肝干细胞的选择培养基、选择性分离并扩增肝干细胞的方法及用于治疗糖尿病的药物组合物

技术领域

本发明涉及一种干细胞的选择培养基，使用该培养基选择性分离并扩增干细胞的方法，以及包括前述方法获得的干细胞的用于治疗糖尿病的药物组合物。更具体地，本发明涉及一种肝干细胞的选择培养基，使用该培养基选择性分离并扩增肝干细胞的方法，以及包括前述方法获得的肝干细胞的用于治疗糖尿病的药物组合物。

背景技术

现有的分离和扩增肝干细胞的方法操作繁复、成本高，分离得到的肝干细胞纯度低、扩增效率低、容易分化变性，并且在分离和扩增过程使用的培养基中含有很多对人体有害的药物，使分离和扩增得到的肝干细胞在制备成药物组合物时安全性差。

例如，CN 1611599A公开的由人脐带血和大鼠骨髓分离干细胞使用了免疫磁珠标记技术，经高梯度磁场分选，才能完成干细胞的分离，其所分离干细胞是多种干细胞的混合物，并且其分离干细胞的目的是诱导该干细胞中的肝干细胞分化为肝细胞。

US 6129911公开了从肝组织中分离肝干细胞的方法，该方法不仅需要大量的肝组织，而且必须使用磁珠(Dynabead)剔除鼠胆管特异性细胞和间皮细胞，并且需要分选磁珠(magnetic bead)来富集肝干细胞，并且富集所得的细胞群(cell cluster)中还含有肝细胞。

综上，亟需一种操作简单、成本低、分离纯度高、扩增效率高且传代细胞性质稳定的安全的分离和扩增肝干细胞的方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有的分离和扩增肝干细胞的方法操作繁复、成本高，分离得到的肝干细胞纯度低、扩增效率低、容易分化变性，并且在分离和扩增过程使用的培养基中含有很多对人体有害的药物，使分离和扩增得到的肝干细胞在制备成药物组合物时安全性差的缺点，提供一种肝干细胞的选择培养基，使用该培养基的分离和扩增肝干细胞的方法操作简单、成本低、分离纯度高、扩增效率高且传代细胞性质稳定。

本发明提供了一种肝干细胞的选择培养基，所述选择培养基包括液体基础培养基，其中，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述选择培养基还含有1-20体积％的胎牛血清、5-100ng/mL的人表皮生长因子和5-100ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。

本发明还提供了一种从离体组织中选择性分离并扩增肝干细胞的方法，其中，所述方法使用本发明所述的选择培养基培养所述离体组织。

本发明还提供了一种用于治疗糖尿病的药物组合物，其中，所述药物组合物包括本发明所述从离体组织中选择性分离并扩增肝干细胞的方法获得的肝干细胞，以及和药学上可接受的载体或赋形剂。

使用本发明的选择培养基的本发明的从离体组织中选择性分离并扩增肝干细胞的方法，能够高效分离和大量扩增肝干细胞，并且经10代传代扩增的肝干细胞仍然保持与原代肝干细胞相同的性状。由于本发明的选择培养基选择性强，原代培养得到的肝干细胞纯度即可达到90％以上，传代培养得到的肝干细胞纯度可达到95％以上，随传代代数增加所得肝干细胞的纯度可以达99％以上，甚至接近100％。因此，本发明的方法无需使用磁珠等高成本安全性差的药物就能达到更高纯度的分离效果，避免了繁复的操作，因而降低了成本，并且由该方法得到的肝干细胞的安全性大大提高，可以制备成本发明用于治疗糖尿病的药物组合物。本发明用于治疗糖尿病的药物组合物不仅安全性好，而且能在体内修复糖尿病中损伤的胰岛β细胞，并消除胰岛素抵抗，从而为克服糖尿病依赖胰岛素治疗，甚至根治糖尿病提供了可能。

附图说明

图1为实施例1分离并传代的肝干细胞生长形态照片(光学显微镜放大倍数40倍)；

图2为实施例4的中间品肝干细胞表达蛋白的荧光免疫照片(荧光显微镜放大倍数40倍)，其中，图2A为4，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸(DAPI)染色荧光免疫照片，图2B为鼠抗人血清甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)标记后二抗显色荧光免疫照片，图2C为图2A和图2B叠加得到的荧光免疫照片；

