法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-09-11
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/10 授权公告日:20111221 终止日期:20120723 申请日:20100723
专利权的终止
2011-12-21
授权
授权
2011-02-02
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/10 申请日:20100723
实质审查的生效
2010-12-15
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法，具体涉及一种基于microRNA前体二级结构特性的单链cDNA文库分离技术，属于分子生物学领域。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。目前首选的microRNA(miRNA)实验室鉴定方法是对依大小分离的cDNA文库进行测序分析。最初的试剂盒是用来克隆约22nt的小干涉RNA分子，但似乎对内源性的小RNA分子也有作用。于是，许多这样的试剂盒也被用来克隆miRNA。克隆小RNA的试剂盒发展很快，当前许多已知的miRNA就是用这些试剂盒鉴定出来的。所有试剂盒的原理都相同，仅在操作的细节上有所不同。简而言之，将总RNA样本用变性的聚丙烯酰胺凝胶分离，回收20-25nt大小的RNA。将5’和3’接头分子(Adapter)连接到RNA上，以接头分子为引物进行RT-PCR，PCR产物克隆到载体，构建cDNA文库。最后将每个克隆进行测序，分析起源于基因组的小RNA。
对于单链的cDNA合成，需要将3’接头连接到成熟的miRNA，引入一个反转录引物的退火位点。在寡核苷酸的化学合成过程中，为了防止成熟miRNA和接头自我成环，在连接前小RNA通常要经脱磷酸处理，要在3’接头的3’羟基末端连接上一个非核苷基团。另外一个很普遍的作法是，将3’接头5’端腺苷酸化，免去了小RNA脱磷酸的步骤。还有的是用poly(A)连接酶将poly(A)尾巴来代替3’接头分子连接到小RNA分子上，就用oligo(dT)来当反转录的引物。
通过克隆测序发现miRNA共同的局限性是：由于小RNA文库中的siRNA(小的干涉RNA)较多，导致克隆效果大大降低，对于低水平表达，或特定时期，或稀有细胞类型中的miRNA难以找到。例如McDaneld等(McDaneld，T.G，Smith，T.P.，Doumit，M.E.，Miles，J.R.，Coutinho，L.L.，Sonstegard，T.S.，Matukumalli，L.K.，Nonneman，D.J.，Wiedmann，R.T.MicroRNA transcriptome profiles during swine skeletal muscle development.BMC Genomics.2009，10：77-88)用小RNA的cDNA文库测序的方法来研究micorRNA在猪骨骼肌中的表达，一共做了5000个克隆测序，在得到的600个不同的克隆序列中，只确认了约150个已知的microRNA序列和约70个未知的microRNA序列，其余大部分不是microRNA序列。可见新microRNA的筛选采用小RNA的cDNA文库克隆测序的方法还是可行的，只是效率较低，测序结果中重复的序列较多。在5000个克隆中仅有约600个不同的小RNA序列(12％)，而且这600个中也只有一小部分(36％)是miRNA序列。
因此需要寻求一种更为有效地分离miRNA前体的方法，以此提高miRNA的克隆测序效率。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用microRNA前体的发夹二级结构特性来从小RNA合成的cDNA文库分离microRNA前体cDNA的方法。
为了达到上述目的，本发明提供了一种从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法，该方法包括以下步骤：将合成的cDNA进行PCR扩增，扩增后将PCR片段经限制酶酶切，克隆测序；该方法在进行PCR扩增之后、PCR片段酶切之前还需要对所获得的PCR产物进行microRNA前体片段的不同二级结构单链分离；所述分离过程包括以下步骤：
(1)将得到的cDNA片段用5’端带有生物素标记的引物进行PCR扩增，扩增后得到的cDNA双链进行变性处理，然后用磁珠技术进行cDNA双链分离；
(2)对步骤(1)中得到的单链进行复性，得到具有microRNA前体片段的二级结构的cDNA；
(3)通过电泳分离步骤(2)中得到的cDNA，得到具有不同二级结构的单链cDNA，分别回收，进行PCR反应形成双链。
其中，步骤(1)中PCR扩增引物为：F：5’-AAAGATCCTGCAGGTGCGTCA-3’，R：5’-GTCTCTAGCCTGCAGGATCGATG-3’；扩增后得到的cDNA双链变性处理条件为95℃时5min。
