虾白斑综合症病毒病核酸样品制备方法及虾白斑综合症病毒检测方法

技术领域

本发明属于生物技术中的病毒检测领域，具体涉及一种虾白斑综合症病毒病核酸样品制备方法以及利用核酸样品经LAMP扩增后检测虾白斑综合症病毒的方法。

背景技术

白斑综合征病毒病是一种烈性病毒性传染病，其病原为白斑综合征病毒(WSSV)，WSSV是一种感染力极强、致死率极高的病毒，可在感染一周内死亡率高达80％-100％，而且其宿主域非常广泛，已经成为海、淡水养殖对虾或者螯虾中具有严重威胁的疾病，一旦发病就难以做到及时治疗，可能导致养殖虾类出现暴发性死亡，严重的甚至会导致整池绝产，给广大养殖者造成惨重损失。目前WSSV已遍及亚洲主要对虾养殖国家和地区，并已传播到北美洲。在已报道的所有对虾病毒中，该病毒毒力最强，危害最大，南美白对虾、斑节对虾、日本对虾、墨吉对虾、长毛对虾、中国对虾、印度对虾、桃红对虾、蓝对虾、白对虾、褐对虾、刀额新对虾、脊尾白虾、斑节对虾等，大部分养殖对虾皆可被WSSV侵染，在浮游生物、海葵、糠虾、白虾、毛虾、天津厚蟹、日本大眼蟹等动物中可检测出WSSV，在虾池的蟹、桡足类和昆虫(Ephydridae)体内也检到过WSSV，因此早在1995年国际兽疫局(OIE)、联合国粮农组织(FAO)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)就将其列为需要报告的重要的水生动物病毒病病原之一。国内外普遍认为只有综合预防才能控制WSSV。用碘制剂消毒养殖池水、给养殖虾投喂免疫增强剂、监控养殖塘的各项水质指标以及采取及时清理死虾、病虾以切断病毒传播途径。总的来说，采用减少感染机会的措施是大多数养殖户用以避免健康虾感染WSSV的主要方法。

有关WSSV的研究在病原学、病理学、流行病学以及诊断学研究方面已深入到分子水平，但由于由于诸多原因，到目前为止还不能完全控制WSSV的疫情，面对WSSV的传播所能采取最主要的措施是及早发现和消灭传染源，果断切断传播途径，特别是在养殖环境中，早期灵敏、简便、快速的诊断可以为及时采取有效措施，减少损失，防WSSV大规模暴发提供科学的依据。

近年来发展起来的环介导等温扩增法(LAMP，loop-mediated isothermalamplification)，是一种全新的恒温核酸扩增方法，该方法可以高灵敏地非常有选择性地高效扩增靶序列(Notomi et al.，2000)，最终的LAMP产物是是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱。它具有所需仪器少：只需要一个恒温装置就可以；灵敏高：模板仅需要10个拷贝或更少；扩增特异性强：应用包含了六个区段的四条引物按严格顺序进行扩增；检测时间短：一般扩增可以在60min以内完成，比普通PCR反应还要省时间。因此LAMP在核酸的科学研究、疾病的诊断和预防、动物胚胎的性别鉴定和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。通常为了使用LAMP方法实现检测，需要先期制备供扩增用的模板，在LAMP扩增后，还需要对扩增产物进行可视化观察，以确定LAMP的最终扩增结果，该结果代表了检测的最终结果。2004年Tomoya Kono将WSSV从kuruma shrimp中纯化出来，再提取WSSV的核酸，利用LAMP技术对此核酸进行扩增，以电泳观察LAMP结果。最后证实LAMP可用于WSSV相应序列的扩增，为虾的WSSV诊断打下了基础。2008年Lakshmi等用病毒吸附技术分离病毒，细胞培养液用蔗糖梯度超速离心方法获得模板，用RT-LAMP检测CHIK病毒。扩增结果可通过向反应管内加入SYBR Green I，根据显色来判断。2008年杨秋林等用醋酸可的松经皮下注射Wistar大鼠诱导Pc，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)经离心、加入裂解缓冲液、多次消化后提纯Pc基因组DNA，然后用环介导等温扩增(LAMP)技术检测卡氏肺孢子虫(Pc)，结果阳性Pc检测管经显色后呈绿色，阴性对照组均呈棕色。袁文等于2009年使用QIAamp viral RNA mini kit提取病毒的基因组RNA，建立小鼠肝炎病毒的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测技术并进行初步应用。在检测扩增结果时，往LAMP反应管中加入SYBR Green I荧光染料显色，可见MHV阳性管变为绿色，而阴性管仍为染料原色橙色。这些研究表明，使用纯化过的病毒(病原)制备模板，通过LAMP扩增后可以通过向LAMP反应管中加入SYBR Green I荧光染料显色，用肉眼直接判断LAMP的扩增结果，简化了原来的通过电泳观察结果的步骤。