图3为实施例4的中间品肝干细胞表达蛋白的荧光免疫照片(荧光显微镜放大倍数40倍)，其中，图3D为4，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸(DAPI)染色荧光免疫照片，图3E为鼠抗人细胞角蛋白19(Cytokeratin-19，CK19)标记后二抗显色荧光免疫照片，图3F为图3D和图3E叠加得到的荧光免疫照片；

图4为鼠抗人巢蛋白(Nestin)二抗显色的实施例4的中间品肝干细胞表达蛋白的荧光免疫照片(荧光显微镜放大倍数40倍)；

图5为使用实施例4中间品肝干细胞药物组合物对糖尿病动物模型治疗前后效果对比的显微结构照片(光学显微镜放大倍数40倍)；

图6为使用自体肝干细胞制备的药物组合物的糖尿病患者胰岛素用量变化曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种肝干细胞的选择培养基，所述选择培养基包括液体基础培养基，其中，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述选择培养基还含有1-20体积％的胎牛血清、5-100ng/mL的人表皮生长因子(epidermal growthfactor，EGF)和5-100ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor，bEGF)。

优选地，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述选择培养基还含有5-15体积％的胎牛血清、10-50ng/mL的人表皮生长因子和10-50ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。进一步优选地，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述选择培养基还含有5-10体积％的胎牛血清、30-50ng/mL的人表皮生长因子和30-50ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。

更优选地，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述选择培养基还含有5-15μg/mL、更优选8-12μg/mL的胰岛素。在离体组织中肝干细胞的原代培养中所述选择培养基使用胰岛素有利于保持甚至改善被分离肝干细胞的活力。不过，在传代培养中可以不用胰岛素，也能保持被分离的肝干细胞的活力。

本发明的肝干细胞的选择培养基可以包括本领域常用的各种基本培养基，例如，选自BME细胞培养基、杜尔贝可改良伊格尔(Dulbecco’s modified Eagle’smedium，DMEM)细胞培养基、DMEM/F12细胞培养基、Fischer′s细胞培养基、IMDM细胞培养基、199细胞培养基、MEM细胞培养基、F10细胞培养基、F12细胞培养基和1640细胞培养基中的一种或几种。优选包括的所述基本培养基为重量比1∶1的F12细胞培养基和DMEM细胞培养基。所述基本培养基的成分为本领域公知，上述列举的基本培养基名称为它们的商品名，商业上可供。

本发明还提供了一种从离体组织中选择性分离并扩增肝干细胞的方法，其中，所述方法使用本发明所述的选择培养基培养所述离体组织。

本发明提供的从离体组织中选择性分离并扩增肝干细胞的方法可以适用于各种含有肝干细胞的离体组织。肝干细胞属于具有一定分化程度的成体多能干细胞。理论上讲，任何含有肝干细胞的离体组织都可以应用本发明的方法分离到肝干细胞，例如骨髓、脐带血、脐带、流产胚胎(例如流产的12-14周的胚胎)和流产胎儿等。但考虑到可能有悖于伦理道德、社会风俗习惯甚至法律规定，因此一般不利用流产胚胎和流产胎儿，并且胚胎和流产胎儿的来源有限。优选所述离体组织选自骨髓、脐带血和脐带中的一种或几种。其中，骨髓和脐带血可以来自公共脐带血库(例如，北京脐带血库等)和骨髓库(例如，中华骨髓库等)。从来源丰富程度考虑，优选所述离体组织是脐带，其一般作为医疗废弃物被处理掉。此外，糖尿病患者的骨髓可以作为自体肝干细胞的来源，可以避免免疫排斥反应。本发明的发明人意外地发现，即使是I型糖尿患者，其肝干细胞也是正常的，使用其自体离体组织获得的肝干细胞能治愈其I型糖尿病(参见实施例6)。

