哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)蛋白的截短变体

发明领域

本发明涉及哺乳动物雷帕霉素(rapamycin)靶标(mTOR)蛋白的截短变体。

发明背景

哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)为丝氨酸/苏氨酸激酶，其属于PI3K相关激酶大家族，该家族还包括DNA依赖性蛋白激酶ATM和ATR。生物化学和遗传学研究证明，mTOR将生长因子刺激、能量和营养有效性结合在一起，以调节负责细胞生长、细胞大小和细胞周期进程的生物合成过程。最近十年一直在广泛研究响应各种胞外信号的mTOR激酶活性调节作用。大量具有各种酶活性、支架功能和连接功能(adaptor function)的细胞蛋白参与对mTOR活性进行信号传导并调节mTOR活性，这些蛋白包括蛋白激酶PKB/Akt和AMPK、肿瘤抑制剂PTEN和结节性硬化复合体TSC1/2、小GTP-结合蛋白Rheb、支架蛋白Raptor和Rictor。mTOR处于活化状态时，通过使主要下游靶标例如S6K、4E-BP1和PKB/Akt磷酸化来转导信号和代谢信息。不同实验室的研究指出，存在两种功能上不同的mTOR复合体，称为mTOR复合体1(mTORC1)和mTORC2。mTORC1含有核心组分mTOR、raptor和mLST8/G L，并对雷帕霉素敏感。mTORC2被认为对雷帕霉素不敏感，并含有mTOR、Rictor和mLST8/G L。目前在大量临床试验中评价雷帕霉素及其类似物为抗癌药物。另外，雷帕霉素被广泛用于涂覆支架，以在冠状动脉成形术后减少装支架后再狭窄。与具有两个TOR基因的酵母菌相反，哺乳动物只具有一个基因，已知其编码分子量大约280kDa的单一多肽。

mTOR的一个重要的下游靶标为S6K。S6激酶(p70S6激酶(p70^S6k))负责核糖体S6蛋白的S6磷酸化，S6蛋白是真核核糖体(即负责mRNA翻译和蛋白质合成的细胞器)的40S亚单位的组分。S6K还被认为是哺乳动物细胞中主要的生理学上的S6激酶(Proud，1996 Trends Biochem.Sci.21：181-185)。40S核糖体蛋白S6是真核核糖体的40S亚单位的组分。S6蛋白因响应某些细胞信号传导事件而被磷酸化，这些事件例如有激素或生长因子诱导的细胞增殖。

S6激酶受到多种生长因子例如胰岛素和促细胞分裂原激活(Alessi等，1998 Curr.Biol.8：69-81)。业已确定出调节S6激酶活性的某些药物，其中包括雷帕霉素，雷帕霉素是S6激酶的最有效的抑制剂(Pullen等，1997 FEBS Letters 410：78-82)。美国专利第6,830,909号公开了S6激酶α和S6激酶β的结构和某些功能，该专利以其整体在此引作参考。

已显示S6激酶既被磷酸化也被乙酰化。研究发现S6激酶蛋白可通过p300和P/CAF乙酰转移酶在体内和体外乙酰化。更准确地说，在S6K乙酰化作用提高(即存在HDAC抑制剂/过量表达p300)的条件下，S6激酶活性和412磷酸化作用降低。P-环赖氨酸突变(由p300在体外乙酰化)为谷氨酰胺(模拟乙酰化作用)，能导致S6K完全失活和412磷酸化失败。还证明S6K2(S6Kβ)具有AT-hook DNA结合基序。因此，S6激酶2蛋白结合DNA并藉此被活化，进而刺激其激酶活性。因此，S6K2被认为因响应促细胞分裂原和营养素而转导促生长作用。当S6K2与DNA形成复合体并由该相互作用激活时，可涉及通过磷酸化作用调节转录因子和/或染色质重建蛋白。S6激酶蛋白活性的调节及相关方法公开于WO 2007/019421，该专利以其整体在此引作参考。

发明简述

本发明涉及最近发现的mTOR的剪接形式，称作mTORβ。具体而言，本发明提供使S6K1和/或4E-BP1磷酸化的分离的多肽，所述多肽选自：

(a)包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的分离的多肽；

(b)包含与SEQ ID NO：2氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的分离的多肽；和

(c)包含由SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列的分离的多肽。

本发明还提供：

-选自以下的分离的多核苷酸：

(a)编码本发明多肽的多核苷酸；

(b)包含SEQ ID NO：1核苷酸序列或其互补体的多核苷酸；

(c)包含与SEQ ID No：1的完整邻接序列具有至少80％序列同一性并且编码使S6K1和/或4E-BP1磷酸化的蛋白的多核苷酸；和

(d)与SEQ ID NO：1核苷酸序列或其互补体在68℃采用0.1×SSC条件下杂交的分离的核酸分子，该核酸分子编码使S6K1和/或4E-BP1磷酸化的蛋白。

-包含本发明多核苷酸的载体。

-包含本发明多肽、本发明多核苷酸或本发明载体的宿主细胞。

-特异性结合本发明多肽的分离的抗体。

-用于制备多肽的方法，该方法包括在表达本发明多肽或表达由本发明多核苷酸编码的多肽的条件下培养本发明宿主细胞。

-筛选调节mTORβ活性的作用剂的方法，该方法包括以下步骤：

(a)使本发明多肽与测试作用剂接触；和

(b)检测所述多肽活性的任何变化，其中活性变化表明作用剂能够调节mTORβ活性。

-筛选调节mTORβ表达和/或活性的作用剂的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供权利要求5的宿主细胞，该细胞包含或表达本发明多肽或由本发明多核苷酸编码的多肽；

(b)使所述宿主细胞与测试作用剂接触；和

(c)检测所述多肽表达和/或活性的任何变化，其中表达和/或活性变化表明作用剂能够调节mTORβ表达和/或活性。

-治疗与本发明多肽异常表达有关的疾病的方法，该方法包括将有效量的作用剂给予需要治疗的对象，其中所述作用剂改变所述多肽的活性和/或表达。

-用于治疗所述多肽表达异常相关疾病的改变本发明多肽活性和/或表达的作用剂。

附图简述

图1显示用C-末端和F11抗mTOR抗体在大鼠组织中进行的mTOR表达的蛋白印迹分析。通过SDS-PAGE分离大鼠组织的蛋白提取物(30μg)，转移到PVDF膜上，并用来自Cell Signaling的C-末端mTOR多克隆抗体探测(上图)。然后剥洗(strip)该膜，用抗肌动蛋白抗体重新探测(下图)。

图2显示在人组织中mTOR表达的RNA印迹分析。剥洗印迹，重新探测β肌动蛋白的表达(下图)。

图3显示用C-末端抗mTOR抗体对来自Hep2G、Hek293和MCF7细胞的mTORβ进行的免疫沉淀。用C-末端抗mTOR抗体(CellSignaling)与Hep2G、Hek293和MCF7细胞的裂解液进行免疫沉淀，并用N-末端抗mTOR抗体(Santa Cruz)在蛋白印迹中探测免疫复合体。

图4显示通过PCR对人细胞系中潜在的mTOR剪接变体进行的鉴定。图4A显示来自Hep2G、HEK293和MCF7的总RNA和mTORβRNA的琼脂糖凝胶。纯化了来自Hep2G、HEK293和MCF7细胞系的总RNA，并将其转换为第一链DNA。将一组mTOR特异性引物用于PCR反应中，以搜寻潜在的剪接变体。在2％琼脂糖凝胶中电泳分离所扩增的片段。从凝胶上切下最显著的条带，进行序列分析。一组引物(N1和C3)从三种细胞系中都一致地扩增得到100bp的片段。扩增了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)和β肌动蛋白特定片段，将其用作第一链DNA的加样和质量对照。图4B显示用N1和C3mTOR特异性引物扩增的100bp PCR片段的序列比对。对所扩增得片段进行测序，由Clustal W程序进行比对。由箭头指出潜在剪接融合的位置。图4C显示用N1和C3mTOR特异性引物扩增的100bp PCR产物的氨基酸序列。箭头指出潜在剪接融合的位置。在对应于mTOR的N-末端区和FATN结构域的序列下面画线。

图5显示全长mTORα和mTORβ剪接同等型(isoform)的结构域组织。指出了各个结构域位置，包括其氨基酸位置。指出了对应于抗mTOR抗体的表位的地点。在介导已知的mTOR结合配偶体相互作用的区域下画线。有20个37-43个氨基酸的HEAT基序(Huntingtin、EF3、PP2A的A亚单位和Tor)，每一个都参与蛋白间的相互作用。HEAT18和19足以将mTOR靶向内质网或高尔基体。mTOR经由这些HEAT区域二聚体化。FAT结构域＝FRAP/ATM/TRAPP；FATN＝FAT结构域N-末端；FATC＝FAT结构域的C-末端。发现FATC结构域对于mTOR激酶活性和功能必不可少。FRB(FKBP12-雷帕霉素结合)结构域是保守的11kDa区域，是FKBP12-雷帕霉素结合的充分必要区域。KD＝激酶结构域，认为其是PI3K相关结构域。RD＝调节结构域。

图6显示mTORβ因响应血清刺激而在与完整mTORα氨基酸序列的Ser2448对应的丝氨酸残基处被磷酸化，并在体外激酶测定中使S6K1和4E-BP1磷酸化。图6A显示用pcDNA 3.1mTORβ转染后表达mTORβ的细胞的凝胶。用pcDNA3.1或pcDNA 3.1m TORβ转染HEK293细胞。一天后，让细胞饥饿24小时，然后用10％胎牛血清刺激1小时。在刺激前30分钟加入雷帕霉素(10nM)。裂解细胞，通过SDS-PAGE分离，并用C-末端抗mTOR抗体和抗pS2448mTOR抗体进行免疫印迹。图6B显示mTOR体外激酶测定的结果。用pcDNA3.1、pcDNA 3.1/FLAG-mTORβ或pcDNA 3.1/FLAG-mTORa转染HEK293细胞。两天后，裂解细胞，用抗FLAG抗体进行免疫沉淀。在mTOR体外激酶测定中使用免疫复合体，且用His-4E-BP1和His-S6K1C作为底物。通过SDS-PAGE分离激酶反应物，用针对4E-BP1 p65和S6K1p389的磷酸化特异性抗体(phosphospecific antibody)进行免疫印迹。通过用抗FLAG抗体进行的蛋白印迹测量免疫沉淀的FLAG-mTORα和FLAG-mTORβ的水平。

图7显示mTORβ与Raptor、Rictor和GβL的特异性相互作用。用pcDNA3.1-mTORβ-FLAG和pRK-Raptor-HA或pcDNA3.1-mTORβ-FLAG和pRK-Rictor-Myc或pcDNA3.1-mTORβ-FLAG和pcRK-GβL转染HEK293细胞。用抗FLAG抗体或对照非特异性抗体对所裂解的细胞上清液进行免疫沉淀。通过SDS-PAGE分离免疫复合体或来自转染细胞的总细胞裂解液(15μg)，并在蛋白印迹中用抗HA、抗Rictor或抗GβL抗体探测。

图8显示，与mTORα比较，mTORβ对雷帕霉素敏感性更低。用pcDNA3.1、pcDNA 3.1mTORβ或pcDNA 3.1mTORα转染HEK293细胞。一天后，让细胞饥饿24小时，然后用10％血清刺激1小时。在刺激前30分钟加入各种浓度的雷帕霉素。裂解细胞，由SDS-PAGE分离，并用C-末端mTOR抗体、抗肌动蛋白抗体和不同的磷酸化特异性抗体进行免疫印迹。

图9显示mTORβ的亚细胞定位。用ProteoExstract提取试剂盒(Calbiochem)分级分离指数生长的HEK293细胞。用抗mTOR C-末端抗体从所有分离物中免疫沉淀mTORα和mTORβ，通过SDS-PAGE分离免疫复合体，并用抗mTOR N-末端抗体进行免疫印迹。将抗4EBP1抗体、抗HSP60抗体和抗c-Jun抗体分别用作细胞质、细胞膜和细胞核分离物的对照。

图10显示mTORβ而非mTORα的过量表达诱导细胞增殖。将过量表达mTORβwt(野生型)、mTORαwt或EGFP的Hek293稳定细胞系以不同密度(每孔250、500、1000和2000个细胞)接种到96孔板，在标准条件下培养7天。随后通过基于刃天青的测定来测量各孔的细胞数目。用来自6个独立实验的数据计算各细胞系的标准化的生长曲线(A)。用针对c-myc及其转录靶标的抗体进行稳定细胞系的总细胞裂解液的蛋白印迹分析(B)。光密度测量蛋白水平，以肌动蛋白标准化，计算相对于表达EGFP的稳定细胞系的倍数(C)。

图11显示诱导增殖需要mTORβ激酶活性。将过量表达mTORβwt、无激酶活性的mTORβ或EGFP的Hek293稳定细胞系以不同密度(每孔1000、2000、4000和8000个细胞)接种到96孔板，在标准条件下培养5天。随后通过基于刃天青的测定来测量各孔的细胞数目。用来自6个独立实验的数据计算各细胞系的标准化生长曲线(A)。用针对c-myc及其转录靶标的抗体进行稳定细胞系的总细胞裂解液的蛋白印迹分析。光密度测量蛋白水平，以肌动蛋白标准化，并计算相对于表达EGFP的稳定细胞系的倍数(B)。

图12显示mTORβ对细胞周期G1的进展至关重要。用BrdU对稳定过量表达mTORβ、mTORα或EGFP的HEK293细胞进行脉冲标记30分钟，在24小时内每2小时追踪一次。通过FACS分析测量掺入的BrdU。图表表示对各个细胞系所观察到的细胞周期的G1、S和G2期的持续时间(duration)。标准差，p＝0.05。

图13显示mTORβ的过量表达保护细胞免遭饥饿诱导的细胞死亡(A)。mTORβ激酶活性为介导促存活作用(pro-survival effect)所需(B)。将过量表达mTORβwt、mTORαwt、无激酶活性的mTORβ或EGFP的Hek293稳定细胞系血清饥饿60小时。通过锥虫蓝染料排除测定法评估细胞存活率。数据为5个实验的平均值±SE。*P值≤0.01。

图14显示mTORβ过量表达导致细胞致癌可能性增加。将稳定过量表达mTORβ、mTORα或EGFP的HEK293细胞铺板在培养基中的薄层琼脂糖上。14天后，用MTT对染色(A)。用Quantity One软件(Bio-Rad)计集落数，并用倍数作图(B)。数据为4个实验的平均值±SE。*P值≤0.01。

序列表简述

SEQ ID NO：1为编码人mTORβ剪接变体的多核苷酸序列，而SEQ ID NO：2为人mTORβ蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3为编码全长人mTORα蛋白的多核苷酸序列，而SEQ ID NO：4为人mTORα蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID No 5-8为用于实施例4的引物。

SEQ ID NO：9为通过PCR从人MCF7、Keh293和HEP2G细胞系产生的扩增片段，而SEQ ID NO：10为由SEQ ID NO：9编码的氨基酸序列。

发明详述

本发明基于对哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)蛋白的新型剪接形式的鉴定和表征。这是首次显示mTOR新型剪接形式(下文称为mTORβ的存在。本发明基于对mTORβ蛋白的测定及其活性的研究。

业已确定mTORβ为当前已知的mTOR(下文中称为mTORα)的N-末端氨基酸1-23和C-末端氨基酸1867-2549的剪接融合体(splicefusion)，这产生长706个氨基酸的融合蛋白(SEQ ID NO：2)。在融合蛋白中，缺失了HEAT和FAT调节结构域。还显示对应于mTORβ的mRNA转录体在心脏和肝脏中高度表达，同时肾脏、肝脏、血液、小肠和大肠具有最高的mTORβ蛋白水平。此外，与全长mTORα相似，剪接形式也能够与呈递底物的分子Raptor、Rictor和GL缔合。mTORβ还能在体外使S6K1和4E-BP1磷酸化。另外，业已显示mTORβ因响应血清刺激而在对应于完整mTORα氨基酸序列Ser2448(S2448)的丝氨酸残基(mTORβ的Ser605)处被磷酸化。mTORβ在对应于完整mTORα氨基酸序列Ser2448的丝氨酸残基处的磷酸化作用对雷帕霉素敏感。此外，当与mTORα比较时，mTORβ显示出对雷帕霉素较不敏感。

本文所用术语“mTORβ”指mTOR的剪接形式。例如，本发明人发现SEQ ID NO：2多肽为天然存在的人mTORβ多肽。据认为，该蛋白长706个氨基酸，由长约2121个核苷酸的SEQ ID NO：1核酸编码。本文所用术语“mTORα”指全长的哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)蛋白。例如，人mTORα多肽被认为是大约2549个氨基酸长的蛋白(SEQID NO：4)，并被认为由SEQ ID NO：3核苷酸编码。

多肽

本发明提供了mTORβ多肽。

本文所用“多肽”就其最广泛的意义而言是指两个或多个亚单位氨基酸(subunit amino acid)、氨基酸类似物或其它肽模拟物化合物。因此术语“多肽”包括短肽序列以及较长的多肽和蛋白。本文所用术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L两种旋光异构体及氨基酸类似物和肽模拟物。

本发明多肽优选以分离的形式提供。当采用物理、机械或化学方法从通常与蛋白缔合的细胞组成中移出蛋白时，认为本文所用蛋白得到分离。技术人员可采用标准纯化方法容易地获得分离的蛋白。

本发明包括mTORβ多肽。如本文所述，本发明mTORβ多肽可为天然存在的mTORβ多肽，或可为其变体、衍生物或片段。在本发明一个实施方案中，mTORβ多肽由SEQ ID NO：2氨基酸序列组成、基本上由SEQ ID NO：2氨基酸序列组成，或包含SEQ ID NO：2氨基酸序列。在本发明一个实施方案中，mTORβ多肽是mTORα的N-末端氨基酸1-23和C-末端氨基酸1867-2549之间的剪接融合体，这些氨基酸例如是在SEQ ID NO：4的mTORα多肽中的那些氨基酸。在本发明另一个实施方案中，mTORβ多肽由、基本上由以下序列组成或包含以下序列并且使S6K1和/或4E-BP1磷酸化：与SEQ ID NO：2氨基酸序列具有至少75％或至少95％序列同一性的序列。

本发明多肽可由本文所述的本发明多核苷酸编码，例如由SEQ IDNO：1核苷酸序列或由包含SEQ ID NO：1的多核苷酸编码。本发明多肽可由与SEQ ID NO：1完整邻接序列具有至少80％或至少95％序列同一性的多核苷酸编码，或由在68℃采用0.1x SSC的条件下与SEQ IDNO：1多核苷酸杂交的多核苷酸编码。由所述多核苷酸编码的多肽将能够使S6K1和/或4E-BP1磷酸化。

mTORβ多肽可为天然存在的mTORβ多肽或其变体、衍生物或片段。天然存在的mTORβ多肽可为在任何物种中天然表达的mTORβ多肽，优选在哺乳动物中表达。例如，合适的天然存在的mTORβ多肽可为来自人、非人的灵长类、啮齿动物(例如大鼠或小鼠)、兔、马或家畜动物(例如山羊、绵羊、猪或牛)等的哺乳动物mTORβ多肽。mTORβ多肽可为兔、小鼠、大鼠、猪、牛、绵羊、马、人或非人灵长类mTORβ多肽。优选mTORβ多肽为人mTORβ多肽。例如，人mTORβ多肽氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。编码人mTORβ多肽的多核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明mTORβ多肽可为任何所述天然存在的mTORβ多肽，例如人多肽，或可为其等位基因变体。等位基因变体尽管具有与上述的稍微不同的氨基酸序列，但仍具有与所公开的蛋白有关的相同或相似的生物学功能。

mTORβ多肽可为变体多肽，例如天然存在的mTORβ肽的衍生物、类似物、多肽片段或模拟物。所述变体多肽优选保留与天然存在的mTORβ肽相同的生物学功能或活性。活性可为天然存在的mTORβ多肽所具有的任何活性。本文公开了mTORβ的多种活性。合适的变体多肽可具有这些活性中的任何一种或多种。例如，变体多肽可保留被乙酰化的能力和/或使第二种蛋白磷酸化的能力和/或结合DNA的能力。例如，合适的变体多肽可诱导cMyc表达(impression)。合适的变体多肽可在对应于SEQ ID NO：4完整mTORα氨基酸序列的S2448的丝氨酸残基(SEQ ID NO：2的mTORβ多肽Ser605处被磷酸化。合适的变体多肽可具有使S6K1磷酸化的能力。合适的变体多肽可具有使4E-BP1磷酸化的能力。合适的变体多肽可具有使S6K1和4E-BP1磷酸化的能力。合适的变体多肽可与Raptor、Rictor和GβL中的一个、两个或全部三个起作用。合适的变体多肽可诱导细胞增殖。合适的变体多肽可保护细胞免遭饥饿诱导的细胞死亡。合适的变体多肽可增加细胞的致癌可能性。合适的变体多肽可缩短细胞周期G1期的长度。本文阐述了评估这些活性的方法，其将易于为技术人员所理解。实施例显示如何评估所述活性，并用SEQ ID NO：2多肽作为实例。这些方法可易于在本文所述其它多肽中使用。