步骤(2)中单链cDNA复性过程为在以下条件下依次进行：94℃时2min，60℃时30sec，72℃时1min，4℃时5min。
步骤(3)中电泳分离采用聚丙烯酰胺电泳或二维电泳，电泳结束后银染。
与现有技术相比，本发明提供的单链cDNA文库分离克隆测序方法具有以下有益效果：本发明利用了miRNA前体的发夹形二级结构特点来分离miRNA前体，提高了miRNA的克隆测序效率；同时本发明在电泳时未加任何染料，在电泳结束后再进行银染，保证了具有不同二级结构的DNA分子达到更好的分离效果。
附图说明
附图为本发明从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA方法的流程图。
具体实施方式
实施例1
1、小RNA提取
使用罗氏公司的小RNA(＜100bp)提取试剂盒(High Pure miRNA IsolationKit，Cat.No.05 080 576 001)。具体操作步骤如下：
1)加400μL 20％结合缓冲液(Binding Buffer)到一个2mL的空试管中；
2)加1～50mg的肌肉组织样品到试管中，用匀浆机将组织打碎；
3)将试管在4℃下，14000rpm离心2min，后取上清液约150-188μL到另一个新的1.5mL的试管中；
4)加312μL的Binding Buffer，震动3×5s；
5)将试剂盒中的滤管和收集管组装好，将混合液吸入上面的滤管中；
6)13000×g离心30s，收集下面收集管中的液体；
7)再加200μL的结合增强缓冲液(Binding Enhancer)到收集管中，震动3×5s；
8)将试剂盒中的滤管和收集管组装好，将混合液吸入上面的滤管中；
9)13000×g离心30s，倒掉收集管中的液体；
10)加500μL的冲洗缓冲液(Wash Buffer)工作液到滤管中；
11)13000×g离心30s，倒掉收集管中的液体；
12)加300μL的Wash Buffer工作液到滤管中；
13)13000×g离心30s，倒掉收集管中的液体；
14)13000×g离心1min；
15)将滤管置于一个新的1.5mL的试管中，加100μL洗脱缓冲液(Elution Buffer)(为了提高RNA浓度，加50μL Elution Buffer也行，但会损失产量约30％)，在15～25℃下孵化1min；
16)13000×g离心1min；
17)这样＜100nt miRNA就提出来了，可以直接做RT-PCR或者保存于-80℃下以备用。
2、小RNA的细菌碱性磷酸酶(Bacterial Alkaline Phosphatase，BAP)处理
小RNA的克隆要使用小RNA克隆试剂盒(Small RNA Cloning Kit)。具体操作步骤如下：
1)在1～100ng的小RNA中加入去核糖核酸酶的双蒸水(RNase freeddH2O)，总量至42μL。
2)在小试管(Microtube)中配制如下反应液：
Small RNA 42μL
核糖核酸酶抑制剂(RNase Inhibitor) 1μL
10×BAP Buffer 5μL
BAP 2μL
Total 50μL
3)使用微量移液管(Micropipetman)轻轻混匀后，37℃反应1小时。
4)加入50μL的RNase free ddH2O，将总体积调至100μL后，再加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇，在振荡器上振荡5～10秒钟，使其充分混匀。
5)4℃15,000rpm离心5分钟，将上清(水层)转移到新的Microtube中。注意不要取到中间层。
6)再次加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇混匀后，离心回收上层。
7)加入等量的氯仿/异戊醇，在振荡器上混匀5～10秒钟。
8)4℃15,000rpm离心5分钟，将上清(水层)转移到新的Microtube中。
9)向上清中加入1/10体积的3M醋酸钠(Sodium Acetate)、4μL的Dr.GenTLE沉淀载体(Dr.GenTLE Precipitation Carrier)、2.5倍体积的乙醇，充分混匀。
10)-80℃放置1小时后，4℃15,000rpm离心1小时，轻轻倒掉上清，保留沉淀。
11)用80％乙醇清洗沉淀。
12)风干后(注意不要过于干燥)，用14μL的RNase free ddH2O溶解。
13)用微量紫外分光光度计检测RNA质量。
3、3’接头分子(Adaptor)的连接
1)在Microtube中配制如下反应液。
0.1％牛血清白蛋白(bovine 3μL
serum albumin，BSA)
RNase Inhibitor 1μL
3’Adaptor 1μL
BAP处理Small RNA 14μL
Total 19μL