显然在已有的基于LAMP检测的整个过程中，其模板制备及LAMP结果观察的过程呈现二类，一类是通过先期纯化病毒(或特定的待检测对象)，以后可以通过多种方法来制备模板，此时制备模板的方法可以是通过试剂盒或简单的煮沸法，在LAMP扩增后可通过电泳或加入SYBR Green I荧光染料显色以肉眼直接观察结果；第二类是不纯化病毒，而是直接将包含宿主及病毒在内的组织进行共提取，利用LAMP扩增的特异进行扩增的，由于是在模板制备中混合了宿主核酸和病毒核酸，如果以加入SYBR Green I荧光染料通过显色后直接凭肉眼观察判别结果，会由于共提取时存在的混合核酸，与SYBR Green I结合，也会产生荧光，因此不能通过SYBR Green I显色后直接以肉眼观察来判断扩增的结果，对扩增准确结果目前是通过电泳来判断。

然而，具广泛实用性的LAMP检测的方法应该是具高灵敏性、高特异性、操作简便、耗时短、成本低等特点，因此，需要研究一种简单实用的虾白斑综合症病毒病核酸样品制备方法以及在此基础上的虾白斑综合症病毒检测方法。

发明内容

本发明目的是提供一种虾白斑综合症病毒病诊断用核酸样品制备方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种虾白斑综合症病毒病核酸样品制备方法，包括以下步骤：取处死的新鲜的虾的组织，加到缓冲液III中，然后95～100℃加热3分钟以上，离心后取上清作为核酸扩增的模板；其中，所述缓冲液III的组成为：20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，10mM氯化钾(KCl)，体积百分数0.1％曲拉通X-100(聚乙二醇辛基苯基醚，TritonX-100)，10mM硫酸铵(NH₄)₂SO₄，2mM硫酸镁MgSO₄。

上述技术方案中，所述虾的组织可以选用虾的任何组织，没有严格要求，例如：虾足(包括螯足、步足均可，而且不用去壳，可对带壳的组织进行处理、这是现有技术中的各种方法均不能实现的，这样无需解剖虾，而且剪了一小节足的虾还能继续存活，因此，实际操作过程中，不一定需要对虾进行处死处理)、虾鳃、肌肉、或是其它组织；按比例每1g虾组织需要0.5～50mL缓冲液III。

上述技术方案中，加热方式优选沸水浴加热，加热的时间优选为3～15分钟，更优选为5分钟。

上述技术方案中，离心方式优选为：离心机5000rpm离心5分钟。

采用上述技术方案获得的核酸扩增的模板可用于LAMP反应或PCR反应，具体地，上述方法制备的上清液1μL作为模板可用于25μL总体积的LAMP反应或0.5μL作为模板可用于25μL总体积的PCR反应。

本发明的另一目的是提供一种采用上述模板进行环介导等温扩增(LAMP)检测虾白斑综合症病毒的方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种虾白斑综合症病毒检测方法，包括以下步骤：

(1)以上述上清液为扩增模板，按照常规方法，构建环介导等温扩增体系，所述扩增体系包括缓冲液、扩增引物对、dNTP、Bst DNA聚合酶，并且，每25μL扩增体系还包括1μL上述上清液；

(2)进行环介导等温扩增反应，反应完成后，向稀释千倍至万倍后的环介导等温扩增(LAMP)产物中添加SYBR Green I，在紫外光激发下，通过肉眼直接观察是否有被激发出的绿色荧光结果来判断实际检测结果。

