一种抑制小麦1B/1R易位系中ω黑麦碱基因表达的DNA片段及其用途

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中一种抑制小麦1B/1R易位系中ω黑麦碱基因表达的DNA片段及其在改良1B/1R易位系小麦加工品质方面的应用。

背景技术

小麦1B/1R易位系由于具有高产和适应性广等优点，在我国大面积推广的高产小麦中占有很大的份额。但这类品种普遍存在加工品质差的问题，主要体现在面筋强度低、耐揉性差和面团发粘，对面包和面条加工品质都有明显的不良影响（Dhaliwal等, Cereal Sci., 1990, 12:165-175；刘建军等，作物学报，2004，30（2）：149～153）。研究发现，小麦1B/1R易位系1RS染色体臂上的ω-黑麦碱基因被认为是导致面团加工品质变差的重要原因（Graybosh等，Cereal Chemistry, 1990, 67:342 - 349），因此消除ω-黑麦碱基因的不良影响是改善小麦1B/1R易位系加工品质的一条重要途径。

在用小麦1B/1R易位系做杂交亲本的品质育种中，人们常常在杂交后代中淘汰含1B/1R易位的个体，但这样做同时也淘汰了与ω-黑麦碱基因连锁的高产和广适基因，导致培育出来的小麦虽优质但不高产，适应性也比较差。在常规小麦育种中试图打破ω-黑麦碱基因与高产和广适基因之间的连锁很难实现，因为它们同处于外源的1RS染色体臂上，常规条件下1RS染色体臂很难与小麦的1BS染色体臂配对，因此利用传统育种方法很难解决1B/1R易位系小麦高产不优质的难题。

ω-黑麦碱基因是一个包括多个成员的基因家族，不同家族成员之间DNA序列高度相似（Chai等，Cell Research, 2005,15(8):658-664），利用诱变技术突变个别ω-黑麦碱基因是可行的，但要同时突变多个ω-黑麦碱基因则很难实现。近年来发展起来的RNA干涉(RNAi)技术可同时沉默多个序列高度相似的基因的表达，这为改良由多个基因控制的单一性状提供了一条有效途径。其主要原理是在生物体内掺入或表达目标基因的双链RNA(ds-RNA)，可引起植物固有的转录后基因沉默（PTGS, Post-Transcriptional Gene Silencing），与双链RNA序列高度相似的内源mRNA被降解，从而获得目标基因功能减弱或缺失的表型（Scott等， Nature, 2001,2:110-119;Phillip等,Genes & Development , 2001,15:485-490）。这项技术已被成功用于大幅度降低小麦种子中直链淀粉的含量（Li等，Acta Genetica Sinica, 2005, 32(8):846-854）。

发明内容

本发明提供了一种可用于抑制小麦1B/1R易位系中ω-黑麦碱基因表达的DNA片段及其在改良1B/1R易位系小麦加工品质方面的用途。

本发明提供的一种抑制小麦1B/1R易位系中ω黑麦碱基因表达的DNA片段，其特征在于其序列为序列表中SEQ ID NO.1。SEQ ID NO.1全长936bp,其中1-381bp为一个有转录活性ω黑麦碱基因的部分编码区序列，382-387bp为BamH I酶切位点序列，388-548bp为含有小麦蜡质蛋白基因第一内含子的一段DNA序列，549-555为含有Xba I酶切位点的一段连接序列，556-936bp为1-381bp的反向互补序列。

 所述的抑制小麦1B/1R易位系中ω黑麦碱基因表达的DNA片段，其特征在于利用该片段、启动子和终止子等可以构建成抑制小麦1B/1R易位系中ω黑麦碱基因表达的RNAi遗传表达载体。

所述的抑制小麦1B/1R易位系中ω黑麦碱基因表达的DNA片段，其特征在于构建的RNAi遗传表达载体为pAHC25-Sec。

所述的抑制小麦1B/1R易位系中ω黑麦碱基因表达的DNA片段，其特征在于构建的RNAi遗传表达载体为pAHC15-Sec。

所述的抑制小麦1B/1R易位系中ω黑麦碱基因表达的DNA片段，其特征在于构建的RNAi遗传表达载体为pCAMBIA-2200-Sec。

所述的抑制小麦1B/1R易位系中ω黑麦碱基因表达的DNA片段，其特征在于构建的RNAi遗传表达载体为pCAMBIA-0390-Sec。

所述启动子为玉米Ubiquitin启动子、水稻Actin启动子或种子特异性启动子（如小麦高分子量麦谷蛋白5亚基基因的启动子、ω-黑麦碱基因的启动子等）。

所述RNAi遗传表达载体包括两种类型，一种含有抗性筛选标记基因，一种不含抗性筛选标记基因。

本发明还提供了所述DNA片段在抑制小麦1B/1R易位系中ω-黑麦碱基因表达方面的用途，其特征在于利用所述RNAi遗传表达载体对小麦1B/1R易位系进行遗传转化，从中筛选出ω-黑麦碱基因表达受抑制的转化体。