本发明所述肝干细胞培养体系(原代培养体系或传代培养体系)包括1×10⁵至1×10⁶个、优选1×10⁵个肝干细胞和1mL-100mL、优选30-80mL的本发明肝干细胞选择培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。由离体组织直接培养获得的是原代肝干细胞，由该原代肝干细胞传代扩增得到传代肝干细胞。使用本发明的选择培养基的本发明的方法，经10代传代扩增的肝干细胞仍然保持与原代肝干细胞相同的性状。例如，无论是原代培养得到的肝干细胞还是传代次数第1-9次传代培养得到的肝干细胞它们的DAPI、CK19、AFP、Nestin抗体表达均为阳性，白蛋白(albumin，ALB)抗体表达均为阴性。按照这个检测肝干细胞是否分化变性的标准判断，本发明的方法得到的肝干细胞可以保证在传代次数达第15代时都不发生分化变性。出于安全的保守考虑，优选使用传代代数为第1代到第10代的肝干细胞，其中，本发明的方法得到的传代代数第1代到第4代的肝干细胞可以作为种子肝干细胞使用。出于肝干细胞数量和稳定性的考虑，优选传代代数为第4代的肝干细胞作为种子肝干细胞使用。所述种子干细胞可以作为大规模培养的起始细胞，也可以采用本领域常规的冷冻保存细胞的技术将其作为细胞株长期冷冻保存起来，以备复苏使用。本发明的方法得到的传代代数第5代到第10代肝干细胞可以作为中间品肝干细胞使用。所述中间品干细胞是指大规模培养后得到的肝干细胞，可以用作制备本发明药物组合物的原料。此外，为了便于运输和保存，所述中间品干细胞也可以进行冷冻保存，在临近使用前复苏即可。

本发明还提供了一种用于治疗糖尿病的药物组合物，其中，所述药物组合物包括本发明所述从离体组织中选择性分离并扩增肝干细胞的方法获得的肝干细胞，以及和药学上可接受的载体或赋形剂。

所述药学上可接受的载体或赋形剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料，例如，包括但不限于盐水、缓冲盐液、葡萄糖(糖尿病人慎用)、水、甘油、乙醇及其混合物。所述药物组合物适于胃肠外、舌下、脑池内、阴道内、腹膜内、直肠内、颊内给药。

胃肠外给药包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下、关节内注射和输注。适于胃肠外给药的药物组合物包括无菌水浴液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在临近使用前在无菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。适宜的水性或非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、甘泊、丙二醇、聚乙二醇、竣甲基纤维素、植物油和可注射的有机酶如泊酸乙醋。

这些组合物还可以含有防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂等佐剂。加入等渗剂如糖类、氯化钠等可能是有利的。

优选所述药物组合物为注射液，所述注射液包括药学上可接受的载体，以及以所述注射液体积为基准，1×10⁵至1×10⁸个/毫升的本发明所述的方法获得的肝干细胞。优选所述注射液包括以所述注射液体积为基准，5×10⁵至1×10⁷个/毫升的本发明所述的方法获得的肝干细胞。优选所述药学上可接受的载体为生理盐水。这里所述的生理盐水，是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的溶液。优选地，用于哺乳类动物和人体时是0.85-0.9％的氯化钠溶液。更优选0.9％的氯化钠溶液。

本发明的发明人意外地发现，肝干细胞可以对胰岛素分泌细胞(例如胰岛β细胞等)进行修复，并且能够有效作用于胰岛素抵抗(参见实施例7)。因此本发明用于治疗糖尿病的药物组合物中提及的糖尿病选自I型糖尿病、II型糖尿病和胰岛素抵抗中的一种或几种。所述胰岛素抵抗是指胰岛素执行其正常生物作用的效应不足，表现为外周组织尤其是肌肉、脂肪组织对葡萄糖的利用障碍。

使用由本发明的方法获得的肝干细胞，处于本发明的选择培养基中，因此在制备用于治疗糖尿病的药物组合物之前，可以通过除去本发明的选择培养基，用生理盐水洗涤并重悬所述肝干细胞。所述生理盐水的洗涤次数可以通过测定洗出液中残留的培养基组分来决定。将本发明的用于治疗糖尿病的药物组合物在注射给患者时残留的培养基组分不会引起患者不适即可。所述组合物包括1×10⁵到1×10⁸个/mL本发明的新的肝干细胞；优选为5×10⁵到1×10⁷个/mL。本发明还提供了本发明的方法获得的肝干细胞在制备治疗糖尿病药物中的应用，优选地，本发明提供了本发明的方法获得的肝干细胞在制备治疗胰岛素抵抗药物中的应用。