本发明mTORβ多肽可保留全长mTORα多肽的一种或多种功能。这些功能可包括以下中的一种或多种：激酶活性；通过在对应于SEQID NO：4的mTORα氨基酸序列的S2448的丝氨酸残基(SEQ ID NO：2的mTORβ多肽的Ser605处的磷酸化来活化；使其它蛋白磷酸化的能力，例如使S6K1磷酸化的能力和/或使4E-BP1磷酸化的能力；与Raptor、Rictor和GβL中的一个、两个或所有三个相互作用或结合的能力。

本发明mTORβ多肽可保留不同于全长mTORα多肽的天然存在的mTORβ的至少一种活性。例如，如本文所述，表达mTORβ的细胞比表达mTORα的细胞增殖得更快；表达mTORβ而非mTORα导致诱导c-Myc蛋白表达；表达mTORβ的细胞具有比表达mTORα的细胞更短的G1期；表达mTORβ而非mTORα保护细胞抵抗血清饥饿作用；与表达mTORα的细胞相比，mTORβ表达导致细胞致癌可能性增加。当与mTORα多肽比较时，本发明mTORβ多肽可保留这些差异中的任何一种或多种。

多肽变体包括但不限于天然存在的mTORβ多肽(例如SEQ ID NO：2多肽)的缺失、添加或取代变体。例如，合适的变体可为所述序列的取代、缺失或添加变体，或可为任何所述序列的片段。变体多肽可包含天然存在的mTORβ多肽序列(例如SEQ ID NO：2)的1、2、3、4、5、至多10、至多20、至多30、至多40、至多50、至多75个或更多个氨基酸的取代和/或缺失。

“取代”变体优选涉及用相同数量的氨基酸置换一个或多个氨基酸并且进行保守氨基酸取代。多肽可具有一个或多个其它氨基酸对一个或多个氨基酸的保守取代。本领域技术人员知道不同氨基酸具有相似特性。多肽的一个或多个这样的氨基酸通常可被一个或多个其它这样的氨基酸取代而不会消除该多肽期需的性质(例如乙酰转移酶活性)。例如，氨基酸可被具有相似性质的备选氨基酸取代，后者例如为另一个碱性氨基酸、另一个酸性氨基酸、另一个中性氨基酸、另一个带电荷的氨基酸、另一个亲水性氨基酸、另一个疏水性氨基酸、另一个极性氨基酸、另一个芳香族氨基酸或另一个脂肪族氨基酸。可用于选择合适取代的20种主要氨基酸的某些性质如下：

例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等氨基酸通常可彼此取代(具有脂肪族侧链的氨基酸)。在这些可能的取代中，优选甘氨酸和丙氨酸用于彼此取代(因为它们具有相对短的侧链)，优选缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸用于彼此取代(因为它们具有疏水的较大的脂肪族侧链)。通常可彼此取代的其它氨基酸包括：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺基侧链的氨基酸)；和半胱氨酸及甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。

本文所用保守变体指不对蛋白的生物学功能或活性(例如上文所述的功能/活性)产生不利影响的氨基酸序列的改变。例如，保守变体可保留其被乙酰化的能力、使第二种蛋白磷酸化的能力和结合DNA的能力。当所改变的序列阻止或破坏与所述蛋白有关的生物学功能或活性时，认为取代、插入或缺失对该蛋白产生不利影响。例如，可改变蛋白的总电荷、结构或疏水/亲水性质，而不对生物学活性产生不利影响。因此，可改变氨基酸序列，例如以便赋予所述多肽更大的疏水性或亲水性，而不对所述蛋白的生物学活性产生不利影响。

变体多肽可具有以下氨基酸序列：该氨基酸序列与天然存在的mTORβ多肽序列(例如与SEQ ID NO：2所示的完整序列)具有至少约75％氨基酸序列同一性、更优选至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％的序列同一性，最优选至少约99％序列同一性。例如，人、小鼠和大鼠TOR在蛋白水平上共享95％同一性。这些氨基酸同一性水平中的任一种可在天然存在的mTORβ多肽序列全长中存在，或可在所述全长序列的分段存在，例如在其50、100、150、200个或更多个氨基酸中存在。可在mTORβ多肽全部邻接序列中存在这些氨基酸同一性水平中的任一种。序列同一性水平可在mTORβ序列的不同区域变化。例如，变体mTORβ可在天然存在的mTORβ多肽全长中具有至少75％的氨基酸同一性，但可在某些区域内具有更高的序列同一性水平。例如，这样的变体多肽可保留天然存在的序列的一个或多个保守结构域。

就上述序列而言，本文将同一性或同源性定义为：在对序列进行比对，需要时引入空位以得到最大百分比的同源性，并且不将任何保守取代考虑为序列同一性的部分后，候选序列中的与已知肽等同的氨基酸残基的百分比。融合蛋白或N-末端、C-末端或内部延伸、缺失或插入到多肽序列都不应该理解为影响同源性。

与氨基酸序列相联系的“序列同一性”指当用ClustalW(Thompson等，1994，上述)用以下参数进行评估时具有规定值的序列：两两比对的参数-方法：精确，矩阵：PAM，空位开放罚分：10.00，空位拓展罚分：0.10；多重比对参数-矩阵：PAM，空位开放罚分：10.00，推迟的％同一性(％identity for delay)：30，末端空位罚分(penalize endgap)：开，空位分隔距离(gap separation distance)：0，负矩阵：无，空位拓展罚分：0.20，残基特异性空位罚分：开，亲水空位罚分：开，亲水残基：GPSNDQEKR。特定残基处的序列同一性意欲包括已经被简单衍生的同样的残基。

优选的“衍生物”或“变体”包括以下衍生物或变体：其中代替天然存在的氨基酸出现在序列中的氨基酸是其结构类似物。序列中使用的氨基酸也可被衍生或修饰，例如被标记，前提是所述肽的功能没有受到显著的不利影响。

如上所述的衍生物和变体可在合成肽中制备，或通过制备后修饰来制备，或当所述肽为重组形式时，用定点诱变、随机诱变或酶切和/或核酸连接等已知技术来制备。

多肽的缺失和插入变体在本发明范围内。氨基酸缺失可能是有利的，因为多肽的总长和分子量可能降低，但保留所需活性。这可使用于特定目的所需的多肽的量降低。“缺失”变体可包含个别氨基酸缺失、一小群氨基酸(例如2、3、4或5个氨基酸)缺失或较大的氨基酸区域(例如特定的氨基酸结构域)或其它特征(feature)的缺失。还可对多肽进行氨基酸插入。这可实施以改变多肽特性(例如有助于鉴定、纯化或表达)。用任何合适技术可提供如上所定义的相对于多肽序列掺入氨基酸变化(不管是取代、缺失或插入)的多肽。例如，可通过定点诱变提供掺入所需序列变化的核酸序列。然后将其用于表达在其氨基酸序列中具有相应变化的多肽。

本发明多肽包括天然存在的mTORβ分子(例如具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多核苷酸)及其任何氨基酸序列变体，所述变体中在所示的编码序列的内部或者N-或C-末端处已经插入一个或多个氨基酸残基。如上所解释，SEQ ID NO：2的mTORβ多肽通过将来自全长mTORα多肽的两个片段剪接到一起而形成。由此，SEQ ID NO：2包含SEQ ID NO：4的氨基酸1-23和1867-1549。变体mTORβ可包含来自另一mTORα多肽的等同片段，例如另一天然存在的mTORα多肽。相关多肽中的等同氨基酸可容易地由例如序列比对和比较来确定。因此，可通过将来自天然存在的mTORα多肽的N末端片段和C末端片段联合形成变体mTORβ。变体mTORβ多肽也可在来自所述N和C末端片段的序列中变化。例如，当与来自任何天然存在的mTORα多肽的相关N和C末端片段比较时，变体mTORβ多肽可具有上述任何程度的氨基酸序列同一性。

变体mTORβ可包含来自mTORα多肽的不同片段，所述片段可被剪接在一起形成具有上述mTORβ活性的多肽。

用SEQ ID NO：4的mTORα多肽为例，本发明mTORβ多肽可包含SEQ ID NO：4的氨基酸1-23，或可包含来自mTORα的N-末端的更多或更少的氨基酸。合适的mTORα片段可从SEQ ID NO：4的残基1开始，或可从随后的残基例如2、3、4、5、6位氨基酸或更后的氨基酸开始。合适的mTORα片段可在SEQ ID NO：4的残基23结束，或可在不同残基例如18、19、20、21、22、24、25、26、27或28位氨基酸或更前或更后的氨基酸残基结束。这些起点和终点的任何组合可用于形成合适的片段。来自mTORα的N末端的合适的片段长度可为例如15、17、18、20、21、22、23、24、25、27、30、35个或更多个氨基酸。

同样地，mTORβ多肽可包含SEQ ID NO：4的氨基酸1867-2549，或可包含来自mTORα的C-末端的更多或更少的氨基酸。mTORα的合适片段可从SEQ ID NO：4的残基1867开始；或可从不同残基例如1860、1861、1862、1863、1864、1865、1866、1868、1869、1870、1871、1872、1873位氨基酸或更前或更后的氨基酸开始。合适的mTORα片段可在SEQ ID NO：4的残基2549结束，或可在更前的残基例如2548、2547、2546、2545、2544位氨基酸或更前的氨基酸残基处结束。然而，优选mTORα的C-末端片段包括位于SEQ ID NO：4的氨基酸2517-2549的FATC结构域。这些起点和终点的任何组合可用于形成合适的片段。来自mTORα的C末端的合适的片段长度可为例如至多680、681、682、683、684、685、686、690、695、700个或更多个氨基酸。

mTORβ多肽可包含所述来自mTORα多肽的N-末端和C-末端片段的任何组合。可通过本文所述的取代、添加或缺失对来自天然存在的序列的所述片段进行进一步修饰。

如上所述，mTORβ多肽将保留mTORβ的至少一种功能/活性，例如mTORα的至少一种功能/活性。如图5所示，SEQ ID NO：2的mTORβ保留了来自mTORα的某些结构域，但缺少其它的结构域。例如，SEQID NO：2的mTORβ缺少来自mTORα的HEAT和FATN调节结构域。因此，似乎这些结构域对于mTORβ功能而言是多余的。因此，mTORβ多肽可缺少mTORα多肽的一个、多个或所有HEAT结构域。mTORβ可完全缺少HEAT功能结构域。mTORβ多肽可缺少mTORα多肽的FATN结构域。mTORβ多肽可缺少FAT功能结构域。

然而，SEQ ID NO：2的mTORβ多肽确实保留了mTORα的其它结构域。这些结构域的氨基酸或结构特征可负有mTORβ的各种活性。因此，mTORβ多肽可保留FRB结构域和/或激酶结构域(KD)和/或调节结构域和/或FATC结构域。FRB结构域是FKBP12-雷帕霉素结合的充分必要条件。mTORβ多肽可保留FRB结构域。mTORβ多肽可保留赋予FKBP12-雷帕霉素结合能力的备选结构域或变体结构域。所述激酶结构域为P13激酶相关结构域。mTORβ多肽可保留激酶结构域。mTORβ多肽可保留赋予P13激酶能力的备选结构域或变体结构域。FATC结构域对于mTOR激酶活性和功能必不可少。mTORβ多肽可保留FATC结构域。mTORβ多肽可保留赋予所述mTORβ激酶活性和功能的备选结构域或变体结构域。mTORβ多肽可保留mTORα的这些结构域中的两种或更多种，例如激酶结构域和FATC结构域二者都保留。mTORβ多肽还可保留用于Raptor和/或Rictor和/或GβL的功能性结合位点。

本发明多肽还包括天然存在的mTORβ分子(例如具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多核苷酸)和所示序列的氨基酸序列变体或它们的如上所定义的片段，所述片段已经被至少一个残基取代。所述片段也称为肽或多肽，可含有所述蛋白的功能区域，该区域确定为对应于已知蛋白结构域(例如AT-hook结构域以及明显的亲水性区域)的氨基酸序列的区域。所述区域都易于用常用的蛋白序列分析软件例如MacVector(Oxford Molecular)来确定。

可通过截短来制备本发明多肽“片段”，例如通过从多肽的N和/或C-末端除去一个或多个氨基酸来制备。可用该方法从所述N和/或C末端除去至多10、至多20、至多30、至多40、至多50、至多60、至多75个或更多个氨基酸。也可通过一个或多个内部缺失来产生片段。

本发明多肽可进一步包含添加的序列，例如由下述多核苷酸和载体编码的序列。所述多肽可包含引导序列，即位于或靠近多肽的氨基端的序列，该序列起靶向或调节所述多肽的作用。例如，多肽中可包含将该多肽靶向身体的特定组织的序列，或在多肽表达时帮助加工和折叠的序列。各种这样的序列在本领域中众所周知，可由技术人员根据例如该多肽所期需的性质及制备方法来选择。

为了鉴定或筛选多肽，或为了表达多肽，多肽可进一步包含标志物(tag)或标记物。合适的标记物包括放射性同位素，例如¹²⁵I、³²P或³⁵S、荧光标记物、酶标记物或其它蛋白标记物，例如生物素。合适的标志物可为能通过常规筛选方法鉴定的短氨基酸序列。例如，可包括由特定单克隆抗体识别的短氨基酸序列。

如本文所定义，本发明多肽可经化学修饰，例如翻译后修饰。例如，它们可被糖基化，或包含修饰的氨基酸残基。它们可为多种形式的多肽衍生物，包括酰胺及含多肽的缀合物。

化学修饰的肽还包括具有一个或多个通过侧链官能团反应而化学衍生的残基的肽。这样衍生的侧链基团包括已被衍生形成如下的基团：胺的盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基和甲酰基。可衍生游离羧基以形成盐、甲酯和乙酯或其它类型的酯或酰肼。可衍生游离羟基以形成O-酰基或O-烷基衍生物。可衍生组氨酸的咪唑氮以形成N-咪唑-苄基组氨酸。还可通过磷酸化作用(例如3氨基磷酸化)和通过糖基化作用(例如甘露糖基化)修饰肽。

化学修饰的肽还包括含有20种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸，或高丝氨酸可取代丝氨酸。

所涵盖的含多肽的变体和/或衍生物进一步包括：含有预定突变的那些变体和/或衍生物，所述突变通过例如同源重组、定点诱变或PCR诱变来实施；其它动物物种的相应的蛋白，这些物种包括但不限于兔、小鼠、大鼠、猪、牛、绵羊、马和非人灵长类；和等位基因或蛋白家族的其它天然存在的变体；和衍生物，在所述衍生物中可通过取代、化学、酶学或其它适当手段用不同于天然存在的氨基酸的部分(例如可检测的部分，例如酶或放射性同位素)对蛋白进行共价修饰。

mTORβ肽模拟物

可制备模拟mTORβ的三维结构的肽模拟物。所述肽模拟物与天然存在的肽相比可具有显著优点，包括例如生产更经济、化学稳定性更高、药理学性质(半衰期、吸收、效用、功效等)提高、特异性(例如广谱生物学活性)改变、抗原性降低及其它。

所述模拟物可具有上述mTORβ的任何一种或多种功能或活性。在一种形式中，模拟物为模拟mTORβ二级结构元件的含肽分子。在另一个实施方案中，模拟物能够结合cMyc。在备选实施方案中，模拟物能够与Raptor、Rictor和G L中任一种结合。在又一实施方案中，模拟物能够使S6K1和/或4E-BP1磷酸化。

肽模拟物应用的基本原理在于蛋白的肽骨架主要按以下形式存在：以促进分子的相互作用的方式来定向氨基酸侧链，所述相互作用类似于抗体与抗原的相互作用。预期肽模拟物能使分子的相互作用与天然分子相似。在另一形式中，肽类似物在药物工业中通常制成具有类似于模板肽的性质的非肽类药物。这些类型的非肽类化合物也称为肽模拟物(peptide mimetics或peptidomimetics)(Fauchere(1986)Adv.Drug Res.15，29-69；Veber & Freidinger(1985)Trends Neurosci.8、392-396；Evans等(1987)J.Med.Chem.30，1229-1239，其在此引作参考)，通常用计算机化分子模型帮助开发。

结构上与治疗有用的肽相似的肽模拟物可用于产生等同的治疗作用或预防作用。肽模拟物通常在结构上与范例多肽(paradigmpolypeptide)(即具有生物化学性质或药理活性的多肽)相似，但具有一个或多个通过本领域已知方法被化学连接(该连接通常在肽中不存在)任选地取代的肽连接。对肽模拟物的标记通常涉及将一个或多个标记物直接或通过间隔区(例如酰胺基)共价连接到该肽模拟物的非干扰位置，所述位置由定量的结构-活性数据和分子建模来预测。所述非干扰位置通常为并不构成与大分子直接接触的位置，所述大分子因被肽模拟物结合而产生治疗效果。肽模拟物的衍生(例如标记)不应该实质干扰肽模拟物的所需生物学或药理学活性。

可用组合化学形成药物库(drug library)来增强肽模拟物的应用。可通过确定增加或降低肽与例如肿瘤细胞的结合的氨基酸突变来辅助设计肽模拟物。可使用的方法包括酵母双杂交法(参见Chien等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，9578-9582)和使用噬菌体展示法。双杂交法检测酵母中蛋白之间的相互作用(Fields等(1989)Nature 340，245-246)。噬菌体展示法检测固定化的蛋白和在噬菌体表面表达的蛋白(例如λ和M13)之间的相互作用(Amberg等(1993)Strategies 6，2-4；Hogrefe等(1993)Gene 128，119-126)。这些方法使得可正选择及负选择肽与蛋白之间的相互作用，并鉴定决定这些相互作用的序列。

核酸分子

本发明提供编码mTORβ多肽的核酸分子。

本文所用术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，指任何长度的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸为脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和/或胞嘧啶)或核糖核苷酸或其类似物。所述多核苷酸可为单链形式或双链螺旋。该术语仅指分子的一级和二级结构，不限于任何特定的三级形式。多核苷酸的非限制性实例包括：基因、基因片段、DNA、信使RNA(mRNA)、cDNA、单链RNA或DNA、在线性DNA分子中存在的双链DNA(例如限制性片段)、病毒、染色体、重组多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列DNA、分离的任何序列RNA、核酸探针和引物。多核苷酸序列(例如双链DNA分子序列)在本文中可按照以下标准的常规方式来描述：仅提供沿着DNA的非转录链(例如具有与mRNA同源的序列的链)以5’-3’为方向的序列。

可以以分离或纯化的形式提供本发明多核苷酸。当将所述核酸分子基本上从编码其它多肽的杂质性核酸分子中分离时，认为本文所用核酸分子为“分离的”。

本发明多核苷酸可为编码如上所定义的本发明多肽的多核苷酸(例如RNA或DNA)。本发明多核苷酸可为与编码本发明多肽的核酸序列互补的多核苷酸。本发明多核苷酸可为在合适的严格性条件下与编码本发明多肽的核酸在可读框内杂交的多核苷酸。本发明多核苷酸可为编码与SEQ ID NO：2完整邻接氨基酸序列共享至少约75％或至少约95％同一性的多肽的多核苷酸。特别涵盖的是基因组DNA、cDNA、mRNA和反义分子，以及基于可供选择的骨架或包含可供选择的碱基(为天然来源或合成的)的核酸。然而，所述核酸进一步界定为新的并在任何现有技术中非显而易见的核酸，其包括：编码本发明蛋白的核酸，在合适的严格性条件下与编码本发明蛋白的核酸杂交的核酸，或与编码本发明蛋白的核酸互补的核酸。