所述的遗传转化，其特征在于进行遗传转化的方法为农杆菌侵染法、基因枪或花粉管介导法。

所述的基因枪介导法，其特征在于该方法包括两种类型，一种是利用所述含有抗性筛选标记的RNAi遗传表达载体进行基因枪转化，另一种是把所述不含抗性筛选标记的RNAi遗传表达载体与一种含有抗性筛选标记的其它表达载体混合后进行基因枪共转化。

所述DNA片段在抑制小麦1B/1R易位系中ω-黑麦碱基因表达方面的用途，其特征在于通过基因枪介导法将RNAi遗传表达载体pAHC25-Sec转入到小麦1B/1R易位系的幼胚愈伤组织中，抗性再生后代经PCR检测、RNA表达量检测和种子贮藏蛋白SDS-PAGE电泳检测，筛选得到ω黑麦碱基因表达受抑制的转基因后代。

用本发明的方法把所述RNAi遗传表达载体转化到小麦1B/1R易位系中，形成的双链RNA可引起小麦固有的转录后基因沉默，使小麦1B/1R易位系内源ω-黑麦碱基因转录产生的mRNA降解，下调甚至完全沉默ω-黑麦碱基因的表达。本发明在解决小麦1B/1R易位系高产不优质这一问题上将得到广泛应用。

附图说明

图1是转pAHC25-Sec抗性再生植株BAR基因的PCR检测图谱

图中

A为未转化的兰考906阴性对照植株；B为阳性对照质粒pAHC25-Sec；1-6号为转化兰考906后得到的抗性再生植株。

图2是转pAHC25-Sec抗性再生植株Ubiquitin启动子的PCR检测图谱

图中

A为未转化的兰考906阴性对照植株；B为阳性对照质粒pAHC25-Sec；1-6号为转化兰考906后得到的抗性再生植株。

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不以任何方式限制本发明的范围。

具体实施方式

    实施例中所用基因枪耗材购自伯乐公司，所用试剂如无特别说明均购自上海生工生物工程技术有限公司，所用引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

实施例1：用于沉默ω-黑麦碱基因的DNA片段的制备

根据Cell Research杂志上发表的ω-黑麦碱基因不同成员编码区的序列（Chai等，Cell Research, 2005,15(8):658-664），选取5′相对保守的区段设计一对引物，P3-1：ttcccgggccttcctcatctttgtcct(黑体部分为加入的Sma I酶切序列)，P4-1： taggatccgctctggtctctggggttg(黑体部分为加入的BamH I酶切位点)，以小麦1B/1R易位系兰考906的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增参数为：94℃ 4分钟，94℃ 45秒，65℃ 45秒，72℃ 1分钟，30个循环，72℃再延伸7分钟。PCR扩增产物用天根生化科技（北京）有限公司的pBS-T克隆试剂盒进行克隆，并选取部分阳性克隆进行测序。其中一个阳性克隆长度为397bp,经序列比对，发现其来自于一个具有表达活性的ω-黑麦碱基因的家族成员，这里称该扩增片段为A片段，其DNA序列为序列表中的SEQ ID NO.2。

为得到上述A片段的反向互补片段，设计另一对引物反P4-1和反P3-1，其序列为反P4-1：aatttctagaagctctggtctctggggttg(黑体部分为加入的Xba I酶切位点) 和反P3-1：aatagagctcccttcctcatctttgtcct(黑体部分为加入的Sac I酶切位点)，以上述含A片段的质粒为模板进行PCR扩增，扩增参数与A片段扩增时相同，得到与A片段反向互补的C片段（不包括在引物中加上去的酶切位点和保护碱基），其DNA序列为序列表中的SEQ ID NO.3。

含内含子的DNA片段用PCR从小麦蜡质蛋白基因（Waxy）的第一内含子区域进行扩增，所用引物为P内1：aattggatccggcggcctcggcgacgtcctcg(黑体部分为加入的BamH I酶切位点)和P内2：aatttctagaacccggtgaccgttggcctgca(黑体部分为加入的Xba I酶切位点)，以中国春小麦的的基因组DNA为模板进行扩增，扩增参数与扩增A片段相同，扩增后对产物进行克隆测序，得到三种长度的扩增片段（164bp、172bp和181bp），其中长度为181bp的片段所含内含子与文献报道的小麦Waxy基因第一内含子的序列完全相同，称该片段为B片段，其序列为序列表中的SEQ ID NO.4。

