基于磁性碳纳米管和壳聚糖/二氧化硅凝胶的漆酶生物传感器及其制备方法和应用

具体实施方式

以下将结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1：

漆酶生物传感器及其制备

一种如图1、图2所示的本发明的基于磁性碳纳米管和壳聚糖/二氧化硅凝胶的漆酶生物传感器，包括一磁性碳糊电极1，磁性碳糊电极1的电极表面修饰有一磁性碳纳米管层2，磁性碳纳米管层2表面吸附有漆酶3，漆酶3外包裹有一壳聚糖-二氧化硅复合薄膜4。磁性碳糊电极1包括聚四氟乙烯管11、碳棒12、磁铁13(圆柱形，厚2mm，外径为6mm)和导线14，聚四氟乙烯管11包括管体111(高4.5cm，管体内径为8mm)和设于管体111上方的可旋转管帽112，可旋转管帽112通过一管颈113(高1cm，内径为4mm)与管体111连接，碳棒12置于聚四氟乙烯管11的腔体中，导线14连接于碳棒12的顶部并从管帽112的顶面引出，磁铁13紧邻碳棒12的底部，磁铁13下方的聚四氟乙烯管11腔体中还填充有质量比为1∶3的石墨和石蜡混合物5，石墨和石蜡混合物5表面经打磨、抛光、清洗后即作为磁性碳糊电极1的电极表面。

本实施例的基于磁性碳纳米管和壳聚糖/二氧化硅凝胶的漆酶生物传感器的制备方法，包括下列步骤：

(1)材料准备

a、准备磁性碳糊电极1：首先用聚四氟乙烯材料打磨得到上述形状和尺寸的聚四氟乙烯管11，然后在管中放置一根来自废旧1号电池的碳棒12，导线14连接于碳棒12的一端(缠绕在碳棒12的顶端)并从管帽112顶面引出；然后在聚四氟乙烯管11中碳棒12的另一端放置一块来自废旧耳机的圆柱形磁铁13(直径为6mm，厚度为2mm)，最后在磁铁13外侧填充石墨和石蜡混合物5，该石墨和石蜡混合物5是由质量比为1∶3的石蜡和石墨混合加热而成；完成前述步骤后将该电极在室温下放置2～3天，使用前先打磨和超声清洗；

b、准备壳聚糖/二氧化硅凝胶液：用醋酸溶液超声溶解0.5％的壳聚糖，然后在4℃条件下放置一段时间，待其气泡消失后，将15μL正硅酸乙酯、60μL乙醇与450μL的壳聚糖醋酸溶液依次混合，超声30min，然后放置2h，充分反应后用1mol·L^-1的氢氧化钠调节pH为7.0～7.2；

c、制备磁性碳纳米管溶液：首先，配制0.5m mol·L^-1的甲苯胺蓝溶液；称取0.12g普通的多壁碳纳米管加入到60mL甲苯胺蓝溶液中，在室温下超声1h，然后经0.3μm的多孔滤膜过滤，用去离子水(或蒸馏水)清洗至颜色不再发生变化后，冷冻干燥备用；然后按照Fe³⁺∶Fe²⁺＝2∶1的摩尔比例称取0.433m mol L^-1的硫酸亚铁铵和0.866m mol L^-1的硫酸铁铵溶于20mL充氮气的水中；加入前述备用的多壁碳纳米管0.1g使碳纳米管、硫酸亚铁铵和硫酸铁胺的质量比在(8～12)∶17∶(25～30)的范围内，在超声条件下，缓慢滴加8mol·L^-1充过氮气的氨水使铁的氧化物沉淀下来，超声时长为10min，并将混合溶液的pH值保持在11左右；超声完毕后，再将得到的混合溶液转移到三口烧瓶中，在50℃恒温水浴条件下，进行300r·min^-1的磁力搅拌，0.5～1h后放置于室温条件下冷却，反应完成后用磁铁将生成的磁性碳纳米管复合物从悬浮液中分离出来，用蒸馏水清洗至中性附近，真空干燥后，在4℃条件下保存备用；

d、配制适量的10mg·mL^-1的漆酶溶液。

(2)修饰磁性碳纳米管

a、预处理：用0.5μm Al₂O₃粉末对准备的磁性碳糊电极1的电极表面进行抛光，直至其表面光洁，然后用水冲洗电极表面，再依次用体积比为1∶1的HNO₃水溶液、丙酮水溶液超声清洗电极，最后再用磷酸缓冲液冲洗，将其自然晾干备用；

b、修饰磁性碳纳米管：向预处理后的磁性碳糊电极1上滴加5mg·mL^-1的磁性碳纳米管溶液40μL，使其均匀的分布在电极表面，自然干燥后在磁性碳糊电极1上形成一磁性碳纳米管层2。

(3)吸附漆酶

在步骤(2)得到的磁性碳纳米管层2上滴加10mg·mL^-1的漆酶溶液20μL(漆酶溶液由pH＝5.6的0.667mol·L^-1的PBS配制而成)，待其表面水分蒸发后待用。

(4)包裹漆酶

步骤(3)完成后，在吸附有漆酶3的磁性碳纳米管层2上滴加20μL上述准备好的壳聚糖/二氧化硅凝胶液，放置约0.5h后形成一壳聚糖-二氧化硅复合薄膜4，制得基于磁性碳纳米管和壳聚糖/二氧化硅凝胶的漆酶生物传感器；将该漆酶生物传感器保存于4℃条件下备用。

