，由此容许它们用于模板制备和填充所需的操作。(3)水凝胶模板的三维网络彻底减慢药物、蛋白质、DNA、siRNA、和聚合物前体由微孔向模板中的扩散。(4)水凝胶模板法在不融化或溶解水凝胶的条件下，适用于许多聚合物和可原位聚合的材料。(5)具有理想功能特性，诸如pH灵敏性和温度灵敏性的可逆物理凝胶用于模板制备和粒子释放的应用增强所述策略的多功能性。

以下代表性实施例说明利用本发明水凝胶模板法制造微结构。在不偏离本发明公开的主题的范围，可以使用许多变化、修改、和变更。

实施例

实施例1.制造具有特定几何形状的孔的水凝胶模板

在水凝胶模板的典型制造中，明胶溶液(30％重量)通过将30g明胶(来自电泳1型猪皮，300Bloom，Sigma(西格玛))溶解在总共100ml超纯水(nanopure water)(在150ml的Pyrex瓶中)并充分混合制备。对该瓶加盖，以防止蒸发，并将其置于65℃烤箱中2小时或直到形成清澈溶液。清澈的明胶溶液用于制备水凝胶模板。将该温暖清澈的明胶溶液(10ml)用移液管转移到微制造的硅片(3″直径)上，所述硅片包含直径50μm和高度50μm的圆柱(图1A)。明胶溶液均匀分散以形成完全覆盖该片的薄膜。该包含明胶膜的硅片通过保持在冰箱中冷却到4℃，5分钟。冷却导致形成弹性的且在机械方面强壮的明胶模板。冷却后，明胶水凝胶模板从硅片上剥离(图1B)。直径3″的水凝胶模板包含直径50μm和深度50μm的圆孔。明胶水凝胶模板在明视野发射显微镜下检查，以确定其结构完整性(图1C)。由此制备的明胶水凝胶模板在45℃融化。

实施例2.制造PLGA微粒子

20％PLGA(MW 60,000；IV 0.8，Birmingham Polymers(伯明翰聚合物))溶液通过将2g PLGA溶解在10ml二氯甲烷中制备。用移液管，向包含直径50μm和深度50μm的圆孔的直径3″的水凝胶模板上转移200μl 20％PLGA溶液。通过用剃刀片以45度角挥击(swiping)，PLGA溶液均匀地分散在水凝胶模板上。施加轻微的压力，以迫使PLGA溶液完全填充孔，而不使水凝胶模板变形(图1D)。用剃刀片挥击最小化水凝胶模板表面上PLGA膜的形成。用PLGA溶液和分离的微粒子完全填充圆孔，在明视野和荧光显微镜(Olympus BX51Microscope(奥林帕斯BX51显微镜))下观察。

实施例3.收集微粒子

填充有20％PLGA溶液的水凝胶模板暴露于25℃10分钟，以从PLGA微粒子中除去二氯甲烷。然后将水凝胶模板置于50mL装有25ml45℃超纯水的烧杯中并轻摇2分钟以完全溶解水凝胶模板(图1E)。用于溶解明胶水凝胶模板的温度可以通过掺入多种试剂，诸如KCl降低。该步骤导致各种微粒子的完全释放。将溶液转移到圆锥形离心管中并离心(Eppendorf离心机5804，转子A-4-44，以5,000rpm，19.1RCF)5分钟，弃去上清液，并收集沉淀。将在离心时获得的沉淀冷冻干燥并保存在冰箱中。该沉淀在重新悬浮在1ml超纯水中时，形成自由和分离的微粒子分散系，这归因于通过位阻排斥起胶体稳定剂作用的表面吸附明胶分子的存在(图1F)。

实施例4.由硅母模板任选形成PDMS弹性体铸模

如图2中所示，在Si片母模板顶上制备聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)(184硅弹性体)压印铸模。弹性体单体和固化剂的比例为10∶1(w/w)的混合物(Sylgard 184硅弹性体，Dow Corning)充分混合。将该混合物倒至处于Petri皿中的Si片母模板顶上(图2A)。将Petri皿置于真空中10分钟，以除去气泡，并再转移到70℃的室中固化30分钟。将PDMS压印铸模从Si母模板上剥离(图2B)，且PDMS压印铸模用作用于制备水凝胶模板的模板(图2C)，所述水凝胶模板用于制备实施例1-3中所述的纳米/微米粒子。