本发明还提供了一种治疗糖尿病的方法，其包括给患者施用本发明用于治疗糖尿病的药物组合物。

施用本发明用于治疗糖尿病的药物组合物的方式可以选自介入注射、静脉注射、皮下注射和皮内注射中的一种或几种；更优选所述施用的方式为胰动脉介入注射。本发明所述用于治疗糖尿病的药物组合物优选含有1×10⁵到1×10⁸细胞/mL的肝干细胞，其每次注射给药量为0.1mL-5mL/个体；更优选地，本发明所述用于治疗糖尿病的药物组合物包括1×10⁵到5×10⁷个/mL的肝干细胞，其每次注射给药量为0.1mL-2mL/个体。

以上个给出了本发明所述用于治疗糖尿病的药物组合物每一次注射的剂量，一个疗程三次注射，每两次注射间隔一周。本发明所述用于治疗糖尿病的药物组合物一般在注射完第二次后的第三天到第七天起效。所述有效的标准是：空腹血糖降低至正常范围(5-7mmol/L)内且胰岛素注射用量减少，可以每日监测患者胰岛素注射用量，以减少或停止为目标。一个疗程结束后，可以马上连续进行第二个疗程的治疗，也可以间隔一到三个月后进行第二个疗程的治疗以巩固疗效，一般治疗两个至四个疗程可以消除糖尿病病症；间隔时间为六个月或一年，患者如认为有必要，还可进行巩固疗效的治疗。

优选使用本发明的方法来分离糖尿病患者的离体组织(例如骨髓)，所得肝干细胞制备成本发明的药物组合物给药糖尿病患者自体，这样可以最大限度地避免免疫排斥反应造成的副作用。

以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。

实施例1：

本实施例用于说明使用本发明的选择培养基从离体组织脐带中分离肝干细胞的方法。

脐带来自25岁健康孕妇分娩后采集的脐带。与该孕妇及医院方签署了知情同意书，在其分娩后收集其脐带。

将离体组织脐带用眼科剪剪碎成为约1mm3的小块。所得剪碎的组织小块用0.25％胰酶溶液以1克∶0.5mL的重量体积比消化5分钟后，加入是胰酶溶液体积五分之一的胎牛血清(美国Hyclone公司)终止消化，以1000rpm离心5分钟收集消化好的组织小块，倾去胰酶溶液上清，然后0.01％DNAse(DNA酶，上海生工)的HBSS(汉斯缓冲液，上海生工)以1克∶1mL的重量体积比洗涤三次，所得离心沉淀用0.25％胰酶溶液以1克∶1mL的体积比在37℃下混匀接触10分钟，然后在1000rpm下离心5min收集细胞，用以1克∶1mL的重量体积比用杜尔贝可改良伊格尔-F12(DMEM/F12)培养基重悬。所得重悬液用40-mm分子筛(美国BD公司)过滤。用所述孔径的分子筛过滤，截留的是大片细胞碎片和未被消化的细胞团，滤出的是细胞悬液。

收集所述细胞悬液，向其中加入含有10％胎牛血清、30ng/mL人表皮生长因子(EGF)、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bEGF)和10μg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12(DMEM/F12)培养基(美国Hyclone公司)使细胞悬液浓度被稀释为2×10⁵细胞/mL。然后将每5mL所得稀释的细胞悬液转移至25cm²灭菌塑料培养瓶中在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

如图1所示，培养所得原代细胞呈贴壁生长，细胞形态规则统一，与肝干细胞的细胞形态一致。倾去培养基，然后用5mL HBSS洗涤一次，倾去洗涤液。所述洗涤过程去掉了残余的悬浮的细胞碎片和未贴壁生长的细胞。然后添加新鲜的含有9％胎牛血清、32ng/mL人表皮生长因子、25ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和10μg/mL胰岛素的DMEM/F12培养基。当细胞生长达到培养瓶底面的90％时，用阿尤替酶(Accutase)消化后，用含有12％胎牛血清和35ng/mL人表皮生长因子、35ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基进行传代培养。1瓶原代培养物可以传代三瓶，每瓶起始培养的细胞密度为2×10⁵细胞/mL。三瓶25cm²培养瓶在37℃、5％CO₂培养箱中培养6天后，得到贴壁并且生长达到培养瓶底面的90％的细胞。