本发明的漆酶生物传感器制备过程中，用扫描电镜和振动样品磁强计来表征磁性碳纳米管的微观结构和磁性大小，结果如图4所示。图3为甲苯胺蓝处理过的水溶性碳纳米管的扫描电镜图，图4为本发明的磁性碳纳米管的扫描电镜图，对比图3和图4可知，经过甲苯胺蓝处理的碳纳米管的变化不明显，在电镜扫描中不能显示出来，这是因为甲苯胺蓝只是作为一种小分子反应物通过π-π电子堆积和范德华力与碳纳米管反应，增加碳纳米管的水溶性；而作为引起碳纳米管磁性的铁氧磁性纳米粒子，可以从图4中看到其沉积在碳纳米管表面(如图4中箭头所示)。振动样品磁强计(VSM)定量证实了铁氧磁性纳米粒子的生成，结果如图5所示，由图5可见，本发明的磁性碳纳米管表现为典型的软磁性材料的磁滞回线图，经过Original7.5分析，该铁氧磁性纳米粒子的磁性强度为30.07emu·g^-1。本发明制备的磁性碳纳米管能够通过顺磁性修饰在磁性碳糊电极1表面，由于碳纳米管本身还具有吸附蛋白质的特性，因此本发明的磁性碳纳米管还能起到增强漆酶3吸附牢固性的作用。

用循环伏安法分别表征磁性碳糊电极1(即裸电极)、磁性碳纳米管修饰的电极和本发明的漆酶生物传感器(即工作电极)，其结果如图6所示，其中Col 1、Col 2、Col 3分别表示裸电极、磁性碳纳米管修饰的电极和工作电极。由图6可见，Col 1类似于一条直线，说明普通的磁性碳糊电极1传导电子的能力很弱；而经过磁性碳纳米管修饰的电极如图中Col 2所示，其电子传递速度大大提高，这说明磁性碳纳米管大大增强了电子传递能力；而固定漆酶3后的生物传感器工作电极的电子传导速度介于以上两者之间，如图中Col 3所示，其主要原因是壳聚糖-二氧化硅复合薄膜的包裹以及漆酶3的吸附在一定程度上阻碍了电子的快速传递，但相对磁性碳糊电极1本身，本发明漆酶生物传感器传递电子的速度还是得到了很大提高，应用时能显著提高工作电极和电解液间电子的转移速度，快速获得稳定的响应电流。

本实施例的漆酶生物传感器不仅使用寿命长、漆酶活性高，而且制备方法的成本低廉、工艺简单、制作快速，漆酶不经过任何化学修饰而是借助吸附法和包埋法固定到电极表面，使漆酶的固定更稳固，并能维持漆酶的高活性。

本发明的固定方法也能用于与漆酶具有近似性质的其他生物有机成分的生物传感器的构建。

实施例2：

漆酶生物传感器的应用

以本发明实施例1的基于磁性碳纳米管和壳聚糖/二氧化硅凝胶的漆酶生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，建立三电极系统，将三电极系统与电化学工作站连接，对待测液体中的邻苯二酚浓度进行检测。

工作条件：所用的电解液为0.056mol L^-1的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，工作电位为-0.052V。在pH＝4.0～6.8范围内测定漆酶生物传感器对同一浓度邻苯二酚的电流响应值，选定pH＝5.6为最佳pH值，因为在此pH值下，其响应电流大且稳定。根据在不同电位下对同一浓度邻苯二酚的响应，选定-0.052V为最佳工作电位。

检测原理：漆酶催化氧化邻苯二酚成苯醌，苯醌在电极上得到电子，又被还原成邻苯二酚，通过检测还原电流的大小来定量指示待测液中邻苯二酚的浓度。

采用计时电流法测定邻苯二酚浓度，测量池中加入30mL的PBS电解液，里面放置一个磁力搅拌子，每测定一次后，用PBS清洗电极三次，再用于下一次测定，检测结果如图7所示，邻苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为：I＝0.2791×C+0.2574，相关系数r²＝0.998，该漆酶生物传感器检测线性范围为1×10^-7～0.33×10^-4 mol·L^-1，检测下限为3.34×10^-8mol·L^-1，其中I为电流变化值，单位为μA，C是邻苯二酚的浓度，单位为μM。

检测中，每次达到稳定电流的响应时间不超过60s，这主要是本发明漆酶生物传感器上磁性碳纳米管层2作用的效果，因为磁性碳纳米管具有卓越的电子传导能力，使得每次达到稳定响应电流的时间很短。磁性碳纳米管和壳聚糖-二氧化硅复合薄膜提供了一个微环境用于漆酶3的固定，磁性碳纳米管具有良好的吸附性和无毒性，壳聚糖具有优良的生物兼容性，这些都利于漆酶3活性的保持，对于邻苯二酚的氧化反应能起到良好的催化效果。

将该漆酶生物传感器用于实际水样样品的检测：

如表1所示，该表中原水取自湘江橘子洲大桥段，C₁为原水过滤后测定的邻苯二酚的浓度(均为0)，经过过滤后加入确定浓度的邻苯二酚，制成A、B、C、D四个水样，四个水样的配制浓度如C₂栏所示，而C₃栏为本发明漆酶生物传感器按照本实施例的检测方法和检测条件测定的浓度值。从加标回收率可以看出，本发明的漆酶生物传感器在可测定的浓度范围内，加标回收率基本在96％～102％之间，测定结果理想，相比传统的高效液相色谱法，本发明的检测方法操作简单，且不受样品中浊度和光干扰物质的影响。

表1漆酶生物传感器检测水中的邻苯二酚

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，如将漆酶3换成其他的生物有机成分等，与本发明构思无实质性差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。