2)加入30μL的T4的核糖核酸连接缓冲液(T4 RNA Ligation Buffer)，用Micropipetman混匀(此Buffer比较粘，操作时要注意)。
3)加入1μL的T4RNA Ligase，用Micropipetman充分混匀。
4)15℃反应1小时。
4、MAGNOTEX-SA的吸附
1)移取210μL的2×B/W Buffer到Microtube中，再加入210μL的RNase free ddH2O配制成1×B/W Buffer。
2)将磁性-生物素-链霉亲和素系统(MAGNOTEX-SA，Magnet Beads)充分混匀后，取10μL至新的离心Microtube中。
3)将Tube置于磁力分离架(Magnetight Separation Stand)上，静置30秒钟后去上清。
4)加入10μL的2×B/W Buffer，在振荡器上轻轻混匀后，置于MagnetightSeparation Stand上，静置30秒钟。(B/W Buffer中含有Tritonx-100，易起泡，但对反应没有影响。)
5)弃上清，加入50μL的2×B/WBuffer。
6)向上述2、的连接反应液中加入50μL上述5)中制备的Magnetbeads，充分混匀。
7)25℃静置1小时。
8)反应结束后，将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟。
9)弃上清后，加入100μL的1×B/W Buffer，用Vortex短时间振荡，使Beads混匀。
10)将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟，弃上清。
11)加入100μL的RNase free ddH2O，轻轻混匀。此水溶液在进行下步实验之前不要去除。
5、5’末端磷酸化
1)在Microtube中于冰上配制如下反应液。
RNase free ddH2O 38μL
RNase Inhibitor 1μL
T4的多聚核苷酸激酶 10μL
(Polynucleotide Kinase，PNK)缓冲
液(5×T4PNK Buffer)
T4 Polynucleotide Kinase 1μL
Total 50μL
2)将上述试验操作4的步骤11)中制备的Beads水溶液在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟后去上清，然后向其Microtube中加入50μL上述1)配制的反应液，用Micropipetman轻轻混匀。
3)37℃反应30分钟。
4)在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟。
5)弃上清，加入100μL的1×B/W Buffer，短时间在Vertex上振荡使Beads混匀。
6)将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟，弃上清。
7)加入100μL的RNase free ddH2O，轻轻混匀。此水溶液在进行下步实验之前不要去除。
6、5’Adaptor的连接
1)在Microtube中于冰上配制如下反应液，充分混匀。
RNase free ddH2O 14μL
T4RNA Ligation Buffer* 30μL
0.1％BSA 3μL
5’Adaptor 1μL
RNase Inhibitor 1μL
T4 RNALigase 1μL
Total 50μL
*此Buffer比较粘，操作时要注意。
2)将上述实验操作5的步骤7)中制备的Beads水溶液在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟后去上清，然后向其Microtube中加入上述1)配制的反应液，用Micropipetman轻轻混匀，15℃反应1小时。
3)加入50μL的RNase free ddH2O充分混匀后，在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟。
4)弃上清，加入100μL的1×B/W Buffer，短时间在Vertex上振荡使Beads混匀。
5)将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟，弃上清。
6)加入100μL的RNase free ddH2O，轻轻混匀。此水溶液在进行下步实验之前不要去除。
7、反转录反应
1)在Microtube中于冰上配制如下反应液。
5×反转录缓冲液(5×RT Buffer) 4μL
dNTP混合液(dNTP Mixture) 4μL
RNase Inhibitor 1μL
PCR-R和反转录引物(PCR-R&RT-Primer) 1μL
M-MLV反转录酶(M-MLV，莫洛尼鼠白血病逆转录病毒) 1μL
Total 11μL
PCR-R&RT-Primer：5’-GTCTCTAGCCTGCAGGATCGATG-3’
