用于诱导抗结核分枝杆菌免疫反应的重组BCG肺结核疫苗

具体实施方式

本发明提供一种新型的用于Mtb疫苗制备的rBCG。该rBCG被遗传工程化以超表达1)一种或多种Mtb抗原，这些抗原可包括所谓“传统的”Mtb抗原，如Rv1886c-Ag85B(“85B”)和Rv3804c-Ag85A(“85A”)，以及其他的；以及2)至少一个Mtb复苏/再活化抗原。此外，在本发明的rBCG中，DosR调节子，或DosR调节子的一部分是上游调节的。DosR调节子，由48个基因组成，在Mtb中一般因为感染后处于O₂应激(缺氧)而被激活。

被选定包含在本发明的rBCG中的Mtb抗原一般是那些已知的，或预知在接触抗原后，可在个体中诱导保护性免疫反应的。可以使用多种标准来选择适当的抗原，这些标准包括但不限于：观察个体对抗原的免疫反应，以确定能否控制Mtb感染，通过免疫信息学分析(如利用如可以在丹麦科技大学(Technical University of Denmark)的网址：cbs.dtu.dk/services/NetCTL上找到的程序，该程序通过识别蛋白体切割位点、内质网ER运输效率、1型主要组织相容性MHC亲和力等进行分析)；基于深度文献检索的实验证据的分析；根据多种参数如巨噬细胞幸存率/存活期的分类或分级结果；由二元系统MprAB控制的表达的上游调节；对缺氧的响应；与休眠状态的相关性；在肺组织的表达；与启动子共调节Rv2031(Acr)的基因；分泌的蛋白质(可更易进入免疫系统)；重复的存在(许多毒性相关蛋白具有氨基酸重复区)；作为B细胞免疫原的能力；细胞壁相关或细胞壁发生源(膜暴露/相关蛋白被认为更易于进入免疫系统)；疫苗效力持续数据；对Mtb的唯一性等判定抗原是否含有一种或多种T细胞抗原决定簇。因此，抗原可以根据证明其效力的试验数据而被选定，或作为替换(或补充)，这种抗原可以根据其预知的能力而被选定。本领域的技术人员熟知如何进行这样的分析，且随着分类或分组系统的发展，可以量化确定候选抗原比较得分。例如，每一个待考虑的属性都可以有一个量化分数，具仍最高累积值的抗原可以被选定应用。此外，其他考虑在决策程序也可起一定的作用，部分考虑实际上是很有实际意义(如抗原的可得性、抗原表达的解除、对抗原计量免疫反应的解除等)。

起始抗原库可以是任何或所有已知的Mtb开放阅读框ORF产物。本领域的技术人员熟知用于识别Mtb ORF产物的资源，如由巴斯德研究所(Pasteur Institute)创办的“Tuberculist”网站。在本发明的一个实施例中，抗原可以由包括但不限于如GenBank登陆号AL123456(NC000962)所标示的M.tuberculosis H37Rv的所有ORF产物中选定。

在本发明的优选实施例中，rBCG表达的抗原从但不限于表1所列的189个抗原的起始组中选定。

表1.选定的189个抗原清单

(a).NCBI注释基于登陆号AL123456(NC_000962)；更新的注释基于生物信息学分析、源自MTB相关服务数据和实验证据。

在本发明的更优选实施例中，通过rBCG表达的抗原是列在表2和3中的45个抗原。

表2.顶级排序的抗原(根据分类/阶段)

(a).NCBI注释基于登陆号AL123456(NC_000962)；更新的注释基于生物信息学分析、源自MTB相关服务数据和实验证据。

表中的45个顶级排序的抗原根据以下类别被分类：

^*DosR调节子基因(Voskuil et al.，2003，J.Exp Med 198(5)：705-713；Voskuil et al.2004，Tuberculosis 84，218-227)

^*复苏基因

^*再激活基因(主要依据为Talaat et al.，2007，Proc.Natl.Acad.Sci.189(21)：7877-7886)

^*传统基因

^*其他(主要与维持期与应激响应相关)

上述的出现在超过一个类一些抗原列于表3。

表3.根据质量和数量分值排序的顶级排序抗原

(a).NCBI注释基于登陆号AL123456(NC_000962)；更新的注释基于生物信息学分析、源自MTB相关服务数据和实验证据。

列表中的45个顶级排序抗原首先根据质量分排序，然后根据本发明以及如例1中所论述数量分排序。这一方法得到如下3组：

组Ⅰ：质量分为9-8的抗原，且质量分为8的抗原中，其数量分的下限是12。

组Ⅱ：质量分为8-7的抗原，7的数量分下限为9。

组Ⅲ：质量分为7-6的抗原，6的数量分下限为9。

具有超过5个跨膜片断的抗原不列入本列表中。

一般来说，至少一个这种抗原将超表达，且数个不同的抗原可超表达。例如，大约1-20或更多的这种抗原，或作为替换，大约19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2，或仅1个这样的抗原将通过rBCG超表达。进一步，在rBCG中，可以编码和超表达一个或多个抗原的多个拷贝。选定抗原的氨基酸序列，及编码抗原的核酸序列，显示在图5A-B至25A-B中。

