一种具有多价效应和纳米尺寸效应的多肽荧光探针的构建方法及其应用

具体实施方式

实施例1

本实施例选用的是远红荧光蛋白KatushkaS158A(简称fRFP)，该荧光蛋白优良的光学特性参数(例如，荧光亮度高、荧光光谱＞620nm)，使之无论是在活细胞还是在活体动物的光学成像研究中均有非常大的应用价值。

其具体构建步骤如下：

1)利用基因重组技术将靶向性多肽(targeting peptide，简称TP)序列LTVSPWYLTVSPWY分别偶联到fRFP的氨基端或羧基端，形成fRFP-TP或TP-fRFP，或同时偶联到氨基和羧基端，形成TP-fRFP-TP。由于Katushka的多聚化特性，使得此荧光蛋白-多肽复合体成为具有多价效应的探针。荧光蛋白偶联的多肽探针与活细胞表面标志物相互作用时，细胞表面受体介导的单价或多价探针内吞的示意图，如图1所示。

质粒pRSET-fRFP-TP，pRSET-TP-fRFP-TP构建过程如下：

以pRSET-KatushkaS158A为模板，PCR扩增出KatushkaS158A-GGGS-LTVSPWYLTVSPW(上游引物：CGGGATCCCGATGGTGGGTGAGGATAGCGTGCTGATCACC，下游引物：R1，CGTAAGATACCAAGGAGACACGGT CAGGCTACCGCCTCCGCTGTGCCCCAGTTTGCTAGG；R2，CCCAAGCTTTTAATACCAAGGGCTAACCGTAAGATACCAAGGAGACACGGTCGGC)与LTVSPWYLTVSPWY-GGGS-KatushkaS158A-SGGG-LTVSPWYLTVSPW

Y(上游引物：F1，GGTATCTTACGGTTAGCCCTTGGTATGGAGGCGGTAGCATGGTGGGTGAGGATAGCGTG；F2，CGCGGATCCCCTGACCGTGTCTCCTTGGTATCTTACGGTTAGCCCTTGGTATGGAGG，R1，CGTAAGATACCAAGGAGACACGGTCAGGCTACCGCCTCCGCTGTGCCCCAGTTTGTAGG；R2，CCCAAGCTTTTAATACCAAGGGCTAACCGTAAGATACCAA GGAGACACGGTCAGGC)，扩增后的PCR片段切胶回收后，用BamHI/HindIII双酶切，然后酶联入pRSET载体(BamHI/HindIII)中，构建质粒pRSET-fRFP-TP和pRSET-TP-fRFP-TP。

2)等摩尔浓度fRFP、fRFP-TP和TP-fRFP-TP的相对荧光强度及荧光光谱图，如图2所示。实验结果表明，TP与fRFP偶联后影响了fRFP的荧光强度。

3)多肽探针的10％SDS-PAGE凝胶电泳和FPLC分析与鉴定。10％SDS-PAGE凝胶电泳结果，如图3所示，表明fRFP，fRFP-TP与TP-fRFP-TP均为四聚体。如图4所示，fRFP，fRFP-TP和TP-fRFP-TP的FPLC结果，精确地鉴别了由于fRFP上偶联TP的效价不同而导致的三种蛋白质的分子量差异，与BSA(7nm)相比较可知，fRFP-TP和TP-fRFP-TP的纳米尺寸大于7nm。因而，此类多肽探针具有纳米颗粒的尺寸效应，在生物体内不会立即从肾脏排出，预计其体内循环的半衰期将长于小分子化学探针，有助于在肿瘤组织局部的蓄积。

4)等摩尔浓度的fRFP、fRFP-TP和TP-fRFP-TP分别与SKOV-3细胞孵育2h，激光共聚焦显微成像结果，如图5所示，证实具有多价(八价)性质的TP-fRFP-TP能最有效地被ErbB2⁺细胞摄取。

5)NIH3T3(ErbB2^-)细胞转染ErbB2-mCitrine质粒后，仅部分细胞表达ErbB2-mCitrine，即ErbB2阳性与阴性细胞共存。TP-fRFP-TP与此细胞群孵育后，仅高表达ErbB2的NIH3T3细胞可以特异摄取TP-fRFP-TP，而NIH3T3本身未检测到fRFP信号，如图6所示。

6)纯化的远红色荧光蛋白靶向肽TP-fRFP-TP过滤除菌后，尾静脉注射荷瘤裸鼠，可用于肿瘤的整体荧光成像。

实施例2

本实施例选用的是红荧光蛋白DsRed，激发和发射峰波长分别为557纳米和579纳米。将ErbB2受体靶向肽LTVSPWY重组在四聚体荧光蛋白DsRed的羧基端和氨基两端，形成LTVSPWYLTVSPWY-GGGS-DsRed-SGGG-LTVSPWYLTVSPWY(简称TP-DsRed-TP)。ErbB2受体阳性肿瘤细胞株SKOV-3细胞可高效摄入TP-DsRed-TP。

其具体构建步骤如下：

1)质粒pRSET-LTVSPWYLTVSPWY-GGGS-DsRed-SGGG-LTVSPWYL TVSPWY构建过程如下：

以pDsRed-Express为模板，PCR扩增出LTVSPWYLTVSPW-GGGS-DsRed-SGGG-LTVSPWYLTVSPW(上游引物：F1，CGCGGATCCCTTTTGTGATGGTTTCTATGCTTGTTATAAAGATGTTGGTGG，F2，CTATGCTTGTTATAAAGATGTTGGTGGTGGTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCA；下游引物：R1：CCCAAGCTTGTAGACAAGTATTGTGCATACTTTGGTGA CTGTTTCGGTG，R2：TACTTTGGTGACTGTTTCGGTGGTGGTCAGGAA CAGGTGG TGGCG GCC)

2)纯化的TP-DsRed-TP过滤除菌后，与SKOV-3细胞孵育2h，激光共聚焦显微成像结果证实具有ErbB2靶向性。

实施例3

本实施例选用的是绿色荧光蛋白ZsGreen，成熟后为四聚体，激发和发射峰波长分别为493纳米和505纳米。将ErbB2受体靶向肽LTVSPWY重组在ZsGreen羧基端和氨基两端，形成LTVSPWYLTVSPWY-GGGS-ZsGreen-SGGG-LTVSPWYLTVSPWY(简称TP-ZsGreen-TP)。具体实施途径与实施例2相同。TP-ZsGreen-TP同样有多价效应，SKOV-3细胞可通过细胞表面的ErbB2受体高效介导多肽探针的摄入。除上述三个实施例中提到的三种四聚体荧光蛋白外，其它四聚体荧光蛋白ZsYellow1和AmCyan1也可用于制备具有多价效应的多肽探针。

上述三个实施例所述的基因重组是指利用不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当可理解，并可对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。