本发明多核苷酸可为编码上述多肽的任何多核苷酸。本发明多核苷酸可为编码mTORβ多肽的任何多核苷酸。本发明多核苷酸可包含以下序列：编码SEQ ID NO：2的mTORβ多肽的序列，编码包含SEQ IDNO：2的mTORβ多肽或基本上由SEQ ID NO：2的mTORβ多肽组成的多肽的序列，或编码上述的它们的任何变体或片段的序列。本发明多核苷酸可包含以下序列、基本上由或由以下序列组成：SEQ ID NO：1核酸序列，或仅在遗传密码的丰余性上与SEQ ID NO：1不同的核酸序列(即编码与SEQ ID NO：1相同的多肽的另一核酸序列)。

“编码”所选多肽的核酸“编码序列”或核酸序列为：当置于合适的调控序列控制下时，在体内转录(在DNA情况下)和翻译(在mRNA情况下)为多肽的核酸分子(例如DNA或RNA)。编码序列的边界由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子确定。聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’端。为本发明目的，所述核酸序列可包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA、来自病毒或原核DNA或RNA的基因组序列和甚至是合成DNA。

本发明多核苷酸可为天然存在的编码mTORβ多肽的核酸。例如，SEQ ID NO：1多核苷酸编码SEQ ID NO：2的mTORβ多肽。本发明多核苷酸可为所述多肽的变体，或可编码上述天然存在的mTORβ多肽的变体。

本发明多核苷酸可编码以下多肽：与天然存在的mTORβ多肽(例如与SEQ ID NO：2的完整邻接氨基酸序列)具有至少约75％序列同一性，优选至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多、至少约97％或最优选至少约99％或更多同一性的多肽。本发明多核苷酸可与天然存在的mTORβ多核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1核苷酸序列)或编码SEQ ID NO：2多肽的其它多核苷酸共享(尤其是在可读框内)至少80％、优选至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多、至少约97％或更多和最优选99％序列同一性。

测定同源性或同一性的方法在本领域众所周知，其应为本发明领域的技术人员了解，同源性基于核酸同一性来计算。所述同源性可在至少15、优选至少30、例如至少40、60、100、200个或更多个邻接核苷酸的区域内存在。所述同源性可存在于完整长度的未修饰的mTORβ多核苷酸或多肽序列内。例如，UWGCG软件包提供可用于计算同源性的BESTFIT程序(例如以其缺省设置使用)(Devereux等(1984)Nucleic Acids Research 12，第387-395页)。例如阐述于AltschulS.F.(1993)J Mol Evol 36：290-300、Altschul，S，F等(1990)J Mol Biol215：403-10的PILEUP和BLAST算法也可用于计算同源性或排列序列(通常以其缺省设置使用)。

在核苷酸或氨基酸序列水平上的同源性或序列同一性优选通过BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析用由程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx等采用的算法来确定(参见Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25，3389-3402和Karlin等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，2264-2268，二者全部在此引作参考)序列相似性搜索。BLAST程序所用的方法首先考虑查询序列与数据库序列之间的含空位(非邻接)和不含空位(邻接)的相似区段，然后评估所有被确定的配对的统计学显著性，最后仅总结出那些满足预先选定的显著性阈值的配对。关于序列数据库相似性搜索的基本论点的讨论，参见Altschul等(1994)Nature genetics 6，119-129，其全部内容在此引作参考。用于柱状图(histogram)、描述、比对、期望值(expect)(即用于报告与数据库序列配对的统计学显著性阈值)、截断值、矩阵和过滤器(低复杂度)等的搜索参数为缺省设置。blastp、blastx、tblastn和tblastx所用的缺省计分矩阵为BLOSUM62矩阵(Henikoff等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10915-10919，全部在此引作参考)，该矩阵被推荐用于超过85个核苷酸或氨基酸长度的查询序列。

对于blastn，记分矩阵由M(即配对残基对的得分)与N(即错配残基对的罚分)之比来设定，其中M和N的缺省值分别为+5和-4。如下调整了四个blastn参数：Q＝10(空位生成罚分(gap creation penalty))；R＝10(空位拓展罚分)；闪烁(wink)＝1(沿查询序列在每一闪烁处产生字击(word hit))；和空位宽度(gapw)＝16(设定窗口宽度，在该窗口宽度内产生有空位的比对)。等同的Blastp参数设置为Q＝9；R＝2；闪烁＝1；和空位宽度＝32。在GCG软件包版本10.0中可得到的序列之间的Bestfit比较使用了DNA参数GAP＝50(空位生成罚分)和LEN＝3(空位延伸罚分)，蛋白比较中的等同设置为GAP＝8和LEN＝2。

变体多核苷酸可与相关多核苷酸序列有以下不同：前者具有至多3、至多5、至多10、至多15、至多20、至多30、至多50、至多100个或更多个突变(每一个突变可为取代、缺失或插入)。可在变体的至少30个(例如至少40、60或100个或更多个)邻接核苷酸的区域内或在变体或变体所衍生自的多核苷酸全长内测定这些突变。

本发明变体多核苷酸可以以显著高于背景的水平与mTORβ多核苷酸或其任何互补体杂交，所述mTORβ多核苷酸例如天然存在的mTORβ多核苷酸，例如SEQ ID NO：1的多核苷酸。由变体和原始多核苷酸之间的相互作用产生的信号水平通常为“背景杂交”的至少10倍、优选至少100倍强度。可例如通过放射性标记探针(例如用³²P)来测量相互作用的强度。所述变体可编码或可不编码本发明多肽。优选的分子为与SEQ ID NO：1互补体杂交并编码功能蛋白(例如上文所定义的mTORβ多肽)的分子。甚至更优选的杂交分子为在上述条件下与SEQID NO：1的可读框的互补链杂交的分子。

所述杂交优选在严格条件下发生。“严格条件”是如下条件：(1)采用低离子浓度和高温用于洗涤，例如，0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，至少50℃的温度；或(2)在42℃的杂交期间采用诸如甲酰胺等的变性剂，例如50％(vol/vol)甲酰胺/0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)与750mMNaCl、75mM柠檬酸钠。另一实例为在50％甲酰胺、5×SSC(0.75MNaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt溶液、超声化鲑精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖中于至少42℃温度下杂交，且在42℃下于0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤。技术人员可容易地确定并适当改变该严格性条件以得到清晰可检测的杂交信号。

本发明还提供了编码核酸分子的片段。因此，本发明多核苷酸可为本文所述任何多核苷酸的片段，或可编码上述片段多肽。本文所用编码核酸分子片段指整个蛋白的编码序列的小部分。片段大小由预定用途决定。例如，如果选择片段来编码蛋白的活性部分，则所述片段将需要大到足以编码所述蛋白的功能区域。如果将片段用作核酸探针或PCR引物，那么选择所述片段长度以在探测/引发期间获得相对少量的假阳性。

本发明多核苷酸“片段”可通过截短来制备，例如通过从多核苷酸的一端或两端去除一个或多个核苷酸。以该方式可从所述多核苷酸的3’和/或5’端去除至多10、至多20、至多30、至多40、至多50、至多75、至多100、至多200个或更多个核酸。还可通过一个或多个内部缺失来产生片段。

可将本发明核酸分子片段(即合成的寡核苷酸)用作探针或用于聚合酶链式反应(PCR)的特异性引物，或用于合成编码本发明蛋白的基因序列。所述分子可由化学技术容易地合成，例如Matteucci等的磷酸三酯法(1981)J.Am.Chem.Soc.103，3185-3191或用自动合成法。另外，可通过众所周知的方法容易地制备较大的DNA区段，例如合成一组界定基因的各个模块区段的寡核苷酸，接着连接各寡核苷酸以构建完全的修饰基因。在优选实施方案中，本发明核酸分子含有至少约2121个核苷酸的邻接的可读框。

因此，本发明多肽可由编码并能够表达所述多肽的多核苷酸产生，或可以以所述多核苷酸的形式递送。本发明多核苷酸可按照本领域众所周知的方法合成，所述方法实例如Sambrook等(1989，MolecularCloning-a laboratory manual(分子克隆实验室手册)；Cold SpringHarbor Press)所述。也就是说，可用重组方法得到编码上述多肽的多核苷酸序列，例如通过筛选cDNA和基因组文库，或通过由已知包含所述序列的载体获得。此外，可用标准技术从含有所述序列的细胞和组织直接分离所需序列，所述技术例如有苯酚抽提和cDNA或基因组DNA的PCR。也可通过合成而非克隆来产生多核苷酸序列。

可进一步修饰本发明核酸分子以包含用于诊断和探测目的的可检测的标记物。大量这样的标记物为本领域所知，并易于在本文所述编码分子中使用。合适的标记物包括但不限于生物素、放射性标记的核苷酸等。技术人员可采用任何所述标记物容易地获得本发明核酸分子的标记变体。可通过在翻译期间缺失、添加或改变掺入到蛋白序列中的氨基酸来对其一级结构本身进行修饰，而不破坏蛋白活性。所述取代或其它改变产生具有落入本发明所涵盖的范围内的核酸所编码的氨基酸序列的蛋白。

载体和宿主细胞

本发明多核苷酸可在载体例如表达载体中提供。本发明多肽、多核苷酸和载体可在宿主细胞中提供。

本发明还提供了含有编码序列的重组DNA分子(rDNA)。本文所用rDNA分子为接受过原位分子操作的DNA分子。产生rDNA分子的方法在本领域众所周知，例如参见Sambrook等(2001)，Molecular Cloning-alaboratory manual(分子克隆实验室手册)，Cold Spring HarborLaboratory Press。在优选rDNA分子中，编码DNA序列可操作地与表达调控序列和/或载体序列连接。在本发明一个实施方案中，所述编码序列含有SEQ ID NO：1或其片段。在备选实施方案中，所述编码序列编码SEQ ID NO：2多肽或其片段。

本发明核酸分子可以以表达盒的形式提供，所述表达盒包含可操作地与插入序列连接的调控序列，从而使得可在所靶向的对象物种体内表达本发明多肽。这些表达盒通常进而在载体中提供。合适的载体可为能够携带足量遗传信息并使本发明多肽能够表达的任何载体。

载体可用于简化对本发明核酸的操作，以制备用于进一步处理的大量核酸(克隆载体)或表达多肽(表达载体)。所述蛋白包括：mTORβ、在SEQ ID NO：2的任何氨基酸残基处包含一个或多个突变的蛋白、以及它们的衍生多肽。载体包含质粒、病毒(包括噬菌体)和整合的DNA片段(即通过重组整合到宿主基因组的片段)。

本发明mTORβ多肽的编码序列一经制备或分离，可将其克隆到任何合适的载体中，从而保留在细胞组合物中，所述细胞组合物基本上没有不含任何mTORβ编码序列的细胞。如本文所述，多种克隆载体为本领域技术人员所知。克隆载体不必含有表达调控序列。

本发明还包括包含本发明多核苷酸序列或rDNA分子的表达载体。所述表达载体可在分子生物学领域内以常规方式构建，并可例如涉及使用质粒DNA和合适的起始密码子、启动子、增强子和其它元件，例如可能是必要的聚腺苷酸化信号)，为了使本发明的肽能够表达，这些元件要以正确的方向安置。其它合适的载体为本领域技术人员显而易见。关于该方面我们引用了Sambrook等作为另外的实例。因此，可通过将所述载体递送到细胞并使载体发生转录来提供本发明多肽。优选将本发明多核苷酸或用于本发明的多核苷酸在载体中与调控序列可操作地连接，所述调控序列能够提供由宿主细胞表达编码序列，即所述载体为表达载体。

“可操作地连接”指元件的排列，其中所述组分被配置以使其能够实施常用功能。因此，将既定调节序列例如启动子可操作地连接到核酸序列，能够实现在存在合适的酶时使该序列表达。启动子不必与所述序列邻接，只要能起引导其表达的作用就行。因此，例如，在启动子序列和核酸序列之间可存在不翻译但被转录的间插序列，并仍可认为启动子序列“可操作地连接”到编码序列。

对载体和/或可操作地与本发明蛋白家族编码序列之一连接的表达调控序列的选择直接取决于所期需的功能特性(例如蛋白的表达)和待转化的宿主细胞，这在本领域中众所周知。本发明所涵盖的载体至少能够引导复制或插入到宿主染色体中，优选还能够引导本发明多核苷酸的表达，例如包含在rDNA分子中的结构基因的表达。

用于调节被可操作地连接的蛋白编码序列表达的表达调控元件为本领域所知，包括但不限于诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号和其它调节元件。优选诱导型启动子易于受到调控，例如响应宿主细胞培养基中的营养素。

在一个实施方案中，含有编码核酸分子的载体包含原核复制子，即具有以下能力的DNA序列：引导自主复制并保持该重组DNA分子在其所转化的原核宿主细胞(例如细菌宿主细胞)的染色体外。所述复制子在本领域中众所周知。另外，包含原核复制子的载体还可包括通过表达来赋予可检测标记(例如药物抗性)的基因。通常细菌的抗药性基因为赋予对氨苄青霉素(ampicillin)或四环素(tetracycline)的抗性的基因。

包含原核复制子的载体可进一步包含原核启动子或噬菌体启动子，所述启动子能够引导编码基因序列在细菌宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)中表达(转录和翻译)。启动子为表达调控元件，该元件由使得能够结合RNA聚合酶并发生转录的DNA序列构成。与细菌宿主相容的启动子序列通常在质粒载体中提供，该载体含有用于插入本发明DNA区段的合宜的限制性位点。代表性的所述载体质粒有pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(BioRad)、pPL和pKK223(Pharmacia)。

与真核细胞相容的表达载体(优选与脊椎动物细胞相容的表达载体)也可用于形成含有编码序列的载体或rDNA分子。包括病毒载体在内的真核细胞表达载体在本领域中众所周知，可市购自若干来源。通常，提供含有用于插入所需DNA区段的合宜的限制性位点的所述载体。代表性的所述载体有pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1/pML2d(International Biotechnologies，Inc.)、pTDT1(ATCC)、本文所述载体pCDM8等真核表达载体。

例示性的真核表达系统为采用痘苗病毒的系统，其在本领域众所周知(参见例如WO 86/07593)。酵母表达载体为本领域已知(参见例如美国专利第4,446,235号和第4,430,428号)。另一表达系统为载体pHSI，其转化中国仓鼠卵巢细胞(参见WO 87/02062)。可用编码选择性标记(例如二氢叶酸还原酶(DHFR)或胸苷激酶)的DNA与编码mTORβ或衍生物的DNA共转化哺乳动物组织。若采用野生型DHFR基因，则优选选定DHFR缺陷型宿主细胞，从而使得可用DHFR编码序列作为在hgt培养基中成功转染的标记，hgt培养基缺少次黄嘌呤、甘氨酸和胸苷。

用作本发明载体或用于构建本发明rDNA分子的真核细胞表达载体，可进一步包含在真核细胞中有效的选择性标记，优选抗药性选择标记。优选的抗药性标记为通过表达产生新霉素(neomycin)抗性的基因，即新霉素磷酸转移酶(neo)基因。(Southern等(1982)J.Mol.Anal.genet.1，327-341)。或者，所述选择性标记可存在于单独的质粒上，通过共转染将两种载体引入宿主细胞并通过在合适的针对选择性标记的药物中培养来进行选择。

表达载体中的调控序列可包含转录和翻译调控序列，例如转录启动子、编码合适的核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。在一个实施方案中，表达载体可包含选择基因(selection gene)，以促进mTORβ基因的稳定表达，和/或鉴定所转化的细胞。然而，可使用真核宿主细胞通过在共转化系统中的单独载体来提供用于维持表达的选择基因。

合适的载体通常应含有复制子(复制起始点，用于非整合性载体)和调控序列，它们来源于与预定的表达宿主相容的物种。本文所用术语“可复制的”载体，意欲包括含有所述复制子的载体以及通过整合到宿主基因组来复制的载体。

用于宿主细胞的表达载体通常包含复制起始点、位于mTORβ多肽编码序列上游的启动子、以及核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点和转录终止序列。表达载体可包含转录和翻译调控序列。这些调控序列为DNA调节序列，例如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子等，它们使编码序列能够在宿主细胞中表达。技术人员将明白，这些序列中的某些并非为在某些宿主中表达所必需。用于微生物的表达载体仅需要含有由宿主识别的复制起始点、在宿主中起作用的启动子和选择基因。

本文所用“启动子序列”为在细胞中能够结合RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列转录的DNA调节区域。为对本发明定义的目的，启动子序列在其3’端处以转录起始位点为边界(包含在内)，并向上游(5’方向)延伸以包含以高于背景的可检测水平启动转录所需的最少碱基数或元件数。在启动子序列内将存在转录起始位点以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域。真核启动子通常但并不总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。

常用的启动子来源于多瘤病毒、牛乳头瘤病毒、CMV(巨细胞病毒，来自鼠或人)、劳斯肉瘤病毒、腺病毒和猿猴病毒40(SV40)。也可使用其它调控序列(例如终止子、聚腺苷酸、增强子或扩增序列)。

构建表达载体以使mTORβ或衍生物多肽的编码序列位于含合适调节序列的载体。编码序列相对于调控序列的位置和方向应使编码序列在调控序列的“调控”下转录和翻译，即在调控序列处与DNA分子结合的RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA。在插入到载体(例如先前所述的克隆载体)之前，可先将调控序列与编码序列连接。或者，可将编码序列直接克隆到表达载体中，该载体已经含有调控序列和合适的限制性位点。若所选宿主细胞为哺乳动物细胞，则调控序列可与mTORβ或衍生物多肽的编码序列异源或同源，且编码序列可为含有内含子的基因组DNA或cDNA。

在编码序列的前面可包含“信号序列”。该序列编码多肽的N-末端信号肽，该信号肽将多肽引导到细胞表面，或指示宿主细胞将多肽分泌到胞外空间。在蛋白离开细胞之前，宿主细胞将该信号肽剪除。可发现信号序列与原核生物和真核生物的多种天然蛋白缔合。例如，α-因子(一种天然酵母蛋白)从酵母中分泌，其信号序列可被连接到将被分泌到培养基中的异源蛋白上(参见美国专利第4,546,082号)。另外，业已发现α-因子及其类似物从多种酵母中分泌异源蛋白，所述酵母例如有酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(参见例如欧洲专利88312306.9、欧洲专利0324274和欧洲专利0301669)。用于哺乳动物细胞的实例是用于表达VIIIc因子轻链的tPA信号。

核酸构建体的“异源”区域是在较大核酸分子内的可识别的核酸区段，在自然界中并未发现其与该较大的分子连接。因此，当异源区域编码哺乳动物基因时，所述基因侧翼的DNA通常不是以下DNA：该DNA位于来源生物体的基因组中的哺乳动物基因组DNA的侧翼。异源编码序列的另一个实例为以下构建体：在该构建体中编码序列本身并不能在自然界中找到(例如cDNA(其中基因组编码序列含有内含子)或具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。

本发明载体和表达盒可直接以“裸核酸构建体”来给予，优选进一步包含与宿主细胞基因组同源的侧翼序列。本文所用术语“裸DNA”指载体，例如包含本发明多核苷酸连同控制其产生的短启动子区域的质粒。之所以称为“裸”DNA，是因为载体并不携带于任何递送赋形剂中。当所述载体进入宿主细胞(例如真核细胞)时，其编码的蛋白在该细胞内转录并翻译。

因此，本发明载体可为质粒载体，也就是说，为自主复制的染色体外环形或线性DNA分子。或者，可用本领域已知的多种病毒技术将本发明载体引入到合适的宿主细胞中，例如用重组病毒载体感染，所述病毒载体例如有逆转录病毒、单纯疱疹病毒和腺病毒。作为病毒载体的备选方案，脂质体制剂可供选择地用于递送本发明核酸分子，或者可将本发明核酸分子用颗粒载体包封、吸附到颗粒载体或与微粒载体缔合。

本发明还提供了经过修饰以表达本发明多肽的细胞，例如用编码本发明多肽的核酸分子转化的宿主细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。用于表达本发明蛋白的真核细胞不受限制，只要所述细胞系与细胞培养方法相容并与表达载体的增殖和基因产物的表达相容即可。所述细胞包括瞬时或优选稳定的高等真核细胞系(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)和低级真核细胞(例如酵母细胞)。优选的真核宿主细胞包括但不限于酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选脊椎动物细胞，例如来自小鼠、大鼠、猴或人细胞系的脊椎动物细胞。优选的真核宿主细胞包括自ATCC得到的作为CCL61的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、自ATCC得到的作为CRL 1658的NIH瑞士小鼠胚细胞(NIH-3T3)、幼仓鼠肾细胞(BHK)等真核组织培养细胞系。优选所选的细胞系不仅稳定而且使得可以进行多肽的成熟糖基化以及在细胞表面表达。可在转化的卵母细胞中完成表达。可在转基因的非人类动物(优选小鼠)的细胞中表达合适的肽。表达本发明肽的转基因非人类动物包括在本发明范围内。本发明肽还可在爪蟾卵母细胞或载黑素细胞中表达。