2)将上述实验操作6的步骤7)中制备的Beads水溶液在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟后去上清，然后向其Microtube中加入9μL的RNase free ddH2O，75℃处理5分钟后，冰上静置1～2分钟。
3)再向其Microtube中加入上述1)中配制的反应液11μL，均匀混合后42℃反应1小时。
4)在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟。
5)去除上清，加入100μL的1×B/W Buffer，短时间在Vertex上振荡使beads混匀。
6)将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟，弃上清。
7)加入100μL的RNase free ddH2O，轻轻混匀。此水溶液在进行下步实验之前不要去除。
8、PCR扩增
1)在Microtube中于冰上配制如下反应液。
RNase free ddH2O 12μL
2×PCR Buffer 25μL
dNTP Mixture 5μL
PCR引物(PCR-Primer)F 1μL
PCR-R&RT-Primer 1μL
Taq酶 1μL
Total 45μL
2)将上述实验操作7的步骤7)中制备的Beads水溶液在MagnetightSeparation Stand上静置30秒钟后去上清，然后向其Microtube中加入5μL的0.1N NaOH，用手指轻弹Microtube混匀(注意不能用Micropipetman混匀，因为磁珠会吸附于Tip壁上)。
3)25℃放置5分钟后，在Magnetight Separation Stand上静置30秒。
4)取上清移至0.2mLPCR反应管中。
5)加入45μL上述1)中配制的反应液，充分混匀。
6)在Thermal Cycler PCR仪上按以下条件进行PCR反应。
94℃ 2min
72℃ 3min
4℃ ∞
7)电泳检测PCR产物结果。
8)胶回收连接了接头的成熟miRNA片段(较小)和接了接头的miRNA前体片段(较大)并纯化。这些DNA片段以备用。
9、miRNA前体片段的不同二级结构单链分离
1)在Microtube中于冰上配制如下反应液：
RNase free ddH2O 12μL
2×PCR Buffer 25μL
dNTP Mixture 5μL
PCR-Primer-F(5’生物素标记) 1μL
PCR-Primer-R 1μL
Taq酶 1μL
回收的miRNA前体片段 5μL
Total 50μL
PCR-Primer-F：5’-AAAGATCCTGCAGGTGCGTCA-3’
PCR-Primer-R：5’-GTCTCTAGCCTGCAGGATCGATG-3’
2)PCR反应程序：
94℃ 2min
72℃ 3min
4℃ ∞
3)取5μLPCR产物进行电泳检测：约120bp。
4)如果电泳检测条带较好，再进行以下实验。将PCR产物在PCR仪上进行变性处理：95℃5min，将PCR产物取出后速置于冰水之中，以后操作都在冰上进行。
5)MAGNOTEX-SA的吸附
a、移取210μL的2×B/W Buffer到Microtube中，再加入210μL的RNasefree ddH2O配制成1×B/W Buffer。
b、将磁性-生物素-链霉亲和素系统(MAGNOTEX-SA，Magnet Beads)充分混匀后，取10μL至新的离心Microtube中。
c、将Tube置于Magnetight Separation Stand上，静置30秒钟后去上清。
d、加入10μL的2×B/W Buffer，在振荡器上轻轻混匀后，置于MagnetightSeparation Stand上，静置30秒钟。(B/W Buffer中含有Tritonx-100，易起泡，但对反应没有影响。)
e、弃上清，加入45μL的2×B/WBuffer。
f、向上述4的变性PCR产物中加入45μL上述e中制备的Magnet beads，充分混匀。
g、25℃静置1小时。
h、反应结束后，将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟。
i、吸取上清到一个新的PCR管(存起备用)后，加入100μL的1×B/WBuffer，用Vortex短时间振荡，使Beads混匀。
j、将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟，弃上清。
k、加入100μL的RNase free ddH2O，轻轻混匀。此水溶液在进行下步实验之前不要去除。
6)将上述操作制备的Beads水溶液在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟后去上清，然后向其Microtube中加入5μL的0.1N NaOH，用手指轻弹Microtube混匀(注意不能用Micropipetman混匀，因为磁珠会吸附于Tip壁上)。25℃放置5分钟后，在Magnetight Separation Stand上静置30秒。取上清移至0.2mLPCR反应管中。