取其中一瓶细胞，倾去培养基，按前述条件经胰酶消化，800rpm离心5分钟后，收集细胞沉淀用1mL 1×PBS(pH 7.4的磷酸缓冲液)重悬，计数。取6份50μL(每份含1×10⁶个细胞)上述的传代得到细胞悬液分别接种在六孔培养板的六个孔中贴壁生长4小时，吸出培养基后用1×PBS洗涤一次，加入2％甲醛固定3分钟，用0.5％曲通100(Triton-100)1×PBS洗涤三次，再向六孔板的六个孔中分别加入1×PBS以及用1×PBS稀释的DAPI、1×PBS稀释的鼠抗人ALB单抗、1×PBS稀释的鼠抗人CK19单抗、1×PBS稀释的鼠抗人AFP单抗、1×PBS稀释的鼠抗人Nestin单抗。在4度冰箱过夜进行染色/结合，之后用0.5％ Triton-100 1×PBS洗涤3次，向鼠抗人ALB单抗的孔中加入用1×PBS稀释的二抗IgG1-FITC，并向鼠抗人CK19单抗、鼠抗人AFP单抗、鼠抗人Nestin单抗的孔中加入用1×PBS稀释的二抗IgG1-PE，在37度下孵育1h，孵育后用1×PBS轻轻洗涤3次，洗涤完之后用90％甘油封闭。荧光显微镜下观测，结果显示，90％以上的细胞呈现DAPI、CK19、AFP和Nestin为阳性，ALB为阴性，符合肝干细胞的特异性特征，因而证明使用本发明的选择培养基从离体组织脐带中能够高效分离出高纯度的肝干细胞。

实施例2：

本实施例用于说明使用本发明的选择培养基从离体组织脐带血中分离肝干细胞的方法。

脐带血来自25岁健康孕妇分娩后采集的脐带血。与该孕妇及医院方签署了知情同意书，在其分娩后采集其脐带血。

将离体组织脐带血用1×PBS等体积稀释，得到脐带血稀释液，以脐带血稀释液：1.077千克/立方米的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)的体积比为2∶1加入到50ml离心管中，在1500rpm、25度下进行密度梯度离心10分钟，离心后收集中间层细胞，并使用1×PBS 1000rpm离心10分钟，洗涤所得细胞三次，加入完全培养基，含10％胎牛血清、30ng/mL人表皮生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和10μg/mL胰岛素的DMEM/F12培养基(选择培养基)。细胞计数后，按3×10⁵细胞/cm²的密度接种于75cm²的培养瓶中，每瓶再加入上述选择培养基使终体积为10ml。在37℃、5％CO₂的培养箱中培养第三天后，半量换液。换液时将旧培养基缓慢吸出5ml，加入新鲜的选择培养基，每瓶加入5ml，继续在37℃、5％CO₂培养。当细胞贴壁生长达到培养瓶底面的85％时，将培养基倾去，并将细胞通过用胰酶消化，800rpm离心5分钟收集后在含10％胎牛血清、30ng/mL人表皮生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和10μg/mL胰岛素的DMEM/F12培养基中传代培养。同样当细胞贴壁生长达到培养瓶底面的85％时，进行消化传代培养。1瓶原代培养物可以传代三瓶，每瓶起始培养的细胞密度为2×10⁵细胞/mL。三瓶75cm²培养瓶在37℃、5％CO₂培养箱中培养6天后，得到贴壁并且生长达到培养瓶底面的90％的细胞。

取其中一瓶细胞，倾去培养基，按前述条件经胰酶消化，800rpm离心5分钟后，收集细胞沉淀用1mL 1×PBS(pH 7.4的磷酸缓冲液)重悬，计数。取6份50μL(每份含1×10⁶个细胞)上述的传代得到细胞悬液分别接种在六孔培养板的六个孔中贴壁生长4小时，吸出培养基后用1×PBS洗涤一次，加入2％甲醛固定3分钟，用0.5％曲通100(Triton-100)1×PBS洗涤三次，再向六孔板的六个孔中分别加入1×PBS以及用1×PBS稀释的DAPI、1×PBS稀释的鼠抗人ALB单抗、1×PBS稀释的鼠抗人CK19单抗、1×PBS稀释的鼠抗人AFP单抗、1×PBS稀释的鼠抗人Nestin单抗。在4度冰箱过夜进行染色/结合，之后用0.5％ Triton-100 1×PBS洗涤3次，向鼠抗人ALB单抗的孔中加入用1×PBS稀释的二抗IgG1-FITC，并向鼠抗人CK19单抗、鼠抗人AFP单抗、鼠抗人Nestin单抗的孔中加入用1×PBS稀释的二抗IgG1-PE，在37度下孵育1h，孵育后用1×PBS轻轻洗涤3次，洗涤完之后用90％甘油封闭。荧光显微镜下观测，结果显示，90％以上的细胞呈现DAPI、CK19、AFP和Nestin为阳性，ALB为阴性，符合肝干细胞的特异性特征，因而证明使用本发明的选择培养基从离体组织脐带血中能够高效分离出高纯度的肝干细胞。