任何原核宿主可用于表达编码本发明多肽的多核苷酸、载体或rDNA分子。在一个实施方案中，优选的原核宿主为大肠杆菌。

通过众所周知的方法实施含本发明多核苷酸、载体或rDNA分子的合适的宿主细胞的转化，所述方法通常取决于所用载体类型和所采用的宿主系统。就转化原核宿主细胞而言，通常采用电穿孔法和盐处理法，参见例如Cohen等(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69，2110；和Sambrook等(1989)Molecular Cloning-a laboratory manual(分子克隆实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press。就转化具有含rDNA的载体的脊椎动物细胞而言，通常采用电穿孔法、阳离子脂质法或盐处理法，参见例如Graham等(1973)Virol.52，456；Wigler等(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，1373-1376。

可通过众所周知的技术(包括根据选择性标记来选择)来鉴定成功转化的细胞，即含有本发明多核苷酸、载体或rDNA分子的细胞。例如，可克隆引入本发明rDNA而得到的细胞以产生单个集落。可收获并裂解来自这些集落的细胞，用例如Southern((1975)J.Mol.Biol.98，503-504)或Berent等((1985)Biotech.3，208-209)所述方法检查其DNA内容物以确定rDNA的存在情况，或经由免疫学方法测定所述细胞所产生的蛋白。

可用常规方法培养所述本发明细胞系以制备本发明多肽，或可治疗性或预防性地将所述细胞系用于递送本发明多肽给受治疗者。例如，可将能够分泌本发明多肽的细胞系给予受治疗者。或者，可将本发明多核苷酸、表达盒或载体离体给予来自受治疗者的细胞，然后让该细胞重新返回到受治疗者体内。例如，离体递送并将转化的细胞重新植入受治疗者的方法(例如葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、电穿孔和直接显微注射入核内)是已知的。

根据所选择的表达系统和宿主，可通过在使多肽表达的条件下培养由外源或异源DNA构建体(例如上述表达载体)转化的宿主细胞来制备目标肽，例如mTORβ或其变体或衍生物。然后将目标肽例如mTORβ或其衍生物多肽从宿主细胞分离并纯化。若表达系统将所述蛋白或肽分泌到生长培养基中，则可直接从无细胞培养基纯化该蛋白。选择合适的生长条件和最初的粗回收方法属于本领域技术范围。

转化的宿主细胞是已经被含编码mTORβ或mTORβ衍生物多肽的核酸的载体转化或转染的细胞。在所表达肽中的合适加工信号(例如同源或异源信号序列)的控制下，所表达的多肽可被分泌到培养物上清液中。

当将所述核酸引入到细胞内时，所述细胞就已经被外源或异源核酸“转化了”。可使或不使转化核酸整合(共价连接)到构成细胞基因组的染色体DNA中。例如，在原核细胞中，转化核酸可保留在游离型元件(episomal element)例如质粒或病毒载体上。就真核细胞而言，稳定转化的细胞是以下细胞：在该细胞中转化DNA已经整合到染色体中，由此该DNA可通过染色体复制由子细胞来遗传。该稳定性通过真核细胞建立由含转化核酸的子细胞群组成的细胞系或克隆的能力来证明。

本文所用“细胞系”是能够在体外稳定生长多代的原代细胞的克隆。当至少约85％(优选至少约90％、更优选至少约95％、更优选至少约97％和最优选至少约99％)的核苷酸在界定的核苷酸序列长度内配对时，核酸序列展示本文所用的“基本同一性”。基本上同一的序列可在Southern杂交实验中在例如用于特定系统所限定的严格条件下鉴定。界定合适的杂交条件属于本领域技术范围。

可将高等真核细胞培养物用于表达本发明蛋白，而不管其是来自脊椎动物细胞还是包括昆虫在内的无脊椎动物细胞，其繁殖方法是已知的。

用rDNA分子制备重组蛋白

本发明还提供了用本文所述核酸分子制备本发明蛋白的方法。一般而言，重组形式蛋白的制备通常涉及以下步骤。首先，获得编码本发明蛋白的核酸分子，例如包含以下序列、基本上由或由以下序列组成的核酸分子：编码SEQ ID NO：2的氨基酸或其衍生物的核酸序列。其次，如上文所述，随后优选将所述核酸分子置于与合适调控序列可操作地连接的位置，以形成含蛋白可读框的表达单位。

将所述表达单位用于转化合适的宿主，并在使重组蛋白能够生产的条件下培养转化的宿主。任选地使重组蛋白从培养基或从细胞分离；在可容允某些杂质的某些情况下可不必回收及纯化所述蛋白。

可以以多种方式实施前述各步骤。例如，可从基因组片段得到所需编码序列并直接用于合适的宿主中。如上所述，可用合适的复制子和调控序列完成在多种宿主中可操作的表达载体的构建。调控序列、表达载体和转化方法取决于用于表达所述基因的宿主细胞类型，其在先前已详述。如果没有一般可用的合适的限制性位点，则可将其加到编码序列的两个末端，以提供插入这些载体中的可切除基因(excisablegene)。技术人员可易于改造本领域已知的任何宿主/表达系统用于本发明核酸分子，以制备重组蛋白。

抗体

本发明另一类作用剂是与mTORβ起免疫反应的抗体。在优选实施方案中，抗体与mTORβ起免疫反应但不与mTORα起免疫反应。通过用含有抗原区域的肽使合适的哺乳动物对象免疫来获得抗体作用剂，所述抗原区域为意欲被所述抗体靶向的蛋白部分。抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体。

结合mTORβ的活性位点的抗体包括在本发明中。在本发明一个实施方案中，抗体与使4E-BP1磷酸化的mTORβ的活性位点结合。在本发明另一个实施方案中，抗体与使S6K1磷酸化的mTORβ的活性位点结合。在备选实施方案中，抗体与导致诱导cMyc表达的mTORβ的位点结合。

能够抑制本发明蛋白活性的抗体也包括在本发明中。

通过以合适的免疫方案用本发明的肽、多肽或蛋白使合适的哺乳动物宿主免疫来制备抗体，所述肽、多肽或蛋白例如有mTORβ、变体和分离的结合配偶体，前提是它们有足够的长度，或如果希望，或如果需要增强免疫原性，则使它们与合适的载体缀合。用于制备含载体免疫原性缀合物的方法在本领域中众所周知，所述载体例如有牛血清白蛋白(BSA)、匙孔戚血蓝蛋白(KLH)或其它载体蛋白。在某些情况下，用例如碳二亚胺试剂可有效进行直接缀合；在其它情况下，可能需要本领域众所周知的连接试剂来提供对半抗原的可连接性(accessibility)。例如，可用半胱氨酸残基在氨基端或羧基端延伸半抗原肽，或将半胱氨酸残基散布在半抗原肽中，以促进与载体的连接。通常通过用合适的佐剂经合适时间的注射来给予免疫原，这通常为本领域所了解。在免疫计划期间，采用抗体滴度来确定是否有足够的抗体形成。

可用对应于例如mTORβ羧基末端的15个氨基酸的合成肽产生抗肽抗体。还可产生与激酶的磷酸化作用位点结合的抗体，包括与mTORβ蛋白的磷酸化作用位点结合的抗体。合成肽可少至长度为1-3个氨基酸，但优选长度为至少4个或更多个氨基酸残基。用标准方法使肽与KLH偶联，并用其免疫动物例如兔。随后可例如通过用含有共价连接的肽的Actigel珠纯化多克隆抗mTORβ抗体。

尽管用该方法产生的多克隆抗血清可满足某些应用，但对于药物组合物而言，优选应用单克隆制剂。如通常所已知的，可用实现淋巴细胞或脾细胞的永生化的Kohler和Milstein标准方法和修改方法(modification)，来制备分泌所需单克隆抗体的永生化细胞系。由免疫测定来筛选分泌所需抗体的永生化细胞系，其中抗原为肽半抗原、多肽或蛋白。当鉴定出分泌所需抗体的合适的永生化细胞培养物时，可对细胞进行体外培养或在腹水中制备。其中特别能引起注意的是识别FK506/雷帕霉素结构域、激酶结构域或调节结构域的单克隆抗体。

随后从培养物上清液或从腹水上清液回收所需单克隆抗体。可将含有免疫学上重要部分的单克隆片段或多克隆抗血清用作拮抗剂以及完整抗体。对免疫学反应片段(例如Fay、scFV、Fab、Fab’或F(ab’)2片段)的应用往往是优选的，尤其是在治疗的情况下，因为这些片段通常比完整的免疫球蛋白具有更低的免疫原性。

可使用抗原结合片段，例如F(ab)2、Fab和Fv片段，所述抗原结合片段也就是来自包含抗原结合位点的抗体“可变”区的抗体片段。抗体可为前述抗体的人变体、人源化变体或嵌合变体。当将这些抗体给予受治疗者时，它们的免疫原性可能较小。制备人源化抗体或嵌合抗体的方法在本领域中众所周知。所涵盖的抗体还包括不同的同种型和同种型亚类(例如IgG₁.IgG₂和IgM)。可通过在脊椎动物中、在杂交瘤细胞系中或其它细胞系中诱导或通过重组方式来制备这些抗体。关于怎样制备这些抗体参考文献，参见Harlow和Lane(1988)，Antibodies：ALaboratory Manual(抗体：实验室手册)，Cold Spring Harbor Press。

也可用当前技术通过重组方法来制备抗体或片段。在具有多物种来源的嵌合体情况下，也可制备特异性结合所需的受体区域的区域。

治疗方法

本发明还涉及用于治疗与异常表达mTORβ有关的疾病的方法，该方法包括给予需要治疗的对象有效量(能够调节mTORβ的活性和/或表达)的作用剂。因此，可将所述作用剂用于治疗(其可为治疗性治疗和/或预防性治疗)、诊断或防止所述疾病。异常表达可为例如mTORβ表达增加或mTORβ表达降低。可根据是否要补充或减少mTORβ水平，来选择合适的作用剂。

在一个实施方案中，作用剂为mTORβ抑制剂。所述抑制剂可起降低所存在的mTORβ的量的作用，其例如通过抑制或防止mTORβ基因表达或蛋白产生或者通过起除去或降解mTORβmRNA或蛋白的作用来进行。所述抑制剂可起降低mTORβ活性的作用，例如上面所论述的mTORβ的任何活性或功能。合适的抑制剂可为结合mTORβ并防止其功能的分子。例如，合适的抑制剂可为结合mTORβ的抗体。在另一个实施方案中，作用剂为mTORβ拮抗剂。

在另一个实施方案中，作用剂为mTORβ的促进剂或激活剂。所述作用剂可起增加所存在的mTORβ蛋白的量的作用。例如，作用剂可为本文所述的多核苷酸、载体、rDNA、多肽或宿主细胞。作用剂可起增加mTORβmRNA或多肽的寿命的作用，例如通过提高mRNA或多肽在细胞或生物体内对降解过程的抗性。所述作用剂可起提高mTORβ活性或功能的作用，例如上述mTORβ的任何活性或功能。

能够调节mTORβ的活性和/或表达的有效量可为发挥本文所述的合适的作用的量。例如，mTORβ抑制剂的合适的量可为足以对mTORβ活性发挥抑制作用的量。有效量还可为有效抑制表现mTORβ表达异常的细胞增殖的量。

在该方法的某些实施方案中，与mTORβ表达异常有关的疾病为癌症，包括但不限于：前列腺癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、肺癌、非小细胞肺癌、骨癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤黑素瘤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、结肠癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)瘤、神经外胚层癌、脊轴瘤(spinal axis tumor)、神经胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤或一种或多种前述癌症的组合。在所述方法另一个实施方案中，所述细胞生长异常为良性增生性疾病，包括但不限于银屑病、良性前列腺增生、肥大或再狭窄(restinosis)。

在本发明一个实施方案中，作用剂为激酶抑制剂。可用于本发明方法的例示性的激酶抑制剂类型包括但不限于雷帕霉素、雷帕霉素衍生物，例如RAD001(Lane(2003)Mol.Targets Cancer Therapeut.259-260)，CCI-779和AP23573。

在本发明方法的实践中，这些作用剂可单独使用或与其它活性或惰性成分联用。因此，本发明方法包括给予多肽以治疗与细胞生长异常有关的疾病(包括癌症)，所述多肽包含与细胞毒剂联合的这些作用剂。细胞毒剂的实例包括但不限于：白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白、皂苷、假单胞菌外毒素、美洲商陆抗病毒蛋白、白喉毒素、互补蛋白或本领域已知的一旦接触细胞就能够杀死该细胞的任何其它作用剂。

本发明还延伸至组合物，例如包含本文所述分子和作用剂的药物组合物。可用标准药物配制化学和方法来配制包含本发明分子(例如上述多核苷酸、表达盒、载体、多肽、细胞或抗体)的组合物，这些方法易于为本领域技术人员所用。例如，可让含一种或多种本发明分子的组合物与一种或多种可药用赋形剂或溶媒联合。在所述赋形剂或溶媒中可存在辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等等。这些赋形剂、溶媒和辅料为常用的药学试剂，它们在接受所述组合物的个体中不诱导免疫应答，并可被给予而没有不适当的毒性。可药用赋形剂包括但不限于液体，例如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油和乙醇。其中还可包括可药用盐，例如：无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。可药用赋形剂、溶媒和辅料的全面讨论可在Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中获得。

因此，本发明还提供了包含本文所述分子(例如本发明多肽，例如mTORβ或其变体或衍生物)和稀释剂的组合物。合适的稀释剂可为水性或非水性溶剂或其组合，并且可包含另外的组分，例如水溶性盐或甘油，它们有助于蛋白或多肽的稳定性、溶解性、活性和/或储存。

药物组合物还可包含能够调节mTORβ活性和/或表达的一种或多种作用剂及可药用载体，可由它们组成或基本上由它们组成。所述组合物可包含作为上述本发明治疗方法的一部分被给予的作用剂。本发明药物组合物可含有合适的可药用载体，所述载体包含赋形剂和助剂，它们有助于将活性化合物加工到在药学上可用于递送到作用位点的制剂中。用于胃肠外给药的合适的制剂包括呈水溶性形式(例如水溶性盐)的活性化合物的水溶液剂。另外，可给予作为合适的油性注射混悬液的活性化合物的混悬剂。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油，例如芝麻油；或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯。水性注射混悬剂可含有增加混悬液粘度的物质。所述增加粘度的物质实例包括羧甲基纤维素钠、山梨醇和葡聚糖。任选混悬剂还可含有稳定剂。也可将脂质体用于包封作用剂以递送到细胞内。

本发明药物组合物，例如包含能够调节mTORβ活性和/或表达的一种或多种作用剂的药物组合物，可经由以下途径给予：胃肠外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、颅内或透皮或口腔途径。例如，可将作用剂经由显微输注(microinfusion)局部给予肿瘤或mTORβ表达异常的位点。作为选择或除此以外，可经由口服途径给药。给予的剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和体重、同时进行的治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和所需效果的性质。

尽管需要根据个体来变化，但对各组分有效量的最佳范围的确定属于本领域技术范围。能够调节本发明mTORβ活性和/或表达的作用剂的剂量通常包含约1.0ng/kg体重-约0.13mg/kg体重。在一个实施方案中，能够调节mTORβ活性和/或表达的作用剂的剂量包含约1.0ng/kg体重-约0.1mg/kg体重。在优选实施方案中，全身给药的剂量包含约0.01μg/kg体重-约0.1mg/kg体重。在另一个实施方案中，能够调节mTORβ活性和/或表达的作用剂的剂量通常包含小于约0.1mg/kg体重。更优选的全身给药的剂量包含约0.1μg/kg体重-约0.05mg/kg体重。在另一优选实施方案中，能够调节mTORβ活性和/或表达的作用剂的剂量包含小于约0.05mg/kg体重。最的优选全身给药的剂量包含约1.0μg/kg体重-约0.01mg/kg体重。在其它实施方案中，能够调节mTORβ活性和/或表达的作用剂的给药量为使得能够调节mTORβ活性和/或表达的作用剂的血清浓度达到以下浓度的有效量：约20.0、10.0、5.0、2.50、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.078、0.039、0.020、0.010、0.005、0.003、0.0015、0.0008、0.0003或0.0001nM。经由显微输注直接给予位点的优选剂量包含1ng/kg体重-1mg/kg体重。

本发明全身给药的药学制剂可经调配用于肠内、胃肠外或局部给予。实际上，可同时使用所有三种制剂形式以达到全身给予活性成分。

如上对于本发明某些方法所述，可使用局部给药。可采用任何常用的局部制剂，例如溶液剂、混悬剂、凝胶剂、软膏剂或药膏等。所述局部制剂的制备阐述于所例述的药物制剂领域中，例如Gennaro等(2000)Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，MackPublishing。对于局部施用，组合物也可作为散剂或喷雾剂尤其是以气雾剂形式给予。在某些实施方案中，本发明组合物可通过吸入来给予。对于吸入治疗，活性成分可处于用于通过定量吸入器给予的溶液中，或呈适用于干粉吸入器的形式。在另一个实施方案中，组合物适用于通过支气管灌洗来给予。

用于口服给药的合适的制剂包括硬明胶胶囊或软明胶胶囊、丸剂、片剂(包括包衣片剂)、酏剂、混悬剂、糖浆剂或吸入剂及其控释形式。

可在体内或离体使用用于治疗目的的本发明组合物和方法，体内使用通常为在哺乳动物中使用，例如在人、绵羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠中。本发明尤其用于治疗人对象。

鉴定调节mTORβ表达和/或活性的作用剂的方法

本发明还提供了用于鉴定(即筛选)调节mTORβ表达和/或活性的作用剂的方法。在本发明一个实施方案中，作用剂调节mTORβ表达。在另一个实施方案中，作用剂调节mTORβ活性。mTOR表达和/或活性的降低表明作用剂抑制mTORβ。mTOR表达和/或活性增加表明作用剂刺激mTORβ。

本发明另一个实施方案提供了用于鉴定调节编码mTORβ蛋白(例如具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白)的核酸的表达的作用剂的方法。这样的测定可采用监测本发明核酸表达水平变化的任何有用手段。如果本文所用作用剂能够增量或减量调节核酸在细胞中的表达，则认为作用剂调节本发明核酸的表达，所述核酸例如有编码具有SEQID NO：2序列的蛋白的核酸或具有SEQ ID NO：1的核酸。

因此，本发明提供了用于筛选或鉴定调节mTORβ活性和/或表达的作用剂的方法。

本发明方法可包括以下步骤：

(a)提供本发明多肽(例如本发明多肽或由本发明多核苷酸编码的多肽)；

(b)使所述多肽与测试作用剂接触；和

(c)检测所述多肽活性的任何变化，其中活性变化表明作用剂能够调节mTORβ活性。

还可用本发明多核苷酸来实施等同方法，例如以鉴定能够调控基因表达的作用剂，或鉴定能够调节mTORβmRNA水平或转录的作用剂。

可在体外或体内实施本发明方法。可用分离的(或基本上分离的)或纯化(基本上纯化)的多肽实施本发明方法。

或者，可在包含所述多肽的细胞中实施方法。例如，所述方法可包括以下步骤：

(a)提供本发明宿主细胞，例如包含或表达本发明多肽(例如本发明多肽或由本发明多核苷酸编码的多肽)的宿主细胞；

(b)使所述宿主细胞与测试作用剂接触；和

(c)检测所述多肽表达和/或活性的任何变化，其中表达和/或活性变化表明作用剂能够调节mTORβ表达和/或活性。

具体方法可包括以下步骤：

(a)使表达本发明多肽的细胞与所述作用剂接触；和

(b)检测所述多肽表达和/或活性的变化，其中表达和/或活性变化表明作用剂能够调节mTORβ表达和/或活性。

在一种测定形式中，可制备含有mTORβ可读框(例如SEQ ID NO：1)与任何可测定的融合配偶体之间的报告基因融合体(fusion)的细胞系。众多的可测定融合配偶体是已知的并易于获得，包括萤火虫荧光素酶基因和编码氯霉素乙酰转移酶的基因(Alam等，1990 Anal.Biochem.188，245-254)。然后让含报告基因融合体的细胞系在适当条件下与测试作用剂或对照接触适当时间。报告基因在与作用剂接触的样品和对照样品之间的差异性表达，鉴定出调节编码mTORβ的核酸表达的作用剂。