7)将上述的PCR管置于PCR仪中：94℃2min，60℃30sec，72℃1min，4℃5min。使得miRNA的发夹前体形成。
8)将上述的PCR产物进行未变性的聚丙烯酰胺电泳或二维电泳，银染(注意要用银染，EB不能染单链DNA)，拍照。
9)将电泳结果进行分析，跑在最前面的为引物二聚体，发夹结构的单链DNA在中间，非发夹结构的单链DNA在最后。
10)分别将凝胶中不同位置的DNA进行回收，回收滤液后进行乙醇沉淀。
11)以回收的单链DNA为模板，还是用原来的引物，进行PCR反应，得到双链后，电泳纯化回收PCR产物，乙醇沉淀。
10、PCR片段的Sse8387 I酶切及克隆测序
由于克隆的片段较小，易产生假阳性，故需要进行酶切后再用专用的载体进行克隆，以提高克隆效率。
1)在Microtube中配制如下反应液。
dH2O 34μL
10×M Buffer 5μL
0.1％BSA 5μL
上述实验操作9-11)的PCR产物 5μL
Sse8387I(10U/μL) 1μL
Total 50μL
2)37℃过夜反应。
3)加入5μL的3M NaOAc(pH5.2)、125μL的100％乙醇混匀后，-80℃放置30分钟。
4)4℃15,000rpm离心15分钟后，轻轻倒掉上清。
5)用80％乙醇清洗沉淀。
6)风干后(注意不要过于干燥)，将沉淀用5μL的TE Buffer溶解。
7)加入1μL的6×载样缓冲液(Loading Buffer)(36％Glycerol、30mMEDTA、0.05％BPB、0.050％XC)进行15％的聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamidegel)(未变性)电泳(Marker：20bp DNA Ladder)。
8)BPB泳动至4/5胶长时即停止电泳。把胶放入新配制的染色液EtBr中进行染色。
9)用干净刀片，把目的片段切出。目的片段长度是RNA长度+PCR PrimerF+RT-Primer之和再用Sse8387I酶切后的片段长度(Sse8387 I酶将切去22bp)。例如：RNA长度为70mer，PCR片段长度为120bp；用Sse8387I酶切后的长度为98bp。
10)在0.5mL Microtube底部用18G的针扎一个孔，插入1.5mL或者2mL Microtube内，用封口膜等把配套的Microtube固定。
11)将切取的胶块放入配套好的0.5mL Microtube底部，4℃15,000rpm离心2min。通过本方法能把胶破碎，破碎胶将移至下部管的底部。如果0.5mL管底部还有胶残留，可以再离心2min。
12)取出0.5mL Microtube，在下部Microtube中加入50～100μL的1×MBuffer(10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，1mM DTT，50mM NaCl)。
13)25℃放置1小时(中间反复颠倒混合数次)。
14)把胶液加入SUPREC-01中，4℃15,000rpm离心2min，回收滤液后进行乙醇沉淀。
15)将纯化后的PCR Sse8387I酶切片段和50ng Pst I酶切后的Vector(pUC118 Pst I/BAP)适量混合后，加入等量的Solution I中(DNA Ligation Kit Ver.2.0)，Solution I请于冰中融解。16℃反应30分钟。
16)取连接液的一部分转化至E.coli JM109 Competent Cells中。
①全量(10μL)加入至100μL的JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。
②42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1-2分钟。
③加入890μL的SOC培养基，37℃振荡培养60-120分钟。
SOB培养基：
配制每升培养基，在950mL去离子水中加入：
胰化蛋白胨 20g
酵母提取物 5g
NaCl 0.5g
摇动容器使溶质完全溶解。加10mL 250mmol/L KCl溶液(将1.86gKCl用100mL去离子水溶解即配成250mmol/L KCl溶液)。用5mol/LNaOH调pH值至7.0。用去离子水定容至1L。在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。该溶液在使用前，加入5mL灭菌的2mol/LMgCl2[2mol/L MgCl2溶液的配制方法如下：用90mL去离子水溶解19g MgCl2，用去离子水调整体积为100mL，在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min]。
SOC培养基：