实施例5.制造纳米/微米粒子单核胶囊

具有水性单核中心的纳米/微米胶囊通过用可生物降解的聚合物膜包封水性小滴形成。参考图3，PLGA作为代表性聚合物使用。PLGA溶解在有机溶剂中，并利用旋涂仪或超声波喷雾器将该溶液喷到水凝胶铸模上(图3B)。PLGA溶液在水凝胶铸模上形成薄膜。由于水和有机溶剂之间的界面张力，大多数有机溶剂在水凝胶表面上分散。由于存在许多可以用在该过程中的溶剂，所以筛选大量溶剂，以寻找对于形成PLGA膜的最佳溶剂。在多种有机溶剂中合成和溶解PLGA共聚物(75/25)，以制备2％溶液。水凝胶铸模由浓度30％的明胶制成。

一旦在水凝胶铸模上形成第一PLGA膜，则包含生物活性剂的水性小滴，包括药物活性剂或成像试剂，喷涂到所述第一PLGA膜上(图3C)。由于水性小滴的高表面张力，它们在填充每个孔后保持为球形小滴。一旦用水性溶液填充孔，另一个PLGA膜通过相同的过程形成(图3D)。这导致每个孔中形成由PLGA层包围的水性小滴，即由PLGA膜包围的具有水性中心的微胶囊。

在水性小滴上形成第二PLGA膜后，PLGA膜可能覆盖水凝胶铸模全部各处，包括孔之间的空间。在该情形中，为了分离单个微胶囊，通过使整个水凝胶铸模暴露于氧等离子体(oxygen plasma etching)蚀刻去除胶囊之间的膜。氧等离子体蚀刻几分钟降解PLGA薄层，而保持胶囊完整。然后，将在孔中具有PLGA胶囊的水凝胶铸模置于水浴中，以溶解明胶铸模。当明胶铸模溶解时，明胶分子可以吸附到单个胶囊的表面上，以提供对抗形成的胶囊聚集的位阻排斥。其他目前可用的技术不提供任何利用水凝胶铸模稳定胶囊的方法。

实施例6.制造具有可调融合温度的明胶水凝胶模板

在掺有能够改变明胶凝胶融化温度的试剂的明胶模板的典型制造中，将不同的无机盐和生物学试剂溶解在装在150ml Pyrex瓶中的100ml超纯水中。不同的试剂列在表1中。向该溶液中，加入30g明胶(来自电泳1型猪皮，300Bloom，Sigma(西格玛))并充分混合。对该瓶加盖，以防止蒸发，并将其置于55℃烤箱中2小时或直到形成清澈溶液。清澈的明胶溶液用于制备水凝胶模板。将该温暖清澈的明胶溶液(10ml)用移液管转移到微制造的硅片(3″直径)上，所述硅片包含直径50μm和高度50μm的圆柱。明胶溶液均匀分散以形成完全覆盖该片的薄膜。该包含明胶膜的硅片通过保持在冰箱中冷却到4℃，5分钟。冷却导致形成弹性的且在机械方面强壮的明胶模板。冷却后，明胶水凝胶模板从硅片上剥离。直径3″的水凝胶模板包含直径50μm和深度50μm的圆孔。明胶水凝胶模板在明视野反射显微镜下检查，以确定其结构完整性。在存在不同试剂条件下制备的明胶水凝胶模板在低于45℃的温度融化，如表1中所示。

表1.利用不同掺杂剂的的明胶水凝胶板(30％明胶)的融化温度。

实施例7.制造不同形状的PLGA微粒子

制备不同形状的微粒子，并且示范性形状显示在图4中。如所示，可以容易地制备环形、pacman、三角形、星形、十字形和菱形的微粒子。除了这些形状外，还可以容易地制备具有其他诸如常见的圆形和方形的微粒子。