上述技术方案中，所述扩增引物对根据所要扩增的虾白斑综合症病毒核酸的特异性保守区域设计，已经证实的扩增目的区域可为WSSV234或WSSV131。

其中，酶是在将反应混合物于95℃预变性5min，再迅速至冰上冷却后加入扩增反应体系。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1、由于本发明在核酸模板制备过程中采用缓冲液III处理虾组织，所述缓冲液III不仅不会对后续的LAMP或PCR扩增产生不利影响，还可以充分裂解虾组织，有利于释放核酸，使核酸尽量伸展，并且核酸在该溶液中具有相对的稳定性，混合在其中的蛋白质能在制备样品的过程中同时被失活，所有加入的成分将不会对后续的LAMP或PCR扩增产生不利影响，来自于模板制备过程中没有去除的非WSSV的核酸(包括虾的核酸、其它病原的核酸等)也不会影响SYBR GREEN I对特异性扩增结果产生显色干扰，因此能保证后续的检测能顺利、快速、高特异性地进行；

2、本发明制备核酸模板耗时约为15min，即使与用专业的病毒核酸提取试剂盒直接从病虾组织中提取核酸比较时，仍具有所需样品少、操作简单、省时、省力、成本低的优点；

3、本发明所制备的可用于检测WSSV模板，可直接从病虾组织中获取，无需先对病虾中病毒进行分离纯化的复杂处理；

4、采用本发明技术方案制备的模板，可用于LAMP和PCR反应，尤其适用于LAMP，同时LAMP的优点例如高灵敏性、高特异性、时间短等，在此完全被保留；

5、采用本发明技术方案制备的模板，经LAMP联合使用，LAMP扩增结果经简单稀释千倍至万倍后，可消除其中来自虾的DNA所造成的显色背景污染，因此仍可通过加入SYBR GREEN I后经肉眼判定诊断结果，不需要电泳，从而解决了只有使用纯化病毒(或纯化的特定检测对象)模板的LAMP产物才能用SYBR GREEN I显色后肉眼直接检测的限制；

6、采用本发明所述方法检测虾白斑综合症病毒所用时间在90min左右，与其它LAMP检测相比较，整个诊断全程(包括前期样品制备、LAMP扩增、LAMP产物检测)所用时间大为缩短，适合于大批量检测；

7、本发明所述虾白斑综合症病毒的检测方法不需要PCR仪，也不再需要电泳仪，自然也不会用到EB这类有毒的核酸染料，仅需一个恒温装置(例如水浴锅)、一个小型的普通离心机和一个紫外灯即可完成检测，整个操作过程简单，步骤小，成本低，有利于推广应用。

附图说明

图1是实施例一中不同方法提取模板后进行LAMP结果电泳；其中，1：用苯酚/氯仿法提取模板；2-6：分别用缓冲液III、缓冲液I、缓冲液II、超纯水以及TE，通过快速煮沸法提取模板；

图2是实施例四中稀释后LAMP产物的SYBR Green I显色比较图，其中，上行1-5：以健康虾制备模板的LAMP产物分别稀释10、10²、10³、10⁴、10⁵后的SYBR Green I显色结果；下行1-5：以WSSV病虾制备模板的LAMP产物分别稀释10、10²、10³、10⁴、10⁵后的SYBR Green I显色结果；

图3是实施例四中通过SYBR Green I在管内直接显色和电泳方法检测LAMP产物结果对比图，其中，A：以SYBR Green I直接在离心管中显色结果；B：为相应的EB染色电泳结果；1：以健康虾制备模板LAMP扩增反应后经1000稀释；2-4：以病虾制备模板先经10³、10²、10¹倍稀释再作为LAMP扩增的模板进行LAMP扩增反应后稀释1000倍的显色结果；

图4是实施例六中注射组LAMP产物在紫外灯下的SYBR Green I显色结果，其中，1-6：注射2.5μL病毒悬液4h、5h、6h、12h、18h及24h后取样检测WSSV的结果；7：注射失活病毒液24h后取样检测WSSV的结果；

图5是实施例六中注射组LAMP及一步PCR产物的电泳结果；其中，1，2，3，5，7，9，11：注射2.5μL病毒悬液4h、5h、6h、12h、18h、24h后和注射失活病毒液24h后的LAMP检测结果；4，6，8，10：注射6h、12h、18h、24h取样的一步PCR检测结果；M：Marker。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：采用不同模板制备方法制备扩增用模板并进行LAMP扩增，对比扩增结果。