在另一测定形式中，作用剂调节mTORβ表达的能力基于对诸如c-Myc等的蛋白表达的测量，所述蛋白的表达因对mTORβ表达的调节作用而受到调节。

可用另外的测定形式来监测作用剂调节编码本发明蛋白(例如mTORβ)的核酸表达的能力。例如，可直接通过与本发明核酸杂交来监测mRNA表达。使细胞系在合适条件下与被测试的作用剂和/或包含mTORβ的多肽接触合适时间，由Sambrook等(2001)Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆-实验室手册)，Cold Spring HarborLaboratory Press所公开的标准方法来分离总RNA或mRNA。

可从本发明核酸制备用于检测与作用剂接触的细胞和对照细胞之间的RNA表达水平差异的探针。优选但并不一定要设计在高严格性条件下只与靶核酸杂交的探针。在高严格性条件下，只能形成高度互补的核酸杂合体。因此，测定条件的严格性决定为了形成杂合体的两条核酸链之间应该存在的互补量(amount of complementarity)。应该选定严格性以使探针：靶标杂合体与潜在的探针：非靶标杂合体之间的稳定性差异最大化。

可通过本领域已知方法根据本发明核酸来设计探针。例如，探针的G+C含量和探针长度可影响探针与其靶序列的结合。在Sambrook等(2001)或Ausubel等(1995)Current Protocols in Molecular Biology(当前的分子生物学实验方案)，Greene Publishing Company)中通常可获得使探针特异性最优化的方法。

用已知方法按各探针的需要来修改杂交条件，例如Sambrook等(2001)和Ausubel等(1995)所阐述的方法。可以以任何有效的方式实现细胞总RNA或富含聚腺苷酸RNA的RNA的杂交。例如，可使细胞总RNA或富含聚腺苷酸RNA的RNA固定在固相支持体上，让该固相支持体与至少一种包含本发明序列中的至少一种或一种的部分的探针在使探针特异性杂交的条件下接触。或者，让包含本发明序列中的至少一种或一种的部分的核酸片段固定在固体载体上，固体载体例如为多孔性玻璃片。然后可让该玻璃片与来自样品的细胞总RNA或聚腺苷酸RNA在使固定的序列特异性杂交的条件下接触。所述玻璃片和杂交方法可随处得知，例如如Beattie(WO 95/11755)所述。通过检查既定探针与来自未处理的细胞群的RNA样品和来自与作用剂接触的细胞群的RNA样品特异性杂交的能力，可鉴定出增量或减量调节编码mTORβ蛋白的核酸表达的作用剂。

本发明还提供了用于鉴定调节mTORβ多肽(例如SEQ ID NO：2多肽)的至少一种活性的作用剂的方法。所述方法或测定可采用监测或检测所需活性的任何手段。这些测定可包括：对mTORβ磷酸化作用的检测、对S6K1磷酸化作用的检测、对4E-BP1磷酸化作用的检测、对cMyc表达的诱导作用的监测或对S6K1和/或4E-BP1使第二蛋白磷酸化的能力的监测。在本发明一个实施方案中，基于检测PKB/Akt的磷酸化作用来检测mTORβ活性。

在一种形式中，可测定与测试作用剂接触的细胞群和未接触作用剂的对照细胞群之间比较的本发明蛋白的比活性，将其归一化为标准单位。在合适条件下细胞系或细胞群与测试作用剂接触合适的时间。可从接触作用剂的细胞系或细胞群和未接触作用剂的对照细胞系或细胞群制备细胞裂解液。然后用探针分析细胞裂解液。

可通过利用合适的免疫方案用本发明蛋白或其含有抗原的片段使合适的哺乳动物宿主免疫，来制备抗体探针。为了提高免疫原性，可让这些蛋白或片段与合适的载体缀合。用于制备含载体(例如BSA、KLH或其它载体蛋白)的免疫原缀合物的方法在本领域中众所周知。在某些情况下，用例如碳二亚胺试剂可有效进行直接缀合；在其它情况下，可能需要连接试剂例如Pierce Chemical Co.供应的连接试剂来提供对半抗原的可连接性。例如，可用半胱氨酸残基在氨基端或羧基端延伸半抗原肽，或将半胱氨酸残基散布在半抗原肽中，以促进与载体的连接。通常通过用合适的佐剂经合适时间的注射来给予免疫原，这通常为本领域所了解。在免疫计划期间，采用抗体滴度来确定是否有足够的抗体形成。

尽管用该方法产生的多克隆抗血清可满足某些应用，但对于药物组合物而言，优选应用单克隆制剂。如通常所已知的，可用实现淋巴细胞或脾细胞的永生化的标准方法(参见例如Kohler和Milstein(1992)Biotechnology 24，524-526)和修改方法，来制备分泌所需单克隆抗体的永生化细胞系。由免疫测定来筛选分泌所需抗体的永生化细胞系，其中抗原为肽半抗原、多肽或蛋白。当鉴定出分泌所需抗体的合适的永生化细胞培养物时，可对细胞进行体外培养或在腹水中制备。

可从培养物上清液或从腹水上清液回收所需单克隆抗体。可将含有免疫学上重要部分的单克隆抗体片段或多克隆抗血清作为拮抗剂以及完整抗体来使用。对免疫学反应性片段(例如Fab或Fab’片段)的应用通常是优选的，尤其是在治疗情况下，因为这些片段通常比完整的免疫球蛋白具有更低的免疫原性。

也可用当前技术通过重组手段来制备抗体或片段。在具有多物种来源的嵌合体(例如人源化抗体)情况下，也可产生特异性结合蛋白的所需区域的抗体区域。因此，抗体可为人源化抗体或人抗体，其如美国专利第5,585,089号或Riechmann等(1988)Nature 332，323-327所述。

可随机选择或合理地选择或设计在上述方法中测定的作用剂。当对作用剂进行随机选择而不考虑涉及本发明蛋白缔合(单独的蛋白缔合或与其相关的底物、结合配偶体等缔合)的特定序列时，认为本文所用作用剂是被随机选择的。随机选择作用剂的实例为化学文库或肽组合文库或生物体的液体培养基(growth broth)的应用。

当基于考虑与作用剂的作用有关的靶标位点序列或其构象而非随机选择作用剂时，认为本文所用作用剂是合理地选择或设计的。可通过利用构成这些位点的肽序列来合理地选择或合理地设计作用剂。例如，经合理选择的肽作用剂可为以下肽：其氨基酸序列等同于任何功能一致的位点或为所述位点的衍生物。

本发明作用剂可为例如肽、肽模拟物、抗体、抗体片段、小分子、维生素衍生物以及碳水化合物。如本领域已知，可用标准固相(或液相)肽合成法来制备本发明肽作用剂。另外，可用市售的寡核苷酸合成仪来合成，和用标准重组制备系统来重组制备编码这些肽的DNA。如果包含非基因编码的氨基酸，则必须用固相肽合成法来制备。

鉴定结合配偶体的方法

本发明另一个实施方案提供了用于分离和鉴定mTORβ或衍生物的结合配偶体的方法。一般而言，使本发明蛋白与潜在的结合配偶体或细胞提取物或细胞分离物在使得潜在的结合配偶体与本发明蛋白缔合的条件下混合。混合后，将已经与本发明蛋白缔合的肽、多肽、蛋白或其它分子从混合物中分离出来。然后可移出结合本发明蛋白的结合配偶体并对其进行进一步分析。为了鉴定和分离结合配偶体，可使用完整的蛋白，例如包含SEQ ID NO：2的完整氨基酸序列的蛋白或由SEQ ID NO：1核苷酸编码的蛋白。或者，可使用蛋白片段。

本文所用细胞提取物指由裂解或破碎的细胞制成的制备物或分离物。细胞提取物的优选来源是来源于人皮肤组织或人呼吸道的细胞，或来源于罹患变态超敏反应患者的人肺组织活检样品的细胞。或者，可从正常组织或有用细胞系(尤其是粒细胞细胞系)制备细胞提取物。

可用多种方法获得细胞提取物。可用物理或化学破碎方法破碎细胞。物理破碎法的实例包括但不限于超声法和机械剪切法。化学裂解法的实例包括但不限于去污剂裂解法和酶解法。为了得到用于本发明方法的提取物，技术人员可易于改变用于制备细胞提取物的方法。

一旦制成细胞提取物，就将该提取物与本发明蛋白在可发生蛋白与结合配偶体缔合的条件下混合。可使用多种条件，最优选条件为与人细胞细胞质中的条件非常相似的条件。可改变各种特性(例如渗透压、pH、温度和所用的细胞提取物的浓度)，以使蛋白与结合配偶体的缔合最优化。

在适当条件下混合后，将结合的复合体从混合物中分离。可用多种技术来分离混合物。例如，可用本发明蛋白的特异性抗体来免疫沉淀结合配偶体复合体。或者，可使用标准化学分离技术，例如色谱法和密度/沉淀离心法。

在去除提取物中存在的非缔合细胞组成以后，可用常规方法使结合配偶体从复合体解离。例如，通过改变混合物的盐浓度或pH可实现解离。为了帮助从混合的提取物分离缔合的结合配偶体对，可将本发明蛋白固定在固相支持体上。例如，可将蛋白连接到硝酸纤维素基质或丙烯酸珠粒(acrylic bead)。蛋白与固相支持体的连接有助于使肽/结合配偶体对与提取物中存在的其它成分分离。所鉴定的结合配偶体可为单个蛋白或由两个或多个蛋白构成的复合体。或者，可用Far-Western测定按照Takayama等(1997)Methods Mol.Biol.69，171-184或Sauder等(1996)J.Gen.Virol.77、991-996的方法来鉴定结合配偶体，或用表位标记的蛋白或GST融合蛋白来鉴定结合配偶体。

或者，本发明核酸分子可用于酵母双杂交系统。酵母双杂交系统被用于鉴定其它蛋白配偶体对，并且可易于经过修改以采用本文所述核酸分子。

无需再作说明，相信本领域一般技术人员便可用先前的说明和以下阐明性实施例来制备和使用本发明作用剂(例如核酸和多肽)并实践要求保护的方法。以下操作性实施例阐述了本发明实施方案，不应该理解为以任何方式限制本发明其余部分。

实施例

实施例1：用mTOR的C末端抗体进行的大鼠组织蛋白印迹分析

与具有两个TOR基因的酵母相反，哺乳动物仅具有一个基因，已知其编码分子量为大约280kDa的单个多肽。为了进一步阐明mTOR的调控和下游信号传导，开发了单克隆抗体(F11)。该抗体(F11)在蛋白印迹、免疫沉淀和免疫荧光(数据未列出)中特异性识别mTOR。对应于HEAT结构域的mTOR片段(长度为350个氨基酸)在细菌中表达为GST-融合蛋白，用于免疫和筛选特异性杂交瘤克隆。当将此产生的该抗体用于在蛋白印迹中分析来自大鼠组织和各种细胞系的总细胞裂解液时，观察到一个大约280kDa的主要的免疫反应条带(参见图1，下图)。然而，当使用针对所述肽的C末端产生的市售mTOR抗体(Cell Signalling)时，可检测到若干个强免疫反应条带(图1，上图)。除了280-kDa的条带(其通常在大鼠脑中非常丰富)外，还有两个大约80kDa和95kDa的强免疫反应条带。80-kDa条带在肝脏、血液、肾脏、小肠和大肠中高度表达，而在肺、胃、脾、睾丸和脂肪中具有中/低表达水平。有趣的是，95-kDa条带似乎是器官特异性的，因为其仅在肝脏中才以极高水平检测到(参见图1，上图)。此外，肝和血液具有相对弱但特殊的大约135kDa的带。将用抗肌动蛋白抗体重新探测的膜用作蛋白加样对照(loading control)。可通过mTOR剪接形式的存在或通过蛋白酶解降解全长蛋白来解释检测到较低分子量的mTOR免疫反应条带。

质粒构建、siRNA和表达研究实验程序

为了在哺乳动物细胞中表达，将mTORβ的全长cDNA克隆到被标记的真核表达载体pcDNA3.1/FLAG(Invitrogen)上。通过用定点诱变试剂盒(Stratagene)按照厂商建议产生mTORβ的激酶失活点突变，其中Asp 514取代为Glu(TORα中Asp 2357换为Glu的类似物)。用ExGene 500试剂(Fermentas)在厂商建议条件下进行细胞的瞬时转染。从MWG Biotech获得mTOR的siRNA(长度21个核苷酸，对应于人mTOR的2241-2261区(Kim等，2002))。用Lipofectamine 2000(Invitrogen)按厂商建议将siRNA转染到Hek293细胞。将S6K1的C-末端区(His-S6K1C，332-502位的氨基酸)克隆到pET24a质粒(Novagene)中，并且与6His-标志物序列在同一个可读框内。在BL21DE3细胞中用NTA-琼脂糖(Qiagene)分别进行His-S6K1C的表达和亲和纯化。pCMV FLAG mTORα质粒由日本神户的K.Yonezawa教授惠赠。

试剂、抗体和细胞培养物

抗FLAG标志物抗体、抗HA标志物抗体和抗β肌动蛋白抗体均购自Sigma。N-末端抗mTOR抗体来自SantaCruz。所有其它抗体均购自Cell Signaling。人胚肾HEK293细胞、人乳腺MCF7和人肝脏HepG2细胞于37℃和5％CO₂下维持在补充有10％胎牛血清(FBS；Hyclone)、2mM L-谷氨酰胺、50单位/ml青霉素(penicillin)和50μg/ml链霉素(streptomycin)的Dulbecco改良的Eagle培养基中。

RNA纯化和RT-PCR实验程序

用SV Total RNA Isolation System(Promega)从HEK293、MCF7和HepG2细胞系纯化总RNA。通过用ReverAid H Minus First StrandcDNA合成试剂盒(Fermentas)让10μg总RNA与5μg寡核苷酸dT引物在70℃下退火5分钟，来合成第一链cDNA。然后加入RT混合物(最终为1×反应缓冲液、40U RiboLock核糖核酸酶抑制剂(Fermentas)和1mM dNTP)，让溶液在25℃下孵育5分钟。在加入RevertAid H Minus逆转录酶(Fermentas)后，让25μl反应混合物在25℃下孵育10分钟并在37℃下孵育1小时。通过在70℃下孵育10分钟终止逆转录酶反应。将反应混合物储存在-20℃，每次PCR使用1μl。用一组mTOR特异性引物实施RT-PCR。扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)和β-肌动蛋白的特异性片段，用作第一链DNA的加样和质量对照。

实施例2：人组织中mTOR的RNA印迹分析

为了研究存在mTOR剪接形式或全长蛋白的蛋白酶解降解这些可能性，开始进行自一组人组织纯化的总RNA样品(OriGene)的RNA印迹分析。用DIG-标记mTOR探针(750bp)探测膜，该探针对应于mTOR的C-末端编码区。在该分析中，观察到存在与mTOR探针特异性杂交的若干条带(图2)。如预期的一样，还观察到对应于全长mTOR转录物的在身体各组织表达的大约8.6Kb的条带。另外，在1.5-3.5Kb区内有若干个明显的条带，它们在肝脏和心脏中有高丰度。最强的信号对应于2.7Kb和3.2Kb的条带。在蛋白印迹分析和RNA印迹分析中获得的结果都强烈暗示存在mTOR剪接形式。RNA印迹分析还表明mTORβ在心脏和肝中高度表达，而在肾、肝、血液、小肠和大肠中具有最高的mTORβ蛋白水平。

RNA印迹分析实验程序

来自人的各种组织的含聚(A)⁺RNA膜样品购自OriGene。用DIGNorthern Starter试剂盒(Roche Diagnostics)按厂商建议进行RNA印迹分析。用对应于mTOR C-末端编码区的750bp的PCR产物，作为用地高辛(dioxigenin)-11-UTP体外转录反应的模板，产生mTOR的DIG-标记的RNA探针。由厂商供应肌动蛋白探针。

实施例3：mTORβ免疫沉淀

为了进一步检查所观察的免疫反应带的特性，用C-末端多克隆抗体(Cell Signalling)从Hek293、MCF7和Hep2G细胞免疫沉淀mTOR，并用N-末端mTOR抗体在蛋白印迹中探测免疫复合体。如图3所示，在来自所有三种细胞系的免疫沉淀物中清晰地检测到范围为280kDa-80kDa的免疫反应带。然而，通过用F11单克隆抗体免疫沉淀来自这些细胞系的mTOR，仅观察到一个280kDa的免疫反应条带(数据未列出)。所获得的结果强烈地提示存在潜在的mTOR剪接形式，其同时具有N-和C-末端序列两者并编码大约700个氨基酸长度的蛋白。因此，在mTOR RNA印迹中检测到的含量最丰富的2.7Kb和3.2Kb转录体，可能编码80kDa的剪接变体。

免疫沉淀实验程序

用冰冷的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤HEK293细胞，用含50mMHEPES(pH7.5)、150mM NaCl、1％(v/v)Triton X100、2mM EDTA、50mM氟化钠、10mM焦磷酸钠、1mM原钒酸钠和蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Science)的裂解缓冲液提取。以10,000Xg在4℃下将全细胞提取物离心30分钟。用固定在蛋白A-琼脂糖珠粒(Amersham Biosciences)上的对应的抗体在4℃下免疫沉淀内源性蛋白或瞬时表达的蛋白3小时。然后用如下缓冲液洗涤免疫复合体一次：含0.05％Tween 20的Tris-缓冲盐水、含1％Triton X-100的洗涤缓冲液1(Wash Buffer1)(50mM HEPES[pH7.5]、40mM NaCl和2mMEDTA)、含500mM LiCl和0.5％Triton X-100的洗涤缓冲液1、含500mM LiCl的洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2(50mM HEPES[pH7.5]和150mM NaCl)。对于Raptor或Rictor免疫沉淀研究，在冰冷的缓冲液B(含代替Triton X-100的0.3％CHAPS的缓冲液A)中裂解细胞。在缓冲液B中洗涤mTOR免疫沉淀物四次，在洗涤缓冲液2中洗涤2次。将免疫复合体用于免疫印迹或用于体外激酶反应。

实施例4：mTORβ的鉴定

为了证明一种或多种mTOR剪接形式的存在，通过采用一组mTOR特异性寡核苷酸和若干种人细胞系，进行了基于PCR的对相应cDNA的搜索。在该分析中，使用了其中观察到潜在的剪接变体的Hek293和MCF7细胞系。另外，还检查了肝癌细胞系Hep2G，因为在RNA印迹和蛋白印迹中发现肝具有若干潜在的mTOR剪接变体。开始时，用SV Total RNA Isolation System(Promega)从指数生长的细胞中纯化总RNA。然后，通过用ReverAid H Minus First Strand cDNA合成试剂盒(Fermentas)，将纯化自各细胞系的等量RNA转化为第一链cDNA。通过PCR扩增肌动蛋白和GADPH片段来检测所产生的第一链cDNA的质量。图4显示从所有细胞系的cDNA制备物中PCR扩增得到几乎等量的GADPH(570bp)和β-肌动蛋白(350bp)的PCR产物。用各种mTOR特异性引物组对所产生的第一链cDNA进行延伸PCR分析(extensive PCR analysis)，产生一组扩增片段。从凝胶切下最突出的条带并测序。在获得的mTOR序列中，鉴定出一个含有潜在剪接变体的mTOR序列。用N-末端引物(N1，ATGCTTGGAACCGGACCTGCCG(SEQ ID NO：5))和位于FATN结构域末端的第二引物(C3，TTTGGACAGATCCTCAGTGACCT(SEQID NO：6))扩增大约100bp的该PCR片段。重要的是注意到该PCR产物均得以从所有三种细胞系特异性扩增(参见图4A)。如图4B所示，所扩增的片段含有对应于mTOR的N-末端区和FATN结构域的序列。所产生的序列的翻译清楚地表明在剪接位点处阅读框的连续性(参见图4C)。该mTOR剪接形式可能编码706个氨基酸长度的蛋白，该蛋白由mTOR的N-末端终端23个氨基酸和一段683个氨基酸的C-末端序列组成。

为了获得该潜在的mTOR剪接形式的全长编码序列，用终端N1(ATGCTTGGAACCGGACCTGCCG(SEQ ID NO：7))和C1(TTACCAGAAAGGGCACCA(SEQ ID NO：8))mTOR特异性引物由第一链cDNA进行PCR扩增。通过该方法，从Hek293第一链cDNA扩增得到大约2.3Kb的条带。对从N-和C-末端扩增的条带的初始序列分析，确证了所预测的mTOR剪接变体的存在。