实施例8.制造聚己酸内酯(PCL)微粒子

通过将2g PCL溶解在10ml二氯甲烷中制备20％PCL(d 1.145，Aldrich(奥德里奇))溶液。相同的过程用于制备如实施例1-3中所述的微粒子。

实施例9.制造不同尺寸的PLGA微粒子

微粒子的尺寸通过简单改变硅母模板的微结构的尺寸，由1.2μm到大于50μm变化。由1.2μm以上改变尺寸可以容易地通过利用UV照相平版印刷进行，但是对于小于1.2μm的尺寸利用E束平版印刷术制备。

实施例10.制造药物负荷的PLGA微结构

通过将2g PLGA溶解在10ml二氯甲烷中制备20％PLGA(MW60,000；IV 0.8，Birmingham Polymers(伯明翰聚合物))溶液。向该溶液中加入1ml非洛地平(在CH₂Cl₂中1g/ml)并通过涡旋充分混合，以获得非洛地平/PLGA溶液(1∶2w/w)。用移液管，向包含直径50μm和深度50μm的圆孔的直径3″的水凝胶模板上转移200μl非洛地平/PLGA溶液。通过用剃刀片挥击，非洛地平/PLGA溶液均匀地分散在水凝胶模板上。施加轻微的压力，以迫使PLGA溶液完全填充孔，而不使水凝胶模板变形。除非洛地平外，还向微结构中引入其他药物，诸如孕酮，灰黄霉素，普罗布考和紫杉醇。

实施例11.制造具有2种不同药物或染料的双层的微结构

明胶水凝胶模板还用于制造具有2种不同药物，或药物和染料，或2种不同染料的2个不同层的双层微结构。实施例1-3中所述的相同方法用于制备非洛地平药物和尼罗红染料的双层PLGA微圆盘。双层微粒子的制备是水凝胶模板法所特有的，因为利用目前可用的方法非常难以制备。图5中的荧光和明视野图像清楚地证明两个清楚且不同的非洛地平(蓝)和尼罗红(红)层的存在。

实施例12.大规模制备水凝胶模板和微结构

明胶溶液(30％重量)通过将30g明胶(来自电泳1型猪皮，300Bloom，Sigma(西格玛))溶解在100ml超纯水(在150ml的Pyrex瓶中)并充分混合制备。对该瓶加盖，以防止蒸发，并将其置于65℃烤箱中2小时或直到形成清澈溶液。由此制备的清澈的明胶溶液用于填充到薄层层析板涂布器(Camag)中。利用所述填充明胶的板涂布器，用300μm厚明胶层包被亲水性塑料薄片(20cm x 20cm；3M Corporation(3M公司))。将包含直径50μm和高度50μm的圆柱的微制造硅片(直径3″)压到明胶膜中并通过保持在冰箱中冷却到4℃，5分钟。冷却导致形成弹性的且在机械方面强壮的明胶模板。冷却后，明胶水凝胶模板从硅片上剥离。由此获得的水凝胶模板的尺寸为20cm x 20cm，且包含直径50μm和深度50μm的圆孔。用聚合物溶液填充由此制备的水凝胶模板，随后融化该水凝胶模板以收集形成的微粒子。

新颖性和优势

这种新方法使用水凝胶模板制造微粒子。水凝胶模板不仅起用于制备微粒子的模板的作用，而且对处理过程结束时在水性溶液中悬浮的微粒子起稳定化成分的作用。该方法中的另一个关键过程是当其处于水凝胶模板的微孔中时，固化可生物降解的聚合物。该方法与水具有最小的接触。直到最后一步，在最后一步时溶解整个水凝胶模板以释放单个微粒子。该具体过程是造成药物到粒子中高负荷效率的原因。不仅可生物降解的聚合物，而且惰性聚合物，诸如聚(乙烯-共-乙烯基乙酸酯)、尼龙、硅橡胶、和聚苯乙烯可以根据预期的应用，用于形成粒子。

微制造过程利用硅片母模板，可以容易地控制硅片模板中形成的孔的形状和尺寸，且尺寸分布应该非常均一。尺寸可以由纳米到微米变化，且形状可以由简单的圆盘到更复杂的形状，诸如星形或十字形。控制母模板，即水凝胶铸模上的尺寸和形状的能力，以及负荷不同活性成分的能力使得这种新型微制造方法高度有效。

已经参考具体实施例描述了本发明，其目的是为了清楚和理解。技术人员应该理解可以在所附权利要求及其等价范围内进行某些变化和改进。

参考文献

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