具体操作过程如下：

(1)模板DNA的提取：

第一类方法，经典的苯酚/氯仿提取法：取确认被自然感染WSSV的克氏原螯虾，处死、充分剪碎，取新鲜组织0.1g，加TE 100μl，①加入500μl饱和酚，充分混匀10min，再10000rpm离心10min，取水相，②重复①后，再加入500μl酚/氯仿(1∶1)，充分混匀后，10000rpm离心10min，取水相，③再加入500μl氯仿混匀后，10000rpm离心10min，取水相，④加入1/10体积的3M醋酸钠，及2倍总体积的95％乙醇混匀，10000rpm离心10min，弃上清，将沉淀以75％乙醇清洗后干燥，再溶于50μl TE后备作为检测用DNA模板。

第二类方法，通过加入不同缓冲液后经快速煮沸法制备(简称快煮法)：分别取确认被自然感染WSSV的克氏原螯虾处死，各取同样新鲜组织0.1g稍剪碎后，分别加100μl下述液体混匀，于100℃水浴5min，再经5000rpm离心5min后的上清作为LAMP反应的模板备用；所用的五种液体均以灭菌超纯配置，分别为：TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA)；缓冲液I(20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L KCl，0.1％Triton X-100，1mmol/L EDTA)；缓冲液II(20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L K Cl，0.1％Triton X-100)；缓冲液III(20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L KCl，0.1％Triton X-100，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，2mmol/L MgSO₄)以及灭菌超纯水。其中缓冲液I、II、III均为本发明中提供的配方。

(2)LAMP扩增

LAMP所用的引物为：前内引物(FIP-234)参见SEQ ID No.1：5′-CGCATA TTT CCC TCT ATC GCT ATT ATT TTT TAG CAC AGA TTT TTT GAT-3′。后内引物(BIP-234)参见SEQ ID No.2：5′-GGT CTG AAA TAT ACA TGGGTG CCT TTT TGA AAA TGG GGT TTA CGA CAA-3′；外引物F₃-234参见SEQ ID No.3：5′-GGT AAA GGA ACG TTT TGT TG-3′、B₃-234参见SEQ IDNo.4：5′-GCA ATG GGA ATG ATA ACT CTT-3′。扩增WSSV ORF234区域。

LAMP的反应为25μL体系，2.5μL的10×buffer，FIP-234、BIP-234终浓度为0.8μmol/L，F3-234、B3-234终浓度为0.2μmol/L，dNTP终浓度为0.4μmol/L，1.0μL的按上述方法制备的模板及8U(1μL)的Bst DNA聚合酶(New England Biolabs(Beijing)，Ltd.)。酶是在将反应混合物于95℃预变性5min，再迅速至冰上冷却后加入。将反应液混匀后于63℃水浴反应60min。

(3)LAMP的反应产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测(EB染色)，得到图1：结果显示用传统苯酚/氯仿法抽提模板的LAMP呈阳性，有较清楚条带产生；用快煮法提取的模板进行的LAMP反应，除了用超纯水作为缓冲液，通过快煮法提取的模板经LAMP扩增后无明显条带产生外，用其它四种缓冲液，通过快煮法所制备模板的LAMP结果都呈阳性；其中，用缓冲液III、通过快速煮沸法制备DNA模板进行的LAMP效果最好，表现为LAMP特有的梯形条带亮度最高、最清晰。用这种方法制备的DNA作为模板也比用传统苯酚/氯仿法抽提的模板进行LAMP反应的结果要好得多(图1)，但制备所需的时间要少得多(用经典苯酚/氯仿法提取DNA的时间与本实施例提供的完成整个检测工作的时间大致相当)，同时操作步骤少、操作简单、成本低廉。

实施例二：以缓冲液III经快煮法制备模板分别扩增WSSV ORF 234和WSSV ORF 131中特异区域。

具体操作过程如下：

(1)模板DNA的提取：以实施例一中，将罗氏沼虾的WSSV病虾组织加缓冲液III经快煮后制备的模板作为母液，再经10倍系列梯度稀释后，作为模板分别用于LAMP扩增WSSV ORF 234和WSSV 131。