然后对所扩增的PCR产物进行全序列测序，发现其核苷酸序列(SEQ ID NO：1))在68-72位核苷酸处具有mTORβ特异性内含子/外显子。所获得的序列具有能够编码706个氨基残基的蛋白(SEQ ID NO：1)的可读框。用箭头指示在mTORα的N-末端(1-23位氨基酸)和C-末端(1867-2549位氨基酸)之间的剪接融合位置。

所鉴定的mTOR剪接形式被称为“mTORβ”和全长蛋白(mTORα)。与全长mTORα相反，mTORβ剪接形式缺少所有HEAT结构域和FATN结构域的主要部分(参见图5)。HEAT结构域参与介导蛋白间的相互作用。发现在mTOR中对应于HEAT结构域的序列与Raptor和Rictor相互作用，Raptor和Rictor在mTOR信号传导中起关键作用。此外，研究显示HEAT结构域区内的序列将mTOR定位于内质网和高尔基体。新近的研究表明，FAT结构域具有HEAT样结构，并且可能也参与蛋白间的相互作用。mTORβ具有完整的FRB(FKBP12/雷帕霉素结合)结构域、激酶结构域和FATC结构域。这些结构域的存在提示mTORβ可用作蛋白激酶，并可由雷帕霉素及雷帕霉素的类似物调节其功能。另外，mTORβ含有来自N-末端终端的功能未明的23个氨基酸和FATN结构域的C-末端部分。FATN C-末端区域的生物信息分析表明存在HEAT样结构域，这可能促进与调节蛋白(例如Rictor和Raptor)的相互作用。

实施例5：mTORβ调节作用和细胞功能

在鉴定并克隆mTORβ后，开始了研究其调节和细胞功能的工作。首先，将全长mTORβ克隆到pcDNA3.1表达载体中，并与N-末端FLAG-标志物表位在同一个读码框内。为了检查FLAG-mTORβ的表达水平、分子量和调节，用pcDNA3.1或pcDNA3.1/FLAG-mTORβ瞬时转染Hek293细胞。转染后一天，让细胞血清饥饿36小时，在存在或缺少雷帕霉素下孵育30分钟。在血清刺激1小时后，裂解细胞，将裂解液用于蛋白印迹或免疫沉淀。当用抗mTOR多克隆抗体(CellSignalling)与所裂解细胞的上清液进行免疫印迹时，很明显pcDNA3.1/FLAG-mTORβ质粒引导了大约80kDa分子量的蛋白的表达(参见图6A，下图)。在用pcDNA3.1或pcDNA3.1/FLAG-mTORβ转染的Hek293细胞中明显观察到mTORβ的内源性表达。由于存在FLAG表位，当与内源性mTORβ的迁移率比较时，FLAG-mTORβ的迁移率稍微较慢。这一分析还表明用血清饥饿/刺激细胞不影响过量表达的内源性mTORβ的水平或凝胶迁移率。还观察到在用雷帕霉素处理后没有显著变化。

已知用血清或生长因子(例如IGF1)刺激细胞会诱导mTORα在S2448上的磷酸化作用。最初发现mTORα在S2448的磷酸化作用由PKB/Akt介导。然而，最近的研究提供强力证据表明S6K参与对S2448的磷酸化作用。为了查明mTORβ是否在与完整mTORα氨基酸的S2448相对应的丝氨酸残基处因响应血清刺激而被磷酸化，用S2448磷酸化特异性抗体探测由上述实验获得的裂解液。如图6A(上图)所示，血清刺激强烈地诱导在与完整mTORα氨基酸序列的S2448相对应的丝氨酸残基处对过量表达的内源性mTORβ的磷酸化。此外，该磷酸化事件对雷帕霉素敏感。所获得的数据证明：与mTORα相似，在与完整mTORα氨基酸序列的S2448对应的丝氨酸残基处对mTORβ的磷酸化因响应血清刺激而被诱导，并且对雷帕霉素敏感。

mTORβ能使作为mTORα的主要生理学底物的S6K和4E-BP1磷酸化吗？为了回答该问题，从瞬时转染的Hek293细胞免疫沉淀FLAG-mTORβ或FLAG-TORα。然后将免疫复合体用于含低温ATP和重组4E-BP1或His-S6K1C的mTOR激酶反应物中。通过SDS-PAGE分离激酶反应物，用磷酸化特异性抗体pT389-S6K1和pS65-4E-BP1进行免疫印迹。图6B明确地证明了mTORβ可在体外使S6K1和4E-BP1二者磷酸化，但磷酸化程度低于mTORα。

来自各实验室的研究表明，mTOR需要结合配偶体Raptor和Rictor用于磷酸化其下游底物：S6K、4E-BP1和PKB/Akt。考虑到这一点，测试了mTORβ与已知的mTOR结合配偶体的相互作用。在该研究中，用pcDNA3.1/FLAG-mTORβ和pRK-Raptor-HA或pcDNA3.1/FLAG-mTORβ和pRK/Rictor-Myc或pcDNA3.1/FLAG-mTORβ和pcRK-GβL瞬时转染HEK293细胞。用抗FLAG单克隆抗体或对照非特异性抗体免疫沉淀所裂解细胞的上清液。通过SDS-PAGE分离免疫复合体即来自所转染细胞的总细胞裂解液，用各种抗体进行免疫印迹。图7清楚地显示外源性表达的Raptor、Rictor和GβL与体内mTORβ形成特异性复合体。在免疫沉淀测定法中用无关的抗体测试了相互作用的特异性。因此，与全长mTORα相似，剪接形式也能够与Raptor、Rictor和GβL缔合。它还能在体外使S6K1和4E-BP1磷酸化。

如上所述，mTORβ拥有完整的FRB结构域。因此，比较mTORα与mTORβ对雷帕霉素的敏感性是令人感兴趣的。在该研究中，用pcDNA 3.1/FLAG-mTORβ、pcDNA 3.1/FLAG-mTORα或pcDNA3.1瞬时转染HEK293细胞。一天后，让细胞饥饿24小时，用10％FCS刺激1小时。在血清刺激之前30分钟加入各种浓度的雷帕霉素(1nM、5nM和10nM)。通过SDS-PAGE分离所裂解细胞的上清液，用各种抗体进行免疫印迹。通过用C-末端mTOR多克隆抗体的免疫印迹确证mTORα和mTORβ的表达(参见图8)。用一组针对S6K1(pT389)和4E-BP1(pS70、pS37/46)中的已知的mTOR磷酸化作用位点的磷酸化特异性抗体来探测膜，结果表明：当与用单独的载体或用pcDNA31/mTORα转染的细胞比较时，表达mTORβ的细胞对雷帕霉素的敏感性更低。值得注意的是，用低剂量雷帕霉素例如1nM处理的细胞的敏感性更加明显。

先前的研究发现mTORα主要存在于内质网和高尔基体的膜部分。此外，在线粒体外膜上和细胞核中也观察到mTOR。位于全长mTOR的HEAT结构域区(HEAT结构域18和19)的序列参与介导其膜定位。考虑到在mTORβ中不存在HEAT和FATN结构域，通过分级分离(fractionation)来检查其亚细胞定位是令人感兴趣的。用ProteoExstract提取试剂盒(Calbiochem)对指数生长的HEK293细胞进行分级分离。用抗mTOR C-末端抗体从所有分离物中免疫沉淀mTORα和mTORβ二者。通过SDS-PAGE分离免疫复合体，用抗mTOR N-末端抗体进行免疫印迹。如预期的一样，在所获得的细胞质、细胞核和细胞膜分离物中检测到mTORα。与此相反，mTORβ主要定位在细胞质中(参见图9)。通过用抗4E-BP1抗体、抗HSP60抗体和抗c-Jun抗体免疫印迹来分析所制备的亚细胞分离物的质量。采用常用的免疫荧光分析，以研究经瞬时转染的Hek293细胞(饥饿的/刺激的和响应细胞应激的细胞)中Myc-mTORα和mTORβ的亚细胞定位。

为了进一步研究mTORβ在调节细胞过程中的作用，制备Hek293稳定细胞系，其过量表达mTORβ野生型或mTORα野生型。另外，还开发了过量表达EGFP的细胞系(增强的绿色荧光蛋白)，其可在mTORβ研究中用作对照。对所产生的细胞系进行的初始检查表明，当与mTORα或GFP表达细胞比较时，表达野生型mTORβ的细胞生长得更快。考虑到这一点，用来自Promega的细胞增殖测定来研究所产生的稳定细胞系的增殖率。将过量表达mTORβwt(野生型)、mTORαwt或EGFP的稳定细胞系以各个密度接种到96孔板中，在标准条件下培养7天。然后用基于刃天青的测定法测量各孔中的细胞数目。在6个独立的研究中，发现表达mTORβ的细胞与对照细胞相比增殖得更快(参见图10)。与此相反，表达mTORαwt的细胞与对照细胞相比在增殖方面没有差异。这确证了mTORβ而非mTORα对细胞增殖的调节作用。

为了研究mTORβ激酶活性是否在调节细胞增殖中起作用，在过量表达mTORβ野生型、无激酶活性mTORβ(KD)突变体或EGFP的Hek293细胞系中进行了相似的实验。将细胞以各种浓度接种在96孔板中，在标准条件下培养5天。然后用基于刃天青的测定法测量各孔中的细胞数目。在6个独立的研究中，发现表达mTORβ的细胞与对照细胞相比以大约1.6倍的更快速度增殖(参见图11)。所获得的数据还表明：当mTORβKD突变体在Hek293细胞中表达时，其对细胞增殖没有显著的负面作用。其表现出稍微相反的作用(opposite effect)，但过量表达mTORβKD的细胞比EGFP细胞在某种程度上生长得更快。

还认为的是，mTORβ对细胞增殖的诱导作用可被各种信号传导途径转导。检查了这些途径之一，其为经由原癌基因Myc的信号传导。已知原癌基因Myc通过其调节大量基因转录的能力来影响细胞的生长、增殖、分化和凋亡。cMyc还参与调节肿瘤进展，包括遗传稳定性、转移和血管生成。因此，cMyc蛋白的表达和功能受到严密控制。当然，业已鉴定了在转录和翻译水平上调节cMyc表达和通过翻译后修饰调节其蛋白功能的很多不同的途径和因子。在调节细胞增殖过程中，c-My调控以下基因的表达：所述基因参与细胞周期的G1/S转换。经由mTOR途径的信号传导对于细胞周期在G1/S期的进展起主要促成作用。此外，雷帕霉素为已知的细胞周期G1/S转换的抑制剂。

为了测试cMyc是否参与mTORβ诱导的增殖，用pEGFP、pcDNA3.1/mTORβwt、pcDNA 3.1/mTORβ无激酶活性突变体或pcDNA3.1/mTORαwt瞬时转染HEK293细胞。裂解转染细胞2天后，通过SDS-PAGE分离，用针对c-myc及其转录靶标的抗体(例如抗Myc(9E10)单克隆抗体)进行免疫印迹。图10B所示结果清楚地证明，mTORβ而非mTORα的过量表达导致c-Myc蛋白水平显著增加。对c-Myc翻译的诱导依赖于mTORβ激酶活性，因为mTORβ的无激酶活性突变体不刺激c-Myc表达(图11B)。用C-末端mTOR抗体进行免疫印迹来监测瞬时表达的mTORα、mTORβwt和KD突变体的表达水平。发现mTORβwt的过量表达提高了Myc表达水平。还发现过量表达mTORβ的Hek293细胞比过量表达mTORα的细胞更快地从山梨醇诱导的应激中恢复。

为了进一步调查mTORβ在细胞周期中所起的作用，用BrdU脉冲标记过量表达mTORβ、mTORα或EGFP的Hek293细胞30分钟，并在24小时内每2小时追踪一次。通过FACS分析测量掺入到细胞的BrdU。测定各细胞系所观察到的细胞周期的G1、S和G2期持续时间(参见图12)。S和G2期的持续时间在所有三种细胞群中是相似的。然而，G1期持续时间在过量表达mTORβ的细胞中比在mTORα或对照细胞中更短。这提示mTORβ对细胞周期的G1期进展至关重要。

还评价了mTORβ在血清饥饿细胞中的作用。让过量表达mTORβwt、mTORαwt、无激酶活性mTORβ或EGFP的Hek293稳定细胞系血清饥饿60小时。通过锥虫蓝染料排除测定法评估细胞存活率。发现mTORβwt的过量表达保护细胞免遭饥饿诱导的细胞死亡(参见图13A)，且mTORβ激酶活性为介导该作用所需(参见图13B)。

为了进一步研究mTORβ表达对细胞致癌可能性的作用，将稳定过量表达mTORβ、mTORα或EGFP的Hek293细胞铺板到培养基的薄层琼脂糖中。14天后，用MTT染色各集落(参见图14A)。用quantity1软件(Bio-Rad)计集落数，并用倍数作图(参见图14B)。发现与过量表达mTORα的细胞和对照细胞相比，mTORβ过量表达导致细胞致癌可能性增加。

体外激酶测定的实验程序

按照先前出版物实施mTOR体外激酶测定(Kim等，2002)。简而言之，在30μl中于30℃下进行40分钟激酶测定，其中含有约四分之一的来自5×10⁶个HEK293细胞的mTOR免疫沉淀物、1μg的4E-BP1(Calbiochem)或0.5μg重组His-S6K1C、25mM HEPES-KOH(pH7.4)、50mM KC1、20％甘油、10mM MgCl₂、4mM MnCl₂、1mM DTT和50μM ATP。通过加入5×样品缓冲液终止反应，通过SDS-PAGE分离，由免疫印迹分析。

免疫印迹分析的实验程序

通过SDS-PAGE分离免疫复合体或总细胞裂解液，转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上并用封闭溶液(5％牛奶、Tris-缓冲盐水/Tween 0.1％)孵育1小时。然后用第一抗体在4℃下过夜探测被封闭的膜。在用含0.1％Tween的Tris-缓冲盐水充分洗涤(extensive wash)该膜后，用缀合辣根过氧化物酶的第二抗体在室温孵育1小时。用ECL系统(Millipore)检测抗原-抗体复合体。当需要重新探测免疫印迹时，开始时先剥洗该膜(Restore Western Stripping Reagent，Pierce)并与另一类型的第一抗体孵育。

亚细胞分级分离的实验程序

用ProteoExstract提取试剂盒(Calbiochem)按厂商建议进行HEK293细胞的亚细胞分级分离。用抗mTOR C-末端抗体从所有分离物中免疫沉淀mTORα和mTORβ。通过SDS-PAGE分离免疫复合体，用抗mTOR N-末端抗体进行免疫印迹。分别用抗4E-BP1、HSP60和c-Jun抗体作为细胞质、细胞膜和细胞核的对照。

稳定细胞系制备和细胞增殖测定的实验程序

通过将线性化的pcDNA 3.1/FLAG-Torβwt或pcDNA 3.1FLAGTorβ无激酶活性载体转染到HEK293细胞来制备过量表达野生型和无激酶活性的mTORβ的稳定细胞系。按照厂商(Invitrogen)建议让细胞系在500μg/ml genetecin中选择10天。为了进行细胞增殖测定，将过量表达mTORβwt、无激酶活性的mTORβ和EGFP的Hek293稳定细胞系以各种密度(每孔250、500、1000和2000个细胞)接种到96孔板，在标准条件下生长5天。然后按厂商建议用基于刃天青的测定(CellTiter Blue Promega)测量各孔细胞数目。用来自至少6个独立实验的数据计算各细胞系的标准化生长曲线。

尽管在本文中通过引用各种具体材料、方法和实例阐述并阐明了本发明，但应该理解，本发明不限于为该目的而选定的材料和方法的特定组合。本领域技术人员应了解可能包含的所述详细内容的多种变体。应认为说明和实施例仅意欲举例，本发明的真正范围和精神由以上权利要求指出。在本申请中提及的所有参考文献、专利和专利申请皆以其整体在此引作参考。

序列表

<110>路德维格癌症研究所和UCL商业有限公司

<120>哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)蛋白的截短变体

<130>N.101831 WO

<160>10

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>2121

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

atgcttggaa ccggacctgc cgccgccacc accgctgcca ccacatctag caatgtgagc  60

gtcctgcaga agaaggtcac tgaggatctg tccaaaaccc tcctgatgta cacggtgcct  120

gccgtccagg gcttcttccg ttccatctcc ttgtcacgag gcaacaacct ccaggataca  180

ctcagagttc tcaccttatg gtttgattat ggtcactggc cagatgtcaa tgaggcctta  240

gtggaggggg tgaaagccat ccagattgat acctggctac aggttatacc tcagctcatt  300

gcaagaattg atacgcccag acccttggtg ggacgtctca ttcaccagct tctcacagac  360

attggtcggt accaccccca ggccctcatc tacccactga cagtggcttc taagtctacc  420

acgacagccc ggcacaatgc agccaacaag attctgaaga acatgtgtga gcacagcaac  480

accctggtcc agcaggccat gatggtgagc gaggagctga tccgagtggc catcctctgg  540

catgagatgt ggcatgaagg cctggaagag gcatctcgtt tgtactttgg ggaaaggaac  600

gtgaaaggca tgtttgaggt gctggagccc ttgcatgcta tgatggaacg gggcccccag  660

actctgaagg aaacatcctt taatcaggcc tatggtcgag atttaatgga ggcccaagag  720

tggtgcagga agtacatgaa atcagggaat gtcaaggacc tcacccaagc ctgggacctc  780

tattatcatg tgttccgacg aatctcaaag cagctgcctc agctcacatc cttagagctg  840

caatatgttt ccccaaaact tctgatgtgc cgggaccttg aattggctgt gccaggaaca  900

tatgacccca accagccaat cattcgcatt cagtccatag caccgtcttt gcaagtcatc  960

acatccaagc agaggccccg gaaattgaca cttatgggca gcaacggaca tgagtttgtt  1020

ttccttctaa aaggccatga agatctgcgc caggatgagc gtgtgatgca gctcttcggc  1080

ctggttaaca cccttctggc caatgaccca acatctcttc ggaaaaacct cagcatccag  1140

agatacgctg tcatcccttt atcgaccaac tcgggcctca ttggctgggt tccccactgt  1200

gacacactgc acgccctcat ccgggactac agggagaaga agaagatcct tctcaacatc  1260

gagcatcgca tcatgttgcg gatggctccg gactatgacc acttgactct gatgcagaag  1320

gtggaggtgt ttgagcatgc cgtcaataat acagctgggg acgacctggc caagctgctg  1380

tggctgaaaa gccccagctc cgaggtgtgg tttgaccgaa gaaccaatta tacccgttct  1440

ttagcggtca tgtcaatggt tgggtatatt ttaggcctgg gagatagaca cccatccaac  1500

ctgatgctgg accgtctgag tgggaagatc ctgcacattg actttgggga ctgctttgag  1560

gttgctatga cccgagagaa gtttccagag aagattccat ttagactaac aagaatgttg  1620

accaatgcta tggaggttac aggcctggat ggcaactaca gaatcacatg ccacacagtg  1680

atggaggtgc tgcgagagca caaggacagt gtcatggccg tgctggaagc ctttgtctat  1740

gaccccttgc tgaactggag gctgatggac acaaatacca aaggcaacaa gcgatcccga  1800

acgaggacgg attcctactc tgctggccag tcagtcgaaa ttttggacgg tgtggaactt  1860

ggagagccag cccataagaa aacggggacc acagtgccag aatctattca ttctttcatt  1920

ggagacggtt tggtgaaacc agaggcccta aataagaaag ctatccagat tattaacagg  1980

gttcgagata agctcactgg tcgggacttc tctcatgatg acactttgga tgttccaacg  2040

caagttgagc tgctcatcaa acaagcgaca tcccatgaaa acctctgcca gtgctatatt  2100

ggctggtgcc ctttctggta a                                            2121

<210>2

<211>706

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

Met Leu Gly Thr Gly Pro Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ser

1               5                   10                  15

Ser Asn Val Ser Val Leu Gln Lys Lys Val Thr Glu Asp Leu Ser Lys

            20                  25                  30

Thr Leu Leu Met Tyr Thr Val Pro Ala Val Gln Gly Phe Phe Arg Ser

        35                  40                  45

Ile Ser Leu Ser Arg Gly Asn Asn Leu Gln Asp Thr Leu Arg Val Leu

    50                  55                  60

Thr Leu Trp Phe Asp Tyr Gly His Trp Pro Asp Val Asn Glu Ala Leu

65                  70                  75                  80

Val Glu Gly Val Lys Ala Ile Gln Ile Asp Thr Trp Leu Gln Val Ile

                85                  90                  95

Pro Gln Leu Ile Ala Arg Ile Asp Thr Pro Arg Pro Leu Val Gly Arg

            100                 105                 110

Leu Ile His Gln Leu Leu Thr Asp Ile Gly Arg Tyr His Pro Gln Ala

        115                 120                 125

Leu Ile Tyr Pro Leu Thr Val Ala Ser Lys Ser Thr Thr Thr Ala Arg

    130                 135                 140

His Asn Ala Ala Asn Lys Ile Leu Lys Asn Met Cys Glu His Ser Asn

145                 150                 155                 160

Thr Leu Val Gln Gln Ala Met Met Val Ser Glu Glu Leu Ile Arg Val

                165                 170                 175

Ala Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser

            180                 185                 190

Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu

        195                 200                 205

Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu

    210                 215                 220

Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu

225                 230                 235                 240

Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln

                245                 250                 255

Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Gln Leu

            260                 265                 270

Pro Gln Leu Thr Ser Leu Glu Leu Gln Tyr Val Ser Pro Lys Leu Leu

        275                 280                 285

Met Cys Arg Asp Leu Glu Leu Ala Val Pro Gly Thr Tyr Asp Pro Asn

    290                 295                 300

Gln Pro Ile Ile Arg Ile Gln Ser Ile Ala Pro Ser Leu Gln Val Ile

305                 310                 315                 320

Thr Ser Lys Gln Arg Pro Arg Lys Leu Thr Leu Met Gly Ser Asn Gly

                325                 330                 335

His Glu Phe Val Phe Leu Leu Lys Gly His Glu Asp Leu Arg Gln Asp

            340                 345                 350

Glu Arg Val Met Gln Leu Phe Gly Leu Val Asn Thr Leu Leu Ala Asn

        355                 360                 365

Asp Pro Thr Ser Leu Arg Lys Asn Leu Ser Ile Gln Arg Tyr Ala Val

    370                 375                 380

Ile Pro Leu Ser Thr Asn Ser Gly Leu Ile Gly Trp Val Pro His Cys

385                 390                 395                 400

Asp Thr Leu His Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Arg Glu Lys Lys Lys Ile