实施例3

本实施例用于说明使用本发明的选择培养基对于种子肝干细胞体外传代扩增培养的方法，以及所得种子肝干细胞冷冻保存的方法。

取实施例1中得到的传代代数为第1代的肝干细胞，当肝干细胞贴壁生长达到培养瓶底面的达到90％时，将细胞通过用胰酶消化，800rpm离心5分钟收集后在含表皮生长因子为50ng/ml，碱性表皮生长因子为40ng/ml，以及含胎牛血清10％的DMEM/F12(1∶1)培养基中传代培养。同样肝干细胞贴壁生长达到培养瓶底面的达到90％时，重复上述传代培养过程。当肝干细胞扩增到培养代数第4代时，将1瓶肝干细胞用胰酶消化，800rpm离心5分钟收集得到肝干细胞沉淀，用胎牛血清重悬该肝干细胞沉淀，显微镜下计数使肝干细胞悬液的浓度达到8×10⁶/ml。应用二甲基亚砜(DMSO，Sigma)和胎牛血清先配制成含20％DMSO的胎牛血清，后加入上述重悬液中使得DMSO浓度为10％并调整肝干细胞浓度为4×10⁶/ml。将每1ml所得肝干细胞悬液分装到2ml冻存管中，放置程序降温盒(美国Nalgene公司)中按照使用说明书，先在-80度冰箱保存2天后，转至液氮中冻存。

取1瓶传代代数为第4代的肝干细胞，经胰酶消化，800rpm离心5分钟后细胞沉淀用1mL 1×PBS重悬，计数。取6份50μL(每份含1×10⁶个细胞)上述的传代得到细胞悬液分别接种在六孔培养板的六个孔中贴壁生长4小时，吸出培养基后用1×PBS洗涤一次，加入2％甲醛固定3分钟，用0.5％曲通100(Triton-100)1×PBS洗涤三次，再向六孔板的六个孔中分别加入1×PBS以及用1×PBS稀释的DAPI、1×PBS稀释的鼠抗人ALB单抗、1×PBS稀释的鼠抗人CK19单抗、1×PBS稀释的鼠抗人AFP单抗、1×PBS稀释的鼠抗人Nestin单抗。在4度冰箱过夜进行染色/结合，之后用0.5％ Triton-100 1×PBS洗涤3次，向鼠抗人ALB单抗的孔中加入用1×PBS稀释的二抗IgG1-FITC，并向鼠抗人CK19单抗、鼠抗人AFP单抗、鼠抗人Nestin单抗的孔中加入用1×PBS稀释的二抗IgG1-PE，在37度下孵育1h，孵育后用1×PBS轻轻洗涤3次，洗涤完之后用90％甘油封闭。荧光显微镜下观测，结果显示，95％以上的细胞呈现DAPI、CK19、AFP和Nestin为阳性，ALB为阴性，符合肝干细胞的特异性特征，因而证明使用本发明的选择培养基传代培养的肝干细胞未出现分化变性的现象，保持了原代肝干细胞的细胞性状。