此外，该rBCG包含由一个或多个编码并超表达至少一个Mtb复苏/再活化抗原的基因构成的核酸序列。本领域的技术人员会认识到，“复苏”和“再活化”抗原的精确限定在各个领域内会有所不同，且在一些情况下，限定可能重叠。就本发明的发明目的，区别复苏和再活化抗原是不必要的，因为所有的抗原通过Mtb从潜伏期脱离的重要性得以识别。在最精确意义中，根据是否具有Micrococcus luteus复苏促进因子的重要序列或同功异形体来定义，复苏抗原(即复苏促进因子)是再活化抗原的子集(G Mukamolova et al，Archives of Microbiology，Volume 172，1999)。就本申请的目的，“再活化”抗原是由M.tuberculosis表达的，可在具有活跃性肺结核而非潜伏Mtb感染的人类中诱导免疫反应的蛋白质。它们也可以标识为由Wayne的潜伏性结核模型的非复制静止期的Mtb在脱离过程中表达的免疫原。这可能包括在Mtb从休眠潜伏期进入活跃结节核细菌过程中表达的分子。适当的再活化/复苏抗原的例子包括Rv0867c、Rv0288、Rv1009、Rv0685、Rv0824c、Rv2744c、Rv3347c、Rv1130、Rv1169c、Rv1009、Rv1884c、Rv2389c以及Rv2450c。在优选方案中，表达的再活化/复苏抗原是Rv0867c、Rv1884c和Rv2389c。

此外，在本发明的rBCG中，DosR(休眠存活调节子)调节子基因，或其部分，是上游调节和表达的。整个调节子，或其适当部分，可能是上游调节的。例如，通过具为潜伏TB个体识别的编码抗原的基因可能是最适合上游调节的。DosR上游调节抗原的例子包括Rv1738、Rv2623、Rv2031c、Rv2032、Rv2626c、Rv2005c、Rv3127、Rv1733c、Rv1996、Rv2628、Rv0079、Rv3130c、Rv3131、Rv1813c、Rv2006、Rv2029c、Rv2627c、Rv2030c、Rv3132c，以及Rv2629。显然，部分抗原重叠存在于潜伏和再活化抗原之间，这也许反应了在休眠生物再进入活跃生长期之前潜伏相关抗原的扩展存在，或其在哺乳动物寄主再活化后，在休眠和活跃复制期二者中都有功能。可能被认为在潜伏和再活化之间重叠的抗原列在表4中。

表4.潜伏和再活化重叠抗原

“上游调节”，意味着调节子的单个基因的表达或其翻译的蛋白质，高于当调节子处于“抑制”态的表达水平。DosR调节子蛋白质正常以相当低的水平表达。在氧匮乏和/或存在氮氧化物存在的情况下，TB复合体的DosS和Dost蛋白自磷酸化，并转移这一磷酸至DosR。DosR然后结合到DosR调节基因的上游独立序列，以此激活其转录并上游调节这组基因及其组成DosR调节子的基因产物。在本发明的操作中，上游调节类似这种氧匮乏引起的DosR基因增强转录的效应。

本领域的技术人员熟悉对生物进行遗传工程改造以上游调节选定的目的基因，或选定的目的调节子。这些改造方法包括但不限于调节子的超表达、改变了组成型激活的调节子或感应子的突变体的引入、与上述调节子功能类似的调节子的引入、可激活感应子或调节子的激酶或反馈回路产物的引入、或类似可引起感应子或调节子激活的环境因素的基因/基因产物的引入。在优选方案中，DosR调节子通过DosRST的“二元”调节系统的响应调节子DosR(Rv3133)的超表达被上游调节。

在另一优选实施例中，疫苗包括Rv1908、Rv3873、Rv2780和Rv1349中一个或多个。这些是在芯片(in silico)和/或通过实验识别的有效免疫抗原。

此外本发明的rBCG可编码根据其他标准选定的抗原，比如在动物模型中显示有保护作用或抗原的表达是通过Mtb而非BCG(J Mattow et al.，Electrophoresis，22：2936-2946，2001，P.R.Jungblut，Molecular Microbiology，33：1103-1117，1999，H.J.Mollenkopf et al，Infection andImmunity，72：6471-6479，2004)。在优选实施例中，本发明的rBCG表达Rv3407，正常情况下Rv3407通过Mtb而非BCG表达，并已在鼠模型中显示有保护对抗肺结核的作用。在此描述的遗传工程化的BCG可以是任何认为合适的BCG株，包括但不限于BCG株BCG₁₃₃₁、巴斯德BCG、东京BCG、哥本哈根BCG、莫罗(Moreau)BCG或莫斯科BCG。

在一优选实施例中，菌株为BCG₁₃₃₁。此外rBCG可进一步遗传工程化以包括其他特性，如：产气荚膜梭菌溶血素(perfringolysin)O(pfo)基因(以便于核内逸出)；以表达各种选择性标记如抗生素抗性或营养缺陷选择标记，其中，一rBCG关键基因(如亮氨酸或赖氨酸合成基因)被敲除，且必须互补(如，通过染色体外元件编码缺失的关键基因)以保证细菌的存活；通过基因的敲除或抑制细胞凋亡的基因产物的功能的抑制等。

一般来说，本发明的rBCG是遗传工程化的，通过将编码抗原的目的基因引入处于高效活跃表达控制序列转录控制的rBCG的染色体中以超表达选定的抗原，抗原可包括在哺乳动物感染中最活跃的。但是，编码目的抗原的基因同样会从处于高效活跃表达控制序列转录控制的染色体外质粒表达。控制序列的表达包括但不限于启动子、核糖体进入位点等。

本发明进一步提供一种用于在和/或接种哺乳动物中诱导免疫反应的组合物。该组合物可被用作对抗Mtb的疫苗。本发明的组合物包括在此所述的遗传工程化的rBCG，以及可接受的药用载体。这种用作疫苗的组合物的制备是本领域技术人员所熟知的。一般的，这种组合物要么被制成液态溶液，要么被制成悬浮液，但是固态，如药片、药丸、粉末等同样是可以预见的。在使用前适用于溶解，或悬浮在液体中的固态形式也是可以制备的。制备方法还可以是乳化。活性成分可以与可接受的且不与活性成分相反应的药用辅料混合。适当的辅料是，如，水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇等或其组合。此外，组合物还可以含有少量的辅剂，如润湿或乳化剂，pH缓冲剂等。此外，组合物可包含其他佐剂。如果要求使用口服形式的组合物，可增加各种增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散剂或粘合剂等。本发明的组合物可包含任何辅料以提供一种适合应用的组合物形式。制剂中rBCG的最终量是可变的。但是，一般的，制剂中的量将为大约1-99％。组合物可进一步包含辅助佐剂，其适当的例子包括但不限于Seppic、QuilA、氢氧化铝(Alhydrogel)等。

疫苗制剂同样包括确定整个制备过程中最大细菌活力和稳定性的研究。这包括培养过程中利用各种普遍使用的分枝杆菌用培养基最大生物活力(活的或死亡的)的确定，到包括甘油、糖、氨基酸以及洗涤剂或盐的添加量。在培养的细胞通过离心或切向过滤收获后，再悬浮于在冷冻或冷冻干燥过程中可以保护细胞稳定剂中。普遍使用的稳定剂包括谷氨酸钠、氨基酸、氨基酸衍生物、甘油、糖或普遍使用的盐。最终制剂将提供足够活性和稳定性的生物，以通过真皮内注射、经皮注射、输液或口服输入，以维持并提供足够的保质期用于配送和使用。

本发明的方法包括将一种包括存在于而言一可接受的药用载体的本发明的rBCG的组合物施用于一目的，通常为人类。本发明的疫苗制剂可以通过许多适当方法中的任何一种施用，这些方法是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于注射、经口、经鼻，通过包含抗原的食品摄取等。但是，在一优选方案中，施用方式为真皮内注射。此外，组合物可以单独施用或与其他药剂或免疫原组合物联合使用，如作为多元疫苗的一部分。进一步的，施用可以是单一事件，或可以以多个时间间隔施用多个加强剂量以加强免疫反应。在一个实施例中，本发明的疫苗制剂被用于初次免疫，接受初次疫苗个体然后使用一种或多种不同的疫苗组合物，如现有的稀释卡介苗“加强”。作为替换，个体可接种另一种疫苗制剂，并使用本发明的疫苗制剂加强一次或多次。在本发明的一些实施例中，加强组合物包括编码一种或多种Mtb抗原的核酸，例如：i)一种或多种抗原，比如Rv1738、Rv2623、Rv2031c、Rv2032、Rv2626c、Rv2005c、