(2)LAMP扩增WSSV ORF 234的引物为实施例一中所述FIP-234、BIP-234、F₃-234、B₃-234；扩增WSSV ORF 131的引物为：FIP-131参见SEQ ID No.5(5′-CCA GTG CAC TAT TCC CAT TAG AAG GTT TTA CCA CTC CCT TCATTA TTG TC-3′)、BIP-131参见SEQ ID No.6(5′-CCT TTT GCC CCT TCAGCT GA TTT TCT GAG CCA GGT GTT CTG-3′)、F3-131参见SEQ ID No.7(5′-TGT GGA TGA TTA TCC TGT GTT-3′)、B3-131参见SEQ ID No.8(5′-TCT CTC TGG TGA ACC CAT-3′)。

LAMP扩增：

扩增WSSV ORF 234同实施例一；

扩增WSSV ORF 131的方法参照实施例一，除引物以FIP-131、BIP-131、F3-131、B3-131分别取代FIP-234、BIP-234、F3-234、B3-234，以63℃反应75min不同外其余均相同。

(3)LAMP结果的观察同实施例一。

结果显示，通过针对WSSV ORF 234区域扩增的效率比通过针对WSSVORF 131的区域要高10倍，但二者都非常灵敏，将通过快煮法制备的模板经10¹¹倍稀释后再用于LAMP扩增，均可获得满意的结果。

实施例三：分别用LAMP、一步PCR与巢式PCR检测WSSV的灵敏性比较

(1)模板DNA的制备：将0.1g克氏原螯虾WSSV病虾组织稍剪碎后加缓冲液III 100μl于100℃水浴5min，再经5000rpm离心5min后的上清作为LAMP反应的模板备用。

(2)LAMP扩增WSSV ORF 234，方法同实施例一。

(3)WSSV ORF 234的一步PCR检测WSSV：WSSV ORF 234一步PCR的两个引物序列分别是P1参见SEQ ID No.9(5′-CCG AAT TCA CCA TGG AGTATA TAG GGG-3′)、P2参见SEQ ID No.10(5′-CGA AGC TTG ATA CAG TGACCG TCC CTG-3′)。

25μL的一步PCR反应体系包括2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL MgCl₂(25mmol/L)，各为0.25μL的P1、P2，0.5μL的制备好的模板，0.5μL dNTPs(2.5mmol/L)，1U的Taq DNA聚合酶。反应条件为94℃预变性5min，接着进行35个循环：94℃变性50s，51℃退火1min，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min结束反应。

(4)WSSV ORF 234的巢式PCR检测WSSV：两个引物是上述一步PCR扩增片段内的两个区域引物PN1参见SEQ ID No.11(5′-GGG GTT GAA CATTAC GGG-3′)和PN2参见SEQ ID No.12(5′-GAT GAC GAG TGG CTTGCT-3′)。

取一步PCR产物1.0μL作为第二步PCR的模板，用PN1和PN2引物进行PCR扩增，反应液中除以PN1取代P1、PN2取代P2引物外，其它组份与第一步PCR相同；反应条件除以51℃退火30s替代第一步PCR中的51℃退火1min外，其余步骤相同。

(5)检测结果的观察：同实施例一。

结果表明用LAMP方法可以从稀释10¹²倍的模板中检测到WSSV。一步PCR扩增时，最低只能从稀释10⁴倍的模板中检测到WSSV。巢式PCR可以从稀释10⁸倍的模板中检测到WSSV，而模板被稀释10⁹倍后，巢式PCR也无法扩增出理论值为400bp左右的条带。

实施例四：

对比检测模板的制备：分别以健康克氏原螯虾及克氏原螯虾WSSV病虾按实施例三中的方法制备扩增模板，其中用健康虾制备的模板作为阴性对照。

LAMP扩增：阴性对照使用不稀释的模板进行扩增，以病虾制备的模板再分别稀释10、100、1000倍后用于LAMP扩增，其余同实施例一。

荧光直接显色观察：将LAMP扩增产物分别经十、百、千、万和十万倍梯度稀释后取25μL，加入0.5μL的100×SYBR Green I，室温静置5min后在紫外灯下观察它们是否有绿色荧光显示，得到图2；并以电泳验证结果。