SOC培养基除含有20mmol/L葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同。SOB培养基经高压灭菌后冷至60℃或60℃以下，加20mL除菌的1mol/L葡萄糖溶液(1mol/L葡萄糖溶液的配制方法是：用90mL去离子水溶解18g葡萄糖，完全溶解后，用去离子水定容至100mL，用0.22μm滤器过滤除菌)。
④8000rmp，离心1min，轻轻吸去800μL上清液，留下约200μL上清液，用灭菌枪头重悬沉淀，将菌混匀，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，X-Gal)、异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(ISOPROPYL B-D-1-THIOGALACTOPYRANOSIDE，IPTG))、Amp的L-琼脂平板培养基上分两次涂板培养12～20h，形成单菌落。
LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基：
组份浓度
1％(W/V) 蛋白胨(Tryptone)
0.5％(W/V) 酵母提取物(Yeast Extract)
1％(W/V) NaCl
0.1mg/mL 氨苄青霉素(Ampicillin)
0.5％(W/V) IPTG
0.04mg/mL X-Gal
1.5％(W/V) 琼脂粉(Agar)
配制量1L
配制方法：
a、称取下列试剂，置于1L烧杯中。
Tryptone 10g
Yeast Extract 5g
NaCl 10g
b、加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。
c、滴加5NNaOH溶液(约0.2mL)，调节pH值至7.0。
d、加水离子水将培养基定容至1L后，加入15gAgar。
e、高温高压灭菌后，冷却至60℃左右。
f、加入1mL Ampicillin(100mg/mL)、1mL IPTG(24mg/mL)、2mL X-Gal(20mg/mL)后均匀混合。
g、铺制平板(30～35mL培养基/90mm培养基)。
h、4℃保存平板。
⑤将平板用封口胶封住，放入4℃冰箱中显色1h，计数白色、蓝色菌落。
⑥用灭菌枪头挑选白色菌落放入已加入10μL灭菌超纯水的PCR管中，取1-2μL悬液作为模板，使用菌液PCR法等确认载体中插入片段的长度大小。
⑦取重组阳性菌落悬浊液5μL放入2mL SOC液体培养基(含Amp100ug/mL)，37℃、振荡培养12-20h。
17)涂平板后进行37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行PCR鉴定。PCR鉴定引物用BcaBESTTM Sequencing Primers或M13Primers，不易产生假阳性。
18)经PCR鉴定后的阳性克隆经扩培后，培养的菌液(1mL左右)送上海Invitrogen公司进行测序。
测序结果：PCR鉴定得到的136个阳性单克隆的菌液，有111个阳性单克隆的菌液测序成功，其中有3个序列为重复序列，共测得108个不重复序列。
实施例2
采用本方法来研究猪的miRNA，分离回收了凝胶中两个不同区的cDNA单链，恢复为双链后再进行克隆测序。测序结果用BioEdit和RNAfold软件分析后，发现A区和B区克隆测序结果中发夹序列的比率明显不同。在A区的63个测序结果中，所有序列几乎全部为“三叶草”型二级结构，无一基本符合miRNA前体的发夹型二级结构标准。这说明，这一区的小RNA多不是miRNA前体。而在B区的45个测序结果中，共找到了5个基本符合miRNA前体发夹型二级结构的序列，但其他大部分序列仍不符合miRNA前体发夹型二级结构的定义要求(表1)。A区和B区的发夹结构序列数目经SPSS 13.0软件的卡方检验表明差异显著(P＜0.05)(N＝108，最小期望频数为2.08，2×2表格采用连续校正的卡方值为5.039，双尾P值为0.025＜0.05)。
表1A区和B区的单克隆测序结果对比
结果表明，这种方法完全可以将不同二级结构的小RNA cDNA单链分离回收，具有明显的效果。
机译： 一种分离和纯化具有对蛇毒腺（bpps），特别是贾拉卡双峰植物分泌的或具有血管扩张和抗高血压作用的内源性（evasins）分泌的血管紧张素转化酶羧基位点具有特异性的血管肽酶抑制肽的方法;确定蛇毒（bpps）或内源性（evasin）毒液分泌的抑制剂肽的淀粉序列的过程;通过从蛇组织中表达的这些分子的前体中减去cdna来确定bpps氨基酸序列的过程，尤其是杂种植物。通过从在蛇组织中表达的这些分子的前体推导cdna来确定evasins氨基酸序列的过程，特别是在蛇和蛇脑cdna文库中扩增cdna的过程，尤其是在蛇和草cdna文库中;血管肽酶抑制肽具有血管舒张和降压作用的固相合成方法
机译： 从小RNA制备cDNA文库的组合物和方法
机译： 一种简单的方法，用于从鱼鳞和卡萨里娜中分离未合成的总RNA，并从未纯化的RNA中合成cDNA