实施例4

本实施例用于说明使用本发明的选择培养基对于中间品肝干细胞体外传代扩增培养的方法，以及所得中间品肝干细胞冷冻保存以便运输的方法。

取1支实施例3的种子肝干细胞复苏，在37度-40度水浴锅中充分融化，将融化的细胞液体加入到9ml 1×PBS中混匀，800rpm下离心5min后收集细胞沉淀。在含表皮生长因子为50ng/ml，碱性表皮生长因子为40ng/ml，以及含胎牛血清10％的DMEM/F12(1∶1)培养基中在75cm²培养瓶内传代培养。同样肝干细胞贴壁生长达到培养瓶底面的达到90％时，重复上述传代培养过程。当肝干细胞扩增到培养代数第9代时，将1瓶肝干细胞用胰酶消化，800rpm离心5分钟收集得到肝干细胞沉淀，用胎牛血清重悬该肝干细胞沉淀，显微镜下计数使肝干细胞悬液的浓度达到8×10⁶/ml。应用二甲基亚砜(DMSO，Sigma)和胎牛血清先配制成含20％DMSO的胎牛血清，后加入上述重悬液中使得DMSO浓度为10％并调整肝干细胞浓度为4×10⁶/ml。将每1ml所得肝干细胞悬液分装到2ml冻存管中，放置程序降温盒(美国Nalgene公司)中按照使用说明书，先在-80度冰箱保存2天后，转至液氮中冻存。冻存的肝干细胞有利于保存和运输。

取1瓶培养到第9代的肝干细胞，经胰酶消化，800rpm离心5分钟后细胞沉淀用1mL 1×PBS重悬，计数。用实施例3所述的检测方法，荧光显微镜下观测，结果显示，95％以上的细胞呈现DAPI、CK19、AFP和Nestin为阳性，ALB为阴性，符合肝干细胞的特异性特征，因而证明使用本发明的选择培养基传代培养的肝干细胞未出现分化变性的现象，保持了原代肝干细胞的细胞性状。其中，图4显示了中间品肝干细胞进行Nestin免疫荧光检测表型检测结果，在一个视野下95％以上的细胞发出荧光呈现阳性。

此外，为了更清楚地显示本发明的效果，申请人还将第9代的肝干细胞按照实施例3的方法在六孔培养板中培养，所不同的是其中一孔同时添加了DAPI和鼠抗人血清甲胎蛋白(AFP)，图2显示了该中间品肝干细胞表达蛋白的荧光免疫照片，其中，图2A为4，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸(DAPI)染色荧光免疫照片(蓝色荧光)，图2B为鼠抗人血清甲胎蛋白(AFP)标记后二抗显色荧光免疫照片(绿色荧光)，图2C为图2A和图2B叠加得到的荧光免疫照片。另外一孔同时添加了DAPI和鼠抗人细胞角蛋白19，图3显示了中间品肝干细胞表达蛋白的荧光免疫照片，其中，图3D为4，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸(DAPI)染色荧光免疫照片(蓝色荧光)，图3E为鼠抗人细胞角蛋白19(CK19)标记后二抗显色荧光免疫照片(红色荧光)，图3F为图3D和图3E叠加得到的荧光免疫照片。

为了说明本发明的方法扩增肝干细胞的高效性，在下表1中统计了按照实施例1、3和4平行三次原代和传代培养得到的扩增情况数据。

表1

实施例5：

本实施例说明含有本发明方法获得的肝干细胞的用于治疗糖尿病的药物组合物在糖尿病动物模型中应用。

取实施例4所得的传代代数为第9代的肝干细胞培养物含有1×10⁶肝干细胞。800rpm下离心5min后收集肝干细胞的细胞沉淀，用0.9％的氯化钠溶液洗涤3次，然后用该0.9％的氯化钠溶液重悬至2×10⁶个/mL的浓度，于4℃下保存备用。按照与实施例3和4同样的方法传代扩增实施例2所得的肝干细胞，制备脐带血来源的2×10⁶个/mL浓度的肝干细胞注射液。

将购自北京大学医学部的I型糖尿病鼠模型，随机分为A、B和C三组组，每组10只，A组为脐带来源的肝干细胞注射液治疗组，B组为脐带血来源的肝干细胞注射液，C组为同体积0.9％的氯化钠溶液空白组。A和B两组在第0天鼠模型胰岛部位注射1×10⁶个/mL肝干细胞，即0.5mL肝干细胞注射液，第7天和第14天以相同剂量再次注射；C组于相同时间点在肝动脉输注0.SmL生理盐水并计算鼠模型血糖大小。分别于最后一次注射后的第7天、第14天、第21天和第28天监测鼠模型空腹血糖水平，结果如下表2所示。