LAMP结果的电泳观察验证：同实施例一，得到图3。

结果显示：当阴性对照模板在LAMP扩增后，经千倍以上稀释后，背景色消失。WSSV病虾以同样LAMP扩增后，经十万倍稀释后仍能发出明显的荧光(图2)，说明不经稀释由于存在背景，无法使用SYBR GREEN I显色后直接以肉眼判别结果，稀释可以消除干扰荧光，同时一定范围内的稀释不会影响到对LAMP阳性结果的准确判别。当使用经稀释的模板进行LAMP反应，之后反应液经千倍以上稀释，也同样可以准确显示结果。电泳结果同直接显色结果完全吻合(图3)。

实施例五：

对比检测模板的制备：分别以健康南美白对虾、南美白对虾WSSV病虾按实施例三中的方法制备扩增模板。

LAMP扩增：同实施例一。

LAMP扩增后加SYBR GREEN I显色：同实施例四。

LAMP结果的电泳观察验证：同实施例一。

结果显示：当阴性对照模板在LAMP扩增后，经千倍稀释后，背景色消失。WSSV病虾以同样LAMP扩增后，经十万倍稀释后仍能发出明显的荧光。说明将LAMP反应后的反应液经千倍或万倍稀释后，可以以荧光显色的结果准确判别对WSSV的检测结果。

实施例六：以缓冲液III通过快煮制备模板、LAMP扩增、直接显色早期检测人工感染克氏原螯虾WSSV；

人工感染病虾及对照虾：取自然感染WSSV的克氏原螯虾病虾，处死剪碎，取虾组织约1.0g，冰上充分研磨(以枪头不受阻为准)后，3000rpm，离心5min所得上清为注射健康虾所用病毒悬液；失活的病毒悬液是将上述病毒悬液在100℃煮5min后所得，并用于对照组。注射剂量为每头虾注射2.5μL。

取样：注射病毒悬液后4h、5h、6h、12h、18h及24h分别剪取人工感染虾的一小节附肢，按实施例三的方法制备扩增模板。对照虾以注射失活病毒悬液24h后，以同样方式取样。

LAMP扩增：同实施例一，得到图4。

LAMP扩增结果检测：将LAMP反应后稀释10000倍，取稀释液25μL加入0.5μL的100×SYBR Green I，室温静置5min后在紫外灯下观察它们是否有绿色荧光显示。同时以末稀释的LAMP反应液进行电泳(EB染色)，以通过经典方法予以验证。

一步PCR扩增及结果检测：以上述制备模板，以实施例三中一步PCR的方法进行扩增，PCR扩增产物通过电泳(EB染色)观察，得到图5。

结果显示：以LAMP扩增通过直接显色观察发现在感染后4h，尚无法检测到WSSV，但在感染了5h及以后，可以从人工感染虾中检测到WSSV。而对照虾结果没有绿色荧光出现，表明检测结果为阴性(图4)；以一步PCR则要在注射病毒悬液24h后才能检测到WSSV；LAMP扩增产物的电泳结果与直接荧光显色观察结果呈现完全一致(图5)。

<110>苏州大学

<120>虾白斑综合症病毒病核酸样品制备方法及虾白斑综合症病毒检测

方法

<160>12

<210>1

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

CGCATATTTC CCTCTATCGC TATTATTTTT TAGCACAGAT

TTTTTGAT 48

<210>2

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

GGTCTGAAAT ATACATGGGT GCCTTTTTGA AAATGGGGTT

TACGACAA 48

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

GGTAAAGGAA CGTTTTGTTG 20

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

GCAATGGGAA TGATAACTCT T 21

<210>5

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

CCAGTGCACT ATTCCCATTA GAAGGTTTTA CCACTCCCTT

CATTATTGTC 50

<210>6

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

CCTTTTGCCC CTTCAGCTGA TTTTCTGAGC CAGGTGTTCT G 41

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

TGTGGATGAT TATCCTGTGT T 21

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

TCTCTCTGGT GAACCCAT 18

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

CCGAATTCAC CATGGAGTAT ATAGGGG 27

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

CGAAGCTTGA TACAGTGACC GTCCCTG 27

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

GGGGTTGAAC ATTACGGG 18

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

GATGACGAGT GGCTTGCT 18