法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-02-15
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12P33/00 授权公告日:20150520 终止日期:20151223 申请日:20091223
专利权的终止
2015-05-20
授权
授权
2012-04-18
实质审查的生效 IPC(主分类):C12P33/00 申请日:20091223
实质审查的生效
2010-09-08
公开
公开
技术领域：
本发明涉及一种提高白桦悬浮细胞中三萜含量的实用技术，它属于生物工程技术领域。
背景技术：
白桦(Betulaplatyphylla Suk.)是桦木科(Betulaceae)桦木属(Betula Linn)的一种落叶乔木，主要分布在温带亚洲的日本、朝鲜、俄罗斯和中国等亚欧大陆。早在《本草纲目》中记载，桦树皮可用于黄疸、乳痈、疥疮等疾病的治疗。近年来的研究表明，白桦树皮的主要活性成分之一为三萜类物质，占树皮干重的25％～30％左右。白桦三萜具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降脂、利胆和保肝等作用(Kessler等，2007)，特别是白桦酯醇、白桦酯酸等三萜物质作为天然药物在抗肿瘤和抗HIV等活性上显示出了与以往药物不同的作用机制，靶向作用性更强，几乎无不良反应等特点(Jing等，2005；Wen等，2007)。因此，白桦三萜作为药物化学中的先导化合物而逐步受到研究者的注视。
白桦三萜的获得大都从白桦树皮中提取和分离，这样不仅造成白桦资源的破坏，而且作为新型药剂的临床研究，特别是推广应用的数量受到限制。而大规模植物细胞培养技术因具有不受地区、季节、资源的影响，不破坏环境，通过自动化控制细胞生长和合理调节代谢过程来降低成本和提高生产率等优点已成为植物药品的新来源。
我们前期的研究发现，白桦愈伤组织可生产白桦三萜，其含量却显著低于白桦树皮中(范桂枝等，2009；王博等，2008)，而白桦愈伤组织及其悬浮培养的细胞具有增殖快、生长周期短、生长均一、繁殖培养简单等特点，是一种生产白桦三萜的理想代替品。
真菌诱导子(fungal elicitor)是将分离培养的真菌的菌丝或培养液制备成诱导子，它可以促使细胞快速、大量合成有用次生代谢产物。近年的研究表明，利用来自真菌的诱导子成分，可以诱导植物悬浮细胞或植物幼苗产生或提高其体内的次生代谢物。然而利用真菌诱导子提高白桦细胞中三萜含量的研究还未见报道。
因此，我们期望通过真菌诱导子对白桦悬浮细胞的作用，提高白桦悬浮细胞的产量和质量，使之成为白桦树皮的替代资源，来生产白桦三萜。该发明将为利用细胞工程技术工业化生产白桦三萜奠定重要的理论和技术基础，也为新型诱导子的开发和内生真菌与宿主间相互作用的机理研究提供依据。
发明内容：
本发明涉及筛选显著提高白桦三萜的内生真菌、内生真菌诱导子与白桦悬浮细胞混合培养的方法，该方法工艺简单、周期短、成本低，为白桦三萜的工业化生产创造条件。
本发明的目的在于提高白桦悬浮细胞中的三萜含量和产量。
为了达到这个目的，本发明利用白桦细胞的悬浮培养体系，筛选出了有效提高白桦三萜的内生真菌—拟茎点霉属，并通过优化真菌诱导子的诱导技术使白桦悬浮细胞中的三萜含量显著提高，确定了诱导子的添加浓度、适宜添加时间和诱导时间，建立了真菌诱导子与白桦悬浮细胞混合培养生产白桦三萜的新技术。
生物材料样品保藏：
拟茎点霉属BE55(Phomopsis sp.BE55)，保藏日期为2009年11月16日，保藏单位名称及简称：中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，邮编：430072，登记入册编号CCTCC No：M 209271。
技术方案：
(1)真菌的培养
将本实验室分离纯化的内生真菌从低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于PDA培养基中，于25℃恒温培养10-15天，分别在菌落边缘打孔成菌片，取菌片接种于装有PDA液体培养基的三角瓶中，于25-28℃，100-180r/min摇床中培养7天，收获菌体和培养液。
(2)真菌诱导子的制备
筛选有利于白桦三萜积累的内生真菌诱导子的制备方法：将纯化的内生真菌菌丝发酵培养7天，将收获的菌液和菌体匀浆后121℃灭菌20min，以糖终浓度60μg/ml制备成诱导子。
上述筛选出有利于白桦三萜积累菌种的诱导子的制备：
①真菌多糖诱导子：将收获的菌液和菌体匀浆后121℃灭菌20min，取其上清液，上清液即为真菌多糖诱导子。上清液糖含量采用蒽酮比色法测定。
②真菌蛋白诱导子：用无菌水和0.05mol/L磷酸缓冲液冲洗菌体去除孢子，将10克菌体装入离心管中，加入适量的0.05mol/L磷酸缓冲液，超声波破碎10min，8000r/min离心10min，取上清液，上清液即为真菌激发子蛋白液。上清液蛋白的浓度采用考马斯亮蓝比色法测定。
(3)白桦细胞的悬浮培养