在用pBS-T克隆试剂盒进行克隆时会出现一些没有插入片段的蓝斑，选择一个蓝斑摇菌提质粒得到闭环的pBS-T质粒载体，该载体具有“Sma I-BamH I-Xba I-Sac I”结构的多克隆位点，在本发明中用其作为片段连接的中间质粒载体。首先把Sma I/BamH I双酶切的正义片段A连接到同样双酶切的pBS-T载体上，在此基础上再把BamH I/Xba I双酶切的含内含子的B片段和和Xba I/Sac I双酶切的与A片段反向互补的C片段依次连上去，得到重组载体pBS-T-Sec,其中的“正义-内含子-反义”结构的片段就是本发明中用于抑制ω-黑麦碱基因表达的DNA片段，其序列为序列表中的SEQ ID NO.1（不包括用于酶切目的而加进去的酶切位点序列及以外的保护碱基序列）。

实施例2：RNAi遗传表达载体的构建

用Sma I/Sac I双酶切把GUS基因从基础植物双元表达载体pAHC25(Christensen AH和Quail PH,Transgenic Research, 1996, 5:213-218)上切除，然后连接上同样双酶切从重组载体pBS-T-Sec上切下来的SEQ ID NO.1片段，得到新的重组表达载体pAHC25-Sec，该表达载体使用的启动子为玉米Ubiquitin，植物抗性筛选基因为BAR基因，可直接用于基因枪或花粉管介导的遗传转化。

实施例3：RNAi遗传表达载体的构建

用Sma I/Sac I双酶切把GUS基因从基础植物双元表达载体pAHC15(Christensen AH和Quail PH,Transgenic Research, 1996, 5:213-218)上切除，然后连接上同样双酶切从重组载体pBS-T-Sec上切下来的SEQ ID NO.1片段，得到新的重组表达载体pAHC15-Sec，该表达载体使用的启动子为玉米Ubiquitin，不含植物抗性筛选基因，可与含植物抗性筛选标记BAR基因的表达载体pAHC20(Christensen AH和Quail PH,Transgenic Research, 1996, 5:213-218)进行基因枪共转化。

实施例4：RNAi遗传表达载体的构建

用Hind III/EcoR I对实施例2中构建的表达载体pAHC25-Sec进行双酶切,回收约3.2kb含Ubiquitin启动子、SEQ ID NO.1片段和终止子的片段，然后将其连接到同样双酶切的农杆菌表达载体pCAMBIA-2200(Hajdukiewicz P, Svab Z 和Maliga P，Plant Mol. Biol.，1994，25(6)：989-994)上，得到可用于农杆菌转化的表达载体pCAMBIA-2200-Sec，该表达载体的植物抗性筛选基因为卡那霉素基因。

实施例5：RNAi遗传表达载体的构建

用Hind III/EcoR I部分双酶切实施例2中构建的表达载体pAHC25-Sec，回收约6.1kb含Ubiquitin启动子、SEQ ID NO.1、终止子、Ubiquitin启动子、BAR基因和终止子的片段，然后将其连接到同样双酶切的农杆菌表达载体pCAMBIA-0390(Hajdukiewicz P, Svab Z 和Maliga P，Plant Mol. Biol.，1994，25(6)：989-994)上，得到可用于农杆菌转化的表达载体pCAMBIA-0390-Sec，该表达载体的植物抗性筛选基因为BAR基因。

实施例6：用基因枪介导法把表达载体pAHC25-Sec转入小麦幼胚获得ω-黑麦碱基因表达受抑制的转基因小麦1B/1R易位系

    取小麦1B/1R易位系兰考906授粉后8-15天的未成熟籽粒，用1%的次氯酸钠溶液消毒10分钟，用无菌水冲洗4次，在无菌条件下挑出幼胚盾片朝上接种到愈伤诱导培养基SD₂上(MS培养基的无机盐附加VB₁ 1mg/L、天冬酰胺 150mg/L、2,4-D 2mg/L、蔗糖30g/L、植物胶2.5g/L、pH 5.8), 黑暗条件下（25℃）诱导愈伤组织，7～10天后将愈伤组织集中在高渗透压培养基(SD₂ + 0.2mol/L 甘露醇 + 0.2mol/L 山梨醇，pH 5.8)中央，处理4～6小时后供基因枪轰击之用。

按45μg/枪取适量金粉（直径1.0μm）悬浮液到1.5mL离心管中，14,000rpm离心30秒，去上清，加入1mL无离子水，14,000rpm离心5分钟，去上清，依次加入220μL无菌水、250μL CaCl₂(2.5 mol/L)、50μL亚精胺(0.1mol/L)、质粒DNA溶液（浓度1μg /枪），将金粉和DNA的混合液振荡10分钟，14,000rpm离心5分钟去上清，加入600μL无水乙醇打散沉淀，14,000rpm离心1分钟后去乙醇，再加入无水乙醇（10μL /枪 ），准备用于基因枪轰击。