表2

从表2可已看出，C组与A组或B组相比P远小于0.01。即用于治疗糖尿病的药物组合物对于I型糖尿病鼠模型具有优异的治疗效果，并且脐带和脐带血来源的肝干细胞产生的免疫排斥很小，即使是异种给药仍然具有明显的治疗效果。图5显示了实施例4中间品肝干细胞在糖尿病鼠模型中治疗情况。图5A为鼠模型治疗前对照的组织切片(伊红美兰染色)染色照片，图5B为肝干细胞治疗鼠模型治疗后的的组织切片染色照片。照片中显示表明肝干细胞在糖尿病鼠模型中修复了损伤的组织部位，组织部位明显生长紧密。肝干细胞治疗前有明显的胰岛组织损伤，组织之间明显不紧密。

实施例6

本实施例用于说明使用本发明的选择培养基对于中间品肝干细胞体外传代扩增培养的方法，以及含有本发明方法获得的肝干细胞的用于治疗糖尿病的药物组合物在糖尿病患者中应用。

4位糖尿病患者(具体情况见表3)分别提供骨髓100ml。所述离体组织骨髓按照实施例2所述的方法，收集聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)密度梯度离心后得到的中间层细胞，使用同样的选择培养基培养得到肝干细胞。按照实施例2到的方法对得到的肝干细胞进行免疫荧光检测，通过荧光显微镜下观测，各项指标符合肝干细胞的表征。取传代代数为第6代的肝干细胞按照实施例5的方法制备成注射液，分三次(一个疗程)通过胰动脉介入注射给药至相应患者，每次注射的肝干细胞为5×10⁶，间隔1周给药一次。

表3

患者接受自体肝干细胞治疗前后空腹血糖和胰岛素用量的变化如下：

表4

该四位患者均于肝干细胞注射后第20天停用胰岛素，空腹血糖治疗前后降低很明显，均安全出院。随访2个月，各项检查指标均正常。图6显示了四名糖尿病患者胰岛素用量变化曲线。从图中可以看出胰岛素用量逐渐降低，最后由于空腹血糖恢复到正常范围内，因此均于肝干细胞注射后第20天停用胰岛素。

实施例7

本实施例用于说明使用本发明的选择培养基对于中间品肝干细胞体外传代扩增培养的方法，以及含有本发明方法获得的肝干细胞的用于治疗糖尿病的药物组合物在治疗胰岛素抵抗中的应用。

通过喂养高脂饲料加腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)的方法建立胰岛素抵抗的动物模型(购自北京大学医学部)。具体地，50只雄性Wistar大鼠随机分为6组，其中，正常组10只普食饲养，其余每组10只，饲以高脂饲料，1月后，高脂饲料饲养的大鼠给予STZ 30mg/kg腹腔注射，每笼均为5只，饲养于标准环境，自由进水进食，12h光照周期，室温18～25℃，相对温度50％～60％。1周后以空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)≥16.7mmol/L为II型糖尿病胰岛素抵抗大鼠造模成功。正常组腹腔注射0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)2mL～3mL，1周后卒腹血糖处于正常范围内为正常组大鼠。

取50只模型大鼠随机分为肝干细胞注射液治疗的低、中、高剂量组以及模型组，每组10只；与正常组一起进行研究。肝干细胞注射液治疗低、中、高剂量组分别以按1×10⁶/100μl、5×10⁶/100μl、1×10⁷/100μl胰岛部位注射实施例4得到的传代代数为第9代的肝干细胞制备的注射液，隔周一次，共三次；正常组和模型组均以100μl生理盐水胰岛部位注射。于给药2月后禁食12h，腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg麻醉，腹主动脉取血，分离血清，放入-80℃冰箱待检。

采用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG)，用放射免疫试剂盒测定血清胰岛素(fasting insulin，FINS)含量(北京北方生物技术研究所)，检测方法根据使用说明书检测。

计算胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index，ISI)值＝Ln(1/FBG×FINS)；

计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment insulin resistance，HOMA-IR)＝FBG×FINS/22.5；

胰岛素抵抗指数数值越高说明机体对分泌的胰岛素产生抵抗作用越大，越大抵抗胰岛素的生物学作用。胰岛素敏感指数负值越大，说明机体对分泌的胰岛素敏感性越差，随着负值变小，机体对分泌的胰岛素产生敏感性。

表5显示了各组大鼠空腹血糖水平、胰岛素抵抗及敏感指数的比较(n＝10，)。

表5

从表5可以看出治疗组的各项指标好于模型组，而中、低剂量组的治疗效果好于高剂量组。