                405                 410                 415

Leu Leu Asn Ile Glu His Arg Ile Met Leu Arg Met Ala Pro Asp Tyr

            420                 425                 430

Asp His Leu Thr Leu Met Gln Lys Val Glu Val Phe Glu His Ala Val

        435                 440                 445

Asn Asn Thr Ala Gly Asp Asp Leu Ala Lys Leu Leu Trp Leu Lys Ser

    450                 455                 460

Pro Ser Ser Glu Val Trp Phe Asp Arg Arg Thr Asn Tyr Thr Arg Ser

465                 470                 475                 480

Leu Ala Val Met Ser Met Val Gly Tyr Ile Leu Gly Leu Gly Asp Arg

                485                 490                 495

His Pro Ser Asn Leu Met Leu Asp Arg Leu Ser Gly Lys Ile Leu His

            500                 505                 510

Ile Asp Phe Gly Asp Cys Phe Glu Val Ala Met Thr Arg Glu Lys Phe

        515                 520                 525

Pro Glu Lys Ile Pro Phe Arg Leu Thr Arg Met Leu Thr Asn Ala Met

    530                 535                 540

Glu Val Thr Gly Leu Asp Gly Asn Tyr Arg Ile Thr Cys His Thr Val

545                 550                 555                 560

Met Glu Val Leu Arg Glu His Lys Asp Ser Val Met Ala Val Leu Glu

                565                 570                 575

Ala Phe Val Tyr Asp Pro Leu Leu Asn Trp Arg Leu Met Asp Thr Asn

            580                 585                 590

Thr Lys Gly Asn Lys Arg Ser Arg Thr Arg Thr Asp Ser Tyr Ser Ala

        595                 600                 605

Gly Gln Ser Val Glu Ile Leu Asp Gly Val Glu Leu Gly Glu Pro Ala

    610                 615                 620

His Lys Lys Thr Gly Thr Thr Val Pro Glu Ser Ile His Ser Phe Ile

625                 630                 635                 640

Gly Asp Gly Leu Val Lys Pro Glu Ala Leu Asn Lys Lys Ala Ile Gln

                645                 650                 655

Ile Ile Asn Arg Val Arg Asp Lys Leu Thr Gly Arg Asp Phe Ser His

            660                 665                 670

Asp Asp Thr Leu Asp Val Pro Thr Gln Val Glu Leu Leu Ile Lys Gln

        675                 680                 685

Ala Thr Ser His Glu Asn Leu Cys Gln Cys Tyr Ile Gly Trp Cys Pro

    690                 695                 700

Phe Trp

705

<210>3

<211>7943

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>3

acggggcctg aagcggcggt accggtgctg gcggcggcag ctgaggcctt ggccgaagcc  60

gcgcgaacct cagggcaaga tgcttggaac cggacctgcc gccgccacca ccgctgccac  120

cacatctagc aatgtgagcg tcctgcagca gtttgccagt ggcctaaaga gccggaatga  180

ggaaaccagg gccaaagccg ccaaggagct ccagcactat gtcaccatgg aactccgaga  240

gatgagtcaa gaggagtcta ctcgcttcta tgaccaactg aaccatcaca tttttgaatt  300

ggtttccagc tcagatgcca atgagaggaa aggtggcatc ttggccatag ctagcctcat  360

aggagtggaa ggtgggaatg ccacccgaat tggcagattt gccaactatc ttcggaacct  420

cctcccctcc aatgacccag ttgtcatgga aatggcatcc aaggccattg gccgtcttgc  480

catggcaggg gacactttta ccgctgagta cgtggaattt gaggtgaagc gagccctgga  540

atggctgggt gctgaccgca atgagggccg gagacatgca gctgtcctgg ttctccgtga  600

gctggccatc agcgtcccta ccttcttctt ccagcaagtg caacccttct ttgacaacat  660

ttttgtggcc gtgtgggacc ccaaacaggc catccgtgag ggagctgtag ccgcccttcg  720

tgcctgtctg attctcacaa cccagcgtga gccgaaggag atgcagaagc ctcagtggta  780

caggcacaca tttgaagaag cagagaaggg atttgatgag accttggcca aagagaaggg  840

catgaatcgg gatgatcgga tccatggagc cttgttgatc cttaacgagc tggtccgaat  900

cagcagcatg gagggagagc gtctgagaga agaaatggaa gaaatcacac agcagcagct  960

ggtacacgac aagtactgca aagatctcat gggcttcgga acaaaacctc gtcacattac  1020

ccccttcacc agtttccagg ctgtacagcc ccagcagtca aatgccttgg tggggctgct  1080

ggggtacagc tctcaccaag gcctcatggg atttgggacc tcccccagtc cagctaagtc  1140

caccctggtg gagagccggt gttgcagaga cttgatggag gagaaatttg atcaggtgtg  1200

ccagtgggtg ctgaaatgca ggaatagcaa gaactcgctg atccaaatga caatccttaa  1260

tttgttgccc cgcttggctg cattccgacc ttctgccttc acagataccc agtatctcca  1320

agataccatg aaccatgtcc taagctgtgt caagaaggag aaggaacgta cagcggcctt  1380

ccaagccctg gggctacttt ctgtggctgt gaggtctgag tttaaggtct atttgcctcg  1440

cgtgctggac atcatccgag cggccctgcc cccaaaggac ttcgcccata agaggcagaa  1500

ggcaatgcag gtggacgcca cagtcttcac ttgcatcagc atgctggctc gagcaatggg  1560

gccaggcatc cagcaggata tcaaggagct gctggagccc atgctggcag tgggactaag  1620

ccctgccctc actgcagtgc tctacgacct gagccgtcag attccacagc taaagaagga  1680

cattcaagat gggctactga aaatgctgtc cctggtcctt atgcacaaac cccttcgcca  1740

cccaggcatg cccaagggcc tggcccatca gctggcctct cctggcctca cgaccctccc  1800

tgaggccagc gatgtgggca gcatcactct tgccctccga acgcttggca gctttgaatt  1860

tgaaggccac tctctgaccc aatttgttcg ccactgtgcg gatcatttcc tgaacagtga  1920

gcacaaggag atccgcatgg aggctgcccg cacctgctcc cgcctgctca caccctccat  1980

ccacctcatc agtggccatg ctcatgtggt tagccagacc gcagtgcaag tggtggcaga  2040

tgtgcttagc aaactgctcg tagttgggat aacagatcct gaccctgaca ttcgctactg  2100

tgtcttggcg tccctggacg agcgctttga tgcacacctg gcccaggcgg agaacttgca  2160

ggccttgttt gtggctctga atgaccaggt gtttgagatc cgggagctgg ccatctgcac    2220

tgtgggccga ctcagtagca tgaaccctgc ctttgtcatg cctttcctgc gcaagatgct    2280

catccagatt ttgacagagt tggagcacag tgggattgga agaatcaaag agcagagtgc    2340

ccgcatgctg gggcacctgg tctccaatgc cccccgactc atccgcccct acatggagcc    2400

tattctgaag gcattaattt tgaaactgaa agatccagac cctgatccaa acccaggtgt    2460

gatcaataat gtcctggcaa caataggaga attggcacag gttagtggcc tggaaatgag    2520

gaaatgggtt gatgaacttt ttattatcat catggacatg ctccaggatt cctctttgtt    2580

ggccaaaagg caggtggctc tgtggaccct gggacagttg gtggccagca ctggctatgt    2640

agtagagccc tacaggaagt accctacttt gcttgaggtg ctactgaatt ttctgaagac    2700

tgagcagaac cagggtacac gcagagaggc catccgtgtg ttagggcttt taggggcttt    2760

ggatccttac aagcacaaag tgaacattgg catgatagac cagtcccggg atgcctctgc    2820

tgtcagcctg tcagaatcca agtcaagtca ggattcctct gactatagca ctagtgaaat    2880

gctggtcaac atgggaaact tgcctctgga tgagttctac ccagctgtgt ccatggtggc    2940

cctgatgcgg atcttccgag accagtcact ctctcatcat cacaccatgg ttgtccaggc    3000

catcaccttc atcttcaagt ccctgggact caaatgtgtg cagttcctgc cccaggtcat    3060

gcccacgttc cttaatgtca ttcgagtctg tgatggggcc atccgggaat ttttgttcca    3120

gcagctggga atgttggtgt cctttgtgaa gagccacatc agaccttata tggatgaaat    3180

agtcaccctc atgagagaat tctgggtcat gaacacctca attcagagca cgatcattct    3240

tctcattgag caaattgtgg tagctcttgg gggtgaattt aagctctacc tgccccagct    3300

gatcccacac atgctgcgtg tcttcatgca tgacaacagc ccaggccgca ttgtctctat    3360

caagttactg gctgcaatcc agctgtttgg cgccaacctg gatgactacc tgcatttact    3420

gctgcctcct attgttaagt tgtttgatgc ccctgaagct ccactgccat ctcgaaaggc    3480

agcgctagag actgtggacc gcctgacgga gtccctggat ttcactgact atgcctcccg    3540

gatcattcac cctattgttc gaacactgga ccagagccca gaactgcgct ccacagccat    3600

ggacacgctg tcttcacttg tttttcagct ggggaagaag taccaaattt tcattccaat    3660

ggtgaataaa gttctggtgc gacaccgaat caatcatcag cgctatgatg tgctcatctg    3720

cagaattgtc aagggataca cacttgctga tgaagaggag gatcctttga tttaccagca    3780

tcggatgctt aggagtggcc aaggggatgc attggctagt ggaccagtgg aaacaggacc    3840

catgaagaaa ctgcacgtca gcaccatcaa cctccaaaag gcctggggcg ctgccaggag    3900

ggtctccaaa gatgactggc tggaatggct gagacggctg agcctggagc tgctgaagga    3960

ctcatcatcg ccctccctgc gctcctgctg ggccctggca caggcctaca acccgatggc    4020

cagggatctc ttcaatgctg catttgtgtc ctgctggtct gaactgaatg aagatcaaca    4080

ggatgagctc atcagaagca tcgagttggc cctcacctca caagacatcg ctgaagtcac    4140

acagaccctc ttaaacttgg ctgaattcat ggaacacagt gacaagggcc ccctgccact    4200

gagagatgac aatggcattg ttctgctggg tgagagagct gccaagtgcc gagcatatgc    4260

caaagcacta cactacaaag aactggagtt ccagaaaggc cccacccctg ccattctaga    4320

atctctcatc agcattaata ataagctaca gcagccggag gcagcggccg gagtgttaga    4380

atatgccatg aaacactttg gagagctgga gatccaggct acctggtatg agaaactgca    4440

cgagtgggag gatgcccttg tggcctatga caagaaaatg gacaccaaca aggacgaccc    4500

agagctgatg ctgggccgca tgcgctgcct cgaggccttg ggggaatggg gtcaactcca    4560

ccagcagtgc tgtgaaaagt ggaccctggt taatgatgag acccaagcca agatggcccg    4620

gatggctgct gcagctgcat ggggtttagg tcagtgggac agcatggaag aatacacctg    4680

tatgatccct cgggacaccc atgatggggc attttataga gctgtgctgg cactgcatca    4740

ggacctcttc tccttggcac aacagtgcat tgacaaggcc agggacctgc tggatgctga    4800

attaactgca atggcaggag agagttacag tcgggcatat ggggccatgg tttcttgcca    4860

catgctgtcc gagctggagg aggttatcca gtacaaactt gtccccgagc gacgagagat    4920

catccgccag atctggtggg agagactgca gggctgccag cgtatcgtag aggactggca    4980

gaaaatcctt atggtgcggt cccttgtggt cagccctcat gaagacatga gaacctggct    5040

caagtatgca agcctgtgcg gcaagagtgg caggctggct cttgctcata aaactttagt    5100

gttgctcctg ggagttgatc cgtctcggca acttgaccat cctctgccaa cagttcaccc    5160

tcaggtgacc tatgcctaca tgaaaaacat gtggaagagt gcccgcaaga tcgatgcctt    5220

ccagcacatg cagcattttg tccagaccat gcagcaacag gcccagcatg ccatcgctac    5280

tgaggaccag cagcataagc aggaactgca caagctcatg gcccgatgct tcctgaaact    5340

tggagagtgg cagctgaatc tacagggcat caatgagagc acaatcccca aagtgctgca    5400

gtactacagc gccgccacag agcacgaccg cagctggtac aaggcctggc atgcgtgggc    5460

agtgatgaac ttcgaagctg tgctacacta caaacatcag aaccaagccc gcgatgagaa    5520

gaagaaactg cgtcatgcca gcggggccaa catcaccaac gccaccactg ccgccaccac    5580

ggccgccact gccaccacca ctgccagcac cgagggcagc aacagtgaga gcgaggccga    5640

gagcaccgag aacagcccca ccccatcgcc gctgcagaag aaggtcactg aggatctgtc    5700

caaaaccctc ctgatgtaca cggtgcctgc cgtccagggc ttcttccgtt ccatctcctt    5760

gtcacgaggc aacaacctcc aggatacact cagagttctc accttatggt ttgattatgg    5820

tcactggcca gatgtcaatg aggccttagt ggagggggtg aaagccatcc agattgatac    5880

ctggctacag gttatacctc agctcattgc aagaattgat acgcccagac ccttggtggg    5940

acgtctcatt caccagcttc tcacagacat tggtcggtac cacccccagg ccctcatcta    6000

cccactgaca gtggcttcta agtctaccac gacagcccgg cacaatgcag ccaacaagat    6060

tctgaagaac atgtgtgagc acagcaacac cctggtccag caggccatga tggtgagcga    6120

ggagctgatc cgagtggcca tcctctggca tgagatgtgg catgaaggcc tggaagaggc    6180

atctcgtttg tactttgggg aaaggaacgt gaaaggcatg tttgaggtgc tggagccctt    6240

gcatgctatg atggaacggg gcccccagac tctgaaggaa acatccttta atcaggccta    6300

tggtcgagat ttaatggagg cccaagagtg gtgcaggaag tacatgaaat cagggaatgt    6360

caaggacctc acccaagcct gggacctcta ttatcatgtg ttccgacgaa tctcaaagca    6420

gctgcctcag ctcacatcct tagagctgca atatgtttcc ccaaaacttc tgatgtgccg    6480

ggaccttgaa ttggctgtgc caggaacata tgaccccaac cagccaatca ttcgcattca    6540

gtccatagca ccgtctttgc aagtcatcac atccaagcag aggccccgga aattgacact    6600

tatgggcagc aacggacatg agtttgtttt ccttctaaaa ggccatgaag atctgcgcca    6660

ggatgagcgt gtgatgcagc tcttcggcct ggttaacacc cttctggcca atgacccaac    6720

atctcttcgg aaaaacctca gcatccagag atacgctgtc atccctttat cgaccaactc    6780

gggcctcatt ggctgggttc cccactgtga cacactgcac gccctcatcc gggactacag    6840

ggagaagaag aagatccttc tcaacatcga gcatcgcatc atgttgcgga tggctccgga    6900

ctatgaccac ttgactctga tgcagaaggt ggaggtgttt gagcatgccg tcaataatac    6960

agctggggac gacctggcca agctgctgtg gctgaaaagc cccagctccg aggtgtggtt    7020

tgaccgaaga accaattata cccgttcttt agcggtcatg tcaatggttg ggtatatttt    7080

aggcctggga gatagacacc catccaacct gatgctggac cgtctgagtg ggaagatcct    7140

gcacattgac tttggggact gctttgaggt tgctatgacc cgagagaagt ttccagagaa    7200

gattccattt agactaacaa gaatgttgac caatgctatg gaggttacag gcctggatgg    7260

caactacaga atcacatgcc acacagtgat ggaggtgctg cgagagcaca aggacagtgt    7320

catggccgtg ctggaagcct ttgtctatga ccccttgctg aactggaggc tgatggacac    7380

aaataccaaa ggcaacaagc gatcccgaac gaggacggat tcctactctg ctggccagtc    7440

agtcgaaatt ttggacggtg tggaacttgg agagccagcc cataagaaaa cggggaccac    7500

agtgccagaa tctattcatt ctttcattgg agacggtttg gtgaaaccag aggccctaaa    7560

taagaaagct atccagatta ttaacagggt tcgagataag ctcactggtc gggacttctc    7620

tcatgatgac actttggatg ttccaacgca agttgagctg ctcatcaaac aagcgacatc    7680

ccatgaaaac ctctgccagt gctatattgg ctggtgccct ttctggtaac tggaggccca    7740

gatgtgccca tcacgttttt tctgaggctt ttgtacttta gtaaatgctt ccactaaact    7800

gaaaccatgg tgagaaagtt tgactttgtt aaatattttg aaatgtaaat gaaaagaagt    7860

actgtatatt aaaagttggt ttgaaccaac tttctagctg ctgttgaaga atatattgtc    7920

agaaacacaa ggcttgattt ggt                                            7943

<210>4

<211>2549

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>4

Met Leu Gly Thr Gly Pro Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ser

1               5                   10                  15

Ser Asn Val Ser Val Leu Gln Gln Phe Ala Ser Gly Leu Lys Ser Arg

            20                  25                  30

Asn Glu Glu Thr Arg Ala Lys Ala Ala Lys Glu Leu Gln His Tyr Val

        35                  40                  45

Thr Met Glu Leu Arg Glu Met Ser Gln Glu Glu Ser Thr Arg Phe Tyr

    50                  55                  60

Asp Gln Leu Asn His His Ile Phe Glu Leu Val Ser Ser Ser Asp Ala

65                  70                  75                  80

Asn Glu Arg Lys Gly Gly Ile Leu Ala Ile Ala Ser Leu Ile Gly Val

                85                  90                  95

Glu Gly Gly Asn Ala Thr Arg Ile Gly Arg Phe Ala Asn Tyr Leu Arg

            100                 105                 110

Asn Leu Leu Pro Ser Asn Asp Pro Val Val Met Glu Met Ala Ser Lys

        115                 120                 125

Ala Ile Gly Arg Leu Ala Met Ala Gly Asp Thr Phe Thr Ala Glu Tyr

    130                 135                 140

Val Glu Phe Glu Val Lys Arg Ala Leu Glu Trp Leu Gly Ala Asp Arg

145                 150                 155                 160

Asn Glu Gly Arg Arg His Ala Ala Val Leu Val Leu Arg Glu Leu Ala

                165                 170                 175

Ile Ser Val Pro Thr Phe Phe Phe Gln Gln Val Gln Pro Phe Phe Asp

            180                 185                 190

Asn Ile Phe Val Ala Val Trp Asp Pro Lys Gln Ala Ile Arg Glu Gly

        195                 200                 205

Ala Val Ala Ala Leu Arg Ala Cys Leu Ile Leu Thr Thr Gln Arg Glu

    210                 215                 220

Pro Lys Glu Met Gln Lys Pro Gln Trp Tyr Arg His Thr Phe Glu Glu

225                 230                 235                 240

Ala Glu Lys Gly Phe Asp Glu Thr Leu Ala Lys Glu Lys Gly Met Asn

                245                 250                 255

Arg Asp Asp Arg Ile His Gly Ala Leu Leu Ile Leu Asn Glu Leu Val

            260                 265                 270

Arg Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu Arg Leu Arg Glu Glu Met Glu Glu