采用PDS-1000/He 基因枪（Bia-Rod公司生产）轰击经高渗培养基处理好的小麦幼胚愈伤组织，轰击参数为，气体压力1100Psi,真空度28 inch Hg。轰击后的愈伤组织继续在原高渗培养基上培养16～18小时，然后转入不加抗性筛选剂的SD₂培养基中黑暗条件下（25 ℃）恢复培养2周。

恢复培养2周后，将愈伤组织转入分化培养基(1/2MS + 1.0 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA + Bialaphos 3-5mg/L， pH 5.8)上培养4～6周（25℃、10小时光照/天），愈伤组织分化出绿芽以后，将再生芽转移到无激素的幼芽伸长培养基(1/2MS + Bialaphos 3-4mg/L， pH 5.8)上，光照与温度同前，待分化出的抗性苗生长到1～2cm时，转移到壮苗培养基(1/2MS + IAA 0.5mg/L + 多效脞0.5mg/L，pH 5.8)上壮苗，再生植株生长到适宜大小（苗高6～8cm,根系较好）时移入培养钵，幼苗在4-8℃进行绿体春化20天后移栽到温室。共得到6株生长正常的抗性再生植株。

将得到的6株生长正常的抗性再生植株编为1-6号，用CTAB法提取其叶片基因组DNA。

用表达载体pAHC25-Sec中的BAR基因和Ubiquitin启动子的引物对上述抗性再生植株的基因组DNA进行PCR检测，以未转化的兰考906植株作阴性对照（编号为A），以质粒pAHC25-Sec作阳性对照（编号为B），引物序列为：BAR-p1：gTCTgCACCATCgTCAACC，BAR-p2：gAAgTCCAgCTgCCAgAAAC和Ubi-p1:CTCgCCCgCCgTAATAAATAgACA，Ubi-p2: TAAAggAAAAgggCAAACCAAACC；采用25μl的反应体系，其中含有10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, pH 9.0, 每种dNTP 0.1 mM, 正反向引物各0.4 μM， 1.5 U Taq DNA 聚合酶和约100 ng的基因组DNA或1ng的质粒DNA。反应程序为：94℃预变性3分钟，94℃变性45秒、58℃退火45秒，72℃延伸1分钟，循环35次，然后再延伸7分钟。

结果显示，在6株抗性再生植株中检测到2株BAR基因和Ubiquitin启动子均呈阳性的植株，见图1和图2中的3号和5号。

用天根生化科技（北京）有限生产的RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒提取上述2个阳性转基因植株的T2代纯合转基因株系和未转化阴性对照植株开花15天后的籽粒总RNA，并用Quant cDNA第一链合成试剂盒（天根生化科技有限公司）反转录成cDNA，以反转录后的cDNA为模板，ω-sec-P1：accttcctcatctttgtcct和ω-sec-P2 ：ccgatgcctataccactact为引物检测ω-黑麦碱基因的表达，扩增产物包括了ω-黑麦碱基因成熟蛋白编码区的完整序列。检测时以Actin基因作为内参，内参引物为Actin-F: ggAATCCATgAgACCACCTAC和Actin-R: gACCCAgACAACTCgCAAC。 反应参数为：94℃预变性3分钟，94℃变性45秒、65℃退火45秒，72℃延伸1.5分钟，循环30次，然后72℃延伸7分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像仪照相，并用图像分析软件分析扩增产物的相对含量。

结果表明，与未转基因的A对照相比，3号和5号两个转基因植株的T2代纯合株系扩增产物的量均显著下降，分别为对照的40%和25%，说明在转基因株系中产生了转录后基因沉默，内源ω-黑麦碱基因转录产生的mRNA被大量降解，具有完整功能的mRNA的数量大幅减少。

进一步用SDS-PAGE电泳（Hussain和Lukow,1994,Euphytica, 78:109-134）对上述3号和5号两个转基因植株的T2代纯合转基因株系及非转基因对照A植株成熟种子中ω-黑麦碱的表达量进行分析，发现转基因株系中ω-黑麦碱的表达量明显降低，凝胶电泳经凝胶成像仪照相后，用图像分析软件分析ω-黑麦碱条带的相对表达量，得出这两个T2代转基因株系的种子中ω-黑麦碱的表达量仅为对照的30%和20%，说明本发明可用来获得ω-黑麦碱基因表达受抑制的转基因小麦1B/1R易位系。