悬浮细胞来自白桦组培苗诱导的松散愈伤组织，培养液为B5液体培养基(氮源改为NT培养基)，添加0.1mg/mL的BA和0.01mg/mL的TDZ，蔗糖20g/L，pH值为5.5-6.0，接种量为4％(W/V)，每隔15天继代一次，摇床转速为100-200rpm，培养温度24-26℃，光照强度1500-2000Lux，光/暗周期16h/8h，湿度60％-70％。
(4)三萜的测定方法
将收获的白桦培养细胞烘干、研磨，精确称取0.1g样品放入10mL离心管中加入95％乙醇4mL浸泡过夜(2次)，70度水浴提取1h，40℃下超声(超声频率为10kHz)40min，以10000rpm离心10min取上清液，精密移取待检测样品200μL，置于试管中于70℃水浴中蒸干。加入新制的5％香草醛-冰醋酸溶液0.20ml，再加入高氯酸0.80ml摇匀，于70℃恒温水浴15min，流水冷却至室温，再加乙酸乙酯定容到5ml，摇匀，同时以试剂空白为参比，用1cm比色皿测定551nm处的吸光值。
本发明的效果：
本发明利用真菌诱导子显著提高了白桦悬浮细胞中的三萜含量。利用上述技术方案，以白桦悬浮细胞为材料进行实验，其结果是：拟茎点霉属〔Phomopsissp.〕(编号为BE55)的内生真菌诱导子可以显著地提高白桦细胞中的三萜含量，利用BE55内生真菌制备的多糖和蛋白诱导子分别使白桦细胞中的三萜含量增加了1.80和2.47倍。
本发明的优点：
(1)培养的白桦悬浮细胞具有生产白桦三萜的能力，并且悬浮细胞生产的白桦三萜的主要有效成分与白桦树皮的基本相同，实现了白桦药用资源的开发和利用。
(2)白桦悬浮细胞增殖快、生长周期短、繁殖培养简单。一个继代周期为15天，平均细胞增长4-8倍。如果以一批细胞年继代20次，以1L培养基中的40g细胞为原材料连续培养1年计算，不计细胞的增殖率，还可生产白桦三萜29.4g-38.4g，如果计算细胞的增殖率，那产量是相当可观的。
为了更好的理解本发明，下面结合本发明的实施例进一步说明本发明的实质性内容：
实施例1.筛选显著提高白桦三萜的内生真菌
将从白桦树皮中分离出的59种内生真菌的菌丝在PDA液体培养基中发酵培养7d，然后将收获的菌液和菌体匀浆后121℃20min灭菌，以糖终浓度为60μg/ml制备成诱导子。在白桦悬浮细胞生长的第8d加入真菌诱导子，每个菌种制备的诱导子菌处理3瓶悬浮细胞，诱导3d后收获细胞，测定细胞的干重和细胞中的三萜含量。
在B5培养基中接种生长10周的白桦悬浮细胞，接种量4％(W/V)。接种的白桦悬浮细胞于24-26℃，1500-2000Lux光照培养，在细胞培养的第8天，将59种白桦内生真菌制备成的诱导子分别加入白桦悬浮细胞培养液中，处理3d后收获悬浮细胞。以白桦酯醇为标准品，用香草醛-冰醋酸溶液为染料比色测定细胞中的总三萜含量。结果显示，白桦细胞中的三萜的积累量对不同真菌诱导子的响应程度不同，三萜含量的变化范围为5.0mg/g～29.2mg/g，三萜相对增长率的变化范围为-70.68％～193.76％。其中，编号为BE55的诱导子显著地增加了三萜产量，三萜产量是对照组的1.84倍。
实施例2.优化筛选菌种制备的多糖诱导子的诱导效果
在B5培养基中接种生长10周的白桦悬浮细胞，接种量4％(W/V)。接种的白桦悬浮细胞于24-26℃，1500-2000Lux光照培养，分别在细胞生长的第3d(生长延迟期)，第8d(对数生长期)，第13d(生长末期)加入三种浓度(40μg/ml，100μg/ml，400μg/ml)的BE43真菌多糖诱导子，并分别诱导培养1d，2d，3d后收获细胞，收获的细胞在60℃下干燥后称干重。以白桦酯醇为标准品，用香草醛-冰醋酸溶液为染料比色测定细胞中的总三萜含量。结果显示，加入不同浓度的真菌多糖诱导子后，细胞的干重不同程度的降低了，而三萜含量却有不同程度的提高。其中，在培养的第8d加入浓度为40μg/ml的诱导子，诱导培养1d，细胞中三萜含量和产量达到最高，分别为29.47mg/g和1.47g/l(DW)，三萜含量是未作诱导处理的1.80倍。
实施例3.优化筛选菌种制备的蛋白诱导子的诱导效果
在B5培养基中接种生长10周的白桦悬浮细胞，接种量4％(W/V)。接种的白桦悬浮细胞于24-26℃，1500-2000Lux光照培养，在细胞培养的第8天加入浓度为40μg/ml、80μg/ml、120μg/ml的真菌蛋白诱导子，分别于诱导培养的1d，2d，4d收获细胞，收获的细胞在60℃下干燥后称干重。以白桦酯醇为标准品，用香草醛-冰醋酸溶液为染料比色测定细胞中的总三萜含量。结果显示，加入不同浓度的真菌蛋白诱导子后，细胞的干重和三萜含量均有不同程度的提高。其中，在培养的第8d加入浓度为80μg/ml的真菌蛋白诱导子，诱导培养4d，细胞中的三萜含量和产量最高，分别为34.49mg/g和1.92g/l(DW)，三萜含量是未作诱导处理细胞的2.47倍。
附图1.白桦内生真菌拟茎点霉属〔Phomopsis sp.〕的菌落形态图
附图2.白桦内生真菌拟茎点霉属〔Phomopsis sp.〕的孢子图
附图3.未作诱导处理的白桦悬浮细胞培养图
附图4.荧光显微镜下的白桦悬浮细胞(×1000)
机译： 促进毛细血管样结构中肝代谢产物积累和排泄的肝细胞培养设备，使用该肝细胞培养设备促进对胆汁或血液中排泄敏感的候选化合物以及评估候选化合物的肝脏代谢物的方法
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