        275                 280                 285

Ile Thr Gln Gln Gln Leu Val His Asp Lys Tyr Cys Lys Asp Leu Met

    290                 295                 300

Gly Phe Gly Thr Lys Pro Arg His Ile Thr Pro Phe Thr Ser Phe Gln

305                 310                 315                 320

Ala Val Gln Pro Gln Gln Ser Asn Ala Leu Val Gly Leu Leu Gly Tyr

                325                 330                 335

Ser Ser His Gln Gly Leu Met Gly Phe Gly Thr Ser Pro Ser Pro Ala

            340                 345                 350

Lys Ser Thr Leu Val Glu Ser Arg Cys Cys Arg Asp Leu Met Glu Glu

        355                 360                 365

Lys Phe Asp Gln Val Cys Gln Trp Val Leu Lys Cys Arg Asn Ser Lys

    370                 375                 380

Asn Ser Leu Ile Gln Met Thr Ile Leu Asn Leu Leu Pro Arg Leu Ala

385                 390                 395                 400

Ala Phe Arg Pro Ser Ala Phe Thr Asp Thr Gln Tyr Leu Gln Asp Thr

                405                 410                 415

Met Asn His Val Leu Ser Cys Val Lys Lys Glu Lys Glu Arg Thr Ala

            420                 425                 430

Ala Phe Gln Ala Leu Gly Leu Leu Ser Val Ala Val Arg Ser Glu Phe

        435                 440                 445

Lys Val Tyr Leu Pro Arg Val Leu Asp Ile Ile Arg Ala Ala Leu Pro

    450                 455                 460

Pro Lys Asp Phe Ala His Lys Arg Gln Lys Ala Met Gln Val Asp Ala

465                 470                 475                 480

Thr Val Phe Thr Cys Ile Ser Met Leu Ala Arg Ala Met Gly Pro Gly

                485                 490                 495

Ile Gln Gln Asp Ile Lys Glu Leu Leu Glu Pro Met Leu Ala Val Gly

            500                 505                 510

Leu Ser Pro Ala Leu Thr Ala Val Leu Tyr Asp Leu Ser Arg Gln Ile

        515                 520                 525

Pro Gln Leu Lys Lys Asp Ile Gln Asp Gly Leu Leu Lys Met Leu Ser

    530                 535                 540

Leu Val Leu Met His Lys Pro Leu Arg His Pro Gly Met Pro Lys Gly

545                 550                 555                 560

Leu Ala His Gln Leu Ala Ser Pro Gly Leu Thr Thr Leu Pro Glu Ala

                565                 570                 575

Ser Asp Val Gly Ser Ile Thr Leu Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Phe

            580                 585                 590

Glu Phe Glu Gly His Ser Leu Thr Gln Phe Val Arg His Cys Ala Asp

        595                 600                 605

His Phe Leu Asn Ser Glu His Lys Glu Ile Arg Met Glu Ala Ala Arg

    610                 615                 620

Thr Cys Ser Arg Leu Leu Thr Pro Ser Ile His Leu Ile Ser Gly His

625                 630                 635                 640

Ala His Val Val Ser Gln Thr Ala Val Gln Val Val Ala Asp Val Leu

                645                 650                 655

Ser Lys Leu Leu Val Val Gly Ile Thr Asp Pro Asp Pro Asp Ile Arg

            660                 665                 670

Tyr Cys Val Leu Ala Ser Leu Asp Glu Arg Phe Asp Ala His Leu Ala

        675                 680                 685

Gln Ala Glu Asn Leu Gln Ala Leu Phe Val Ala Leu Asn Asp Gln Val

    690                 695                 700

Phe Glu Ile Arg Glu Leu Ala Ile Cys Thr Val Gly Arg Leu Ser Ser

705                 710                 715                 720

Met Asn Pro Ala Phe Val Met Pro Phe Leu Arg Lys Met Leu Ile Gln

                725                 730                 735

Ile Leu Thr Glu Leu Glu His Ser Gly Ile Gly Arg Ile Lys Glu Gln

            740                 745                 750

Ser Ala Arg Met Leu Gly His Leu Val Ser Asn Ala Pro Arg Leu Ile

        755                 760                 765

Arg Pro Tyr Met Glu Pro Ile Leu Lys Ala Leu Ile Leu Lys Leu Lys

    770                 775                 780

Asp Pro Asp Pro Asp Pro Asn Pro Gly Val Ile Asn Asn Val Leu Ala

785                 790                 795                 800

Thr Ile Gly Glu Leu Ala Gln Val Ser Gly Leu Glu Met Arg Lys Trp

                805                 810                 815

Val Asp Glu Leu Phe Ile Ile Ile Met Asp Met Leu Gln Asp Ser Ser

            820                 825                 830

Leu Leu Ala Lys Arg Gln Val Ala Leu Trp Thr Leu Gly Gln Leu Val

        835                 840                 845

Ala Ser Thr Gly Tyr Val Val Glu Pro Tyr Arg Lys Tyr Pro Thr Leu

    850                 855                 860

Leu Glu Val Leu Leu Asn Phe Leu Lys Thr Glu Gln Asn Gln Gly Thr

865                 870                 875                 880

Arg Arg Glu Ala Ile Arg Val Leu Gly Leu Leu Gly Ala Leu Asp Pro

                885                 890                 895

Tyr Lys His Lys Val Asn Ile Gly Met Ile Asp Gln Ser Arg Asp Ala

            900                 905                 910

Ser Ala Val Ser Leu Ser Glu Ser Lys Ser Ser Gln Asp Ser Ser Asp

        915                 920                 925

Tyr Ser Thr Ser Glu Met Leu Val Asn Met Gly Asn Leu Pro Leu Asp

    930                 935                 940

Glu Phe Tyr Pro Ala Val Ser Met Val Ala Leu Met Arg Ile Phe Arg

945                 950                 955                 960

Asp Gln Ser Leu Ser His His His Thr Met Val Val Gln Ala Ile Thr

                965                 970                 975

Phe Ile Phe Lys Ser Leu Gly Leu Lys Cys Val Gln Phe Leu Pro Gln

            980                 985                 990

Val Met Pro Thr Phe Leu Asn Val Ile Arg Val Cys Asp Gly Ala Ile

        995                 1000                1005

Arg Glu Phe Leu Phe Gln Gln Leu Gly Met Leu Val Ser Phe Val

    1010                1015                1020

Lys Ser His Ile Arg Pro Tyr Met Asp Glu Ile Val Thr Leu Met

    1025                1030                1035

Arg Glu Phe Trp Val Met Asn Thr Ser Ile Gln Ser Thr Ile Ile

    1040                1045                1050

Leu Leu Ile Glu Gln Ile Val Val Ala Leu Gly Gly Glu Phe Lys

    1055                1060                1065

Leu Tyr Leu Pro Gln Leu Ile Pro His Met Leu Arg Val Phe Met

    1070                1075                1080

His Asp Asn Ser Pro Gly Arg Ile Val Ser Ile Lys Leu Leu Ala

    1085                1090                1095

Ala Ile Gln Leu Phe Gly Ala Asn Leu Asp Asp Tyr Leu His Leu

    1100                1105                1110

Leu Leu Pro Pro Ile Val Lys Leu Phe Asp Ala Pro Glu Ala Pro

    1115                1120                1125

Leu Pro Ser Arg Lys Ala Ala Leu Glu Thr Val Asp Arg Leu Thr

    1130                1135                1140

Glu Ser Leu Asp Phe Thr Asp Tyr Ala Ser Arg Ile Ile His Pro

    1145                1150                1155

Ile Val Arg Thr Leu Asp Gln Ser Pro Glu Leu Arg Ser Thr Ala

    1160                1165                1170

Met Asp Thr Leu Ser Ser Leu Val Phe Gln Leu Gly Lys Lys Tyr

    1175                1180                1185

Gln Ile Phe Ile Pro Met Val Asn Lys Val Leu Val Arg His Arg

    1190                1195                1200

Ile Asn His Gln Arg Tyr Asp Val Leu Ile Cys Arg Ile Val Lys

    1205                1210                1215

Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Glu Glu Glu Asp Pro Leu Ile Tyr Gln

    1220                1225                1230

His Arg Met Leu Arg Ser Gly Gln Gly Asp Ala Leu Ala Ser Gly

    1235                1240                1245

Pro Val Glu Thr Gly Pro Met Lys Lys Leu His Val Ser Thr Ile

    1250                1255                1260

Asn Leu Gln Lys Ala Trp Gly Ala Ala Arg Arg Val Ser Lys Asp

    1265                1270                1275

Asp Trp Leu Glu Trp Leu Arg Arg Leu Ser Leu Glu Leu Leu Lys

    1280                1285                1290

Asp Ser Ser Ser Pro Ser Leu Arg Ser Cys Trp Ala Leu Ala Gln

    1295                1300                1305

Ala Tyr Asn Pro Met Ala Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ala Phe Val

    1310                1315                1320

Ser Cys Trp Ser Glu Leu Asn Glu Asp Gln Gln Asp Glu Leu Ile

    1325                1330                1335

Arg Ser Ile Glu Leu Ala Leu Thr Ser Gln Asp Ile Ala Glu Val

    1340                1345                1350

Thr Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ala Glu Phe Met Glu His Ser Asp

    1355                1360                1365

Lys Gly Pro Leu Pro Leu Arg Asp Asp Asn Gly Ile Val Leu Leu

    1370                1375                1380

Gly Glu Arg Ala Ala Lys Cys Arg Ala Tyr Ala Lys Ala Leu His

    1385                1390                1395

Tyr Lys Glu Leu Glu Phe Gln Lys Gly Pro Thr Pro Ala Ile Leu

    1400                1405                1410

Glu Ser Leu Ile Ser Ile Asn Asn Lys Leu Gln Gln Pro Glu Ala

    1415                1420                1425

Ala Ala Gly Val Leu Glu Tyr Ala Met Lys His Phe Gly Glu Leu

    1430                1435                1440

Glu Ile Gln Ala Thr Trp Tyr Glu Lys Leu His Glu Trp Glu Asp

    1445                1450                1455

Ala Leu Val Ala Tyr Asp Lys Lys Met Asp Thr Asn Lys Asp Asp

    1460                1465                1470

Pro Glu Leu Met Leu Gly Arg Met Arg Cys Leu Glu Ala Leu Gly

    1475                1480                1485

Glu Trp Gly Gln Leu His Gln Gln Cys Cys Glu Lys Trp Thr Leu

    1490                1495                1500

Val Asn Asp Glu Thr Gln Ala Lys Met Ala Arg Met Ala Ala Ala

    1505                1510                1515

Ala Ala Trp Gly Leu Gly Gln Trp Asp Ser Met Glu Glu Tyr Thr

    1520                1525                1530

Cys Met Ile Pro Arg Asp Thr His Asp Gly Ala Phe Tyr Arg Ala

    1535                1540                1545

Val Leu Ala Leu His Gln Asp Leu Phe Ser Leu Ala Gln Gln Cys

    1550                1555                1560

Ile Asp Lys Ala Arg Asp Leu Leu Asp Ala Glu Leu Thr Ala Met

    1565                1570                1575

Ala Gly Glu Ser Tyr Ser Arg Ala Tyr Gly Ala Met Val Ser Cys

    1580                1585                1590

His Met Leu Ser Glu Leu Glu Glu Val Ile Gln Tyr Lys Leu Val

    1595                1600                1605

Pro Glu Arg Arg Glu Ile Ile Arg Gln Ile Trp Trp Glu Arg Leu

    1610                1615                1620

Gln Gly Cys Gln Arg Ile Val Glu Asp Trp Gln Lys Ile Leu Met

    1625                1630                1635

Val Arg Ser Leu Val Val Ser Pro His Glu Asp Met Arg Thr Trp

    1640                1645                1650

Leu Lys Tyr Ala Ser Leu Cys Gly Lys Ser Gly Arg Leu Ala Leu

    1655                1660                1665

Ala His Lys Thr Leu Val Leu Leu Leu Gly Val Asp Pro Ser Arg

    1670                1675                1680

Gln Leu Asp His Pro Leu Pro Thr Val His Pro Gln Val Thr Tyr

    1685                1690                1695

Ala Tyr Met Lys Asn Met Trp Lys Ser Ala Arg Lys Ile Asp Ala

    1700                1705                1710

Phe Gln His Met Gln His Phe Val Gln Thr Met Gln Gln Gln Ala

    1715                1720                1725

Gln His Ala Ile Ala Thr Glu Asp Gln Gln His Lys Gln Glu Leu

    1730                1735                1740

His Lys Leu Met Ala Arg Cys Phe Leu Lys Leu Gly Glu Trp Gln

    1745                1750                1755

Leu Asn Leu Gln Gly Ile Asn Glu Ser Thr Ile Pro Lys Val Leu

    1760                1765                1770

Gln Tyr Tyr Ser Ala Ala Thr Glu His Asp Arg Ser Trp Tyr Lys

    1775                1780                1785

Ala Trp His Ala Trp Ala Val Met Asn Phe Glu Ala Val Leu His

    1790                1795                1800

Tyr Lys His Gln Asn Gln Ala Arg Asp Glu Lys Lys Lys Leu Arg

    1805                1810                1815

His Ala Ser Gly Ala Asn Ile Thr Asn Ala Thr Thr Ala Ala Thr

    1820                1825                1830

Thr Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ser Thr Glu Gly Ser Asn

    1835                1840                1845

Ser Glu Ser Glu Ala Glu Ser Thr Glu Asn Ser Pro Thr Pro Ser

    1850                1855                1860

Pro Leu Gln Lys Lys Val Thr Glu Asp Leu Ser Lys Thr Leu Leu

    1865                1870                1875

Met Tyr Thr Val Pro Ala Val Gln Gly Phe Phe Arg Ser Ile Ser

    1880                1885                1890

Leu Ser Arg Gly Asn Asn Leu Gln Asp Thr Leu Arg Val Leu Thr

    1895                1900                1905

Leu Trp Phe Asp Tyr Gly His Trp Pro Asp Val Asn Glu Ala Leu

    1910                1915                1920

Val Glu Gly Val Lys Ala Ile Gln Ile Asp Thr Trp Leu Gln Val

    1925                1930                1935

Ile Pro Gln Leu Ile Ala Arg Ile Asp Thr Pro Arg Pro Leu Val

    1940                1945                1950

Gly Arg Leu Ile His Gln Leu Leu Thr Asp Ile Gly Arg Tyr His

    1955                1960                1965

Pro Gln Ala Leu Ile Tyr Pro Leu Thr Val Ala Ser Lys Ser Thr

    1970                1975                1980

Thr Thr Ala Arg His Asn Ala Ala Asn Lys Ile Leu Lys Asn Met

    1985                1990                1995

Cys Glu His Ser Asn Thr Leu Val Gln Gln Ala Met Met Val Ser

    2000                2005                2010

Glu Glu Leu Ile Arg Val Ala Ile Leu Trp His Glu Met Trp His

    2015                2020                2025

Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn

    2030                2035                2040

Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met

    2045                2050                2055

Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala

    2060                2065                2070

Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr

    2075                2080                2085

Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu

    2090                2095                2100

Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Gln Leu Pro Gln Leu

    2105                2110                2115

Thr Ser Leu Glu Leu Gln Tyr Val Ser Pro Lys Leu Leu Met Cys

    2120                2125                2130

Arg Asp Leu Glu Leu Ala Val Pro Gly Thr Tyr Asp Pro Asn Gln

    2135                2140                2145

Pro Ile Ile Arg Ile Gln Ser Ile Ala Pro Ser Leu Gln Val Ile

    2150                2155                2160

Thr Ser Lys Gln Arg Pro Arg Lys Leu Thr Leu Met Gly Ser Asn

    2165                2170                2175

Gly His Glu Phe Val Phe Leu Leu Lys Gly His Glu Asp Leu Arg

    2180                2185                2190

Gln Asp Glu Arg Val Met Gln Leu Phe Gly Leu Val Asn Thr Leu

    2195                2200                2205

Leu Ala Asn Asp Pro Thr Ser Leu Arg Lys Asn Leu Ser Ile Gln

    2210                2215                2220

Arg Tyr Ala Val Ile Pro Leu Ser Thr Asn Ser Gly Leu Ile Gly

    2225                2230                2235

Trp Val Pro His Cys Asp Thr Leu His Ala Leu Ile Arg Asp Tyr

    2240                2245                2250

Arg Glu Lys Lys Lys Ile Leu Leu Asn Ile Glu His Arg Ile Met

    2255                2260                2265

Leu Arg Met Ala Pro Asp Tyr Asp His Leu Thr Leu Met Gln Lys

    2270                2275                2280

Val Glu Val Phe Glu His Ala Val Asn Asn Thr Ala Gly Asp Asp

    2285                2290                2295

Leu Ala Lys Leu Leu Trp Leu Lys Ser Pro Ser Ser Glu Val Trp

    2300                2305                2310

Phe Asp Arg Arg Thr Asn Tyr Thr Arg Ser Leu Ala Val Met Ser

    2315                2320                2325

Met Val Gly Tyr Ile Leu Gly Leu Gly Asp Arg His Pro Ser Asn

    2330                2335                2340

Leu Met Leu Asp Arg Leu Ser Gly Lys Ile Leu His Ile Asp Phe

    2345                2350                2355

Gly Asp Cys Phe Glu Val Ala Met Thr Arg Glu Lys Phe Pro Glu

    2360                2365                2370

Lys Ile Pro Phe Arg Leu Thr Arg Met Leu Thr Asn Ala Met Glu

    2375                2380                2385

Val Thr Gly Leu Asp Gly Asn Tyr Arg Ile Thr Cys His Thr Val

    2390                2395                2400

Met Glu Val Leu Arg Glu His Lys Asp Ser Val Met Ala Val Leu

    2405                2410                2415

Glu Ala Phe Val Tyr Asp Pro Leu Leu Asn Trp Arg Leu Met Asp

    2420                2425                2430

Thr Asn Thr Lys Gly Asn Lys Arg Ser Arg Thr Arg Thr Asp Ser

    2435                2440                2445

Tyr Ser Ala Gly Gln Ser Val Glu Ile Leu Asp Gly Val Glu Leu

    2450                2455                2460

Gly Glu Pro Ala His Lys Lys Thr Gly Thr Thr Val Pro Glu Ser

    2465                2470                2475

Ile His Ser Phe Ile Gly Asp Gly Leu Val Lys Pro Glu Ala Leu

    2480                2485                2490

Asn Lys Lys Ala Ile Gln Ile Ile Asn Arg Val Arg Asp Lys Leu

    2495                2500                2505

Thr Gly Arg Asp Phe Ser His Asp Asp Thr Leu Asp Val Pro Thr

    2510                2515                2520

Gln Val Glu Leu Leu Ile Lys Gln Ala Thr Ser His Glu Asn Leu

    2525                2530                2535

Cys Gln Cys Tyr Ile Gly Trp Cys Pro Phe Trp

    2540                2545

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>N-末端引物N1

<400>5

atgcttggaa ccggacctgc cg      22

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>FATN结构域引物C3

<400>6

tttggacaga tcctcagtga cct     23

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>终端N1引物

<400>7

atgcttggaa ccggacctgc cg      22

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>C1引物

<400>8

ttaccagaaa gggcacca           18

<210>9

<211>97

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>来自对人MCF7、Hek293和HEP2G细胞系的PCR的扩增片段

<400>9

atgcttggaa ccggacctgc cgccgccacc accgctgcca ccacatctag caatgtgagc    60

gtcctgcaga agaaggtcac tgaggatctg tccaaaa                             97

<210>10

<211>32

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>对人MCF7、Hek293和HEP2G细胞系的PCR扩增片段的翻译序列

<400>10

Met Leu Gly Thr Gly Pro Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ser

1               5                   10                  15

Ser Asn Val Ser Val Leu Gln Lys Lys Val Thr Glu Asp Leu Ser Lys

            20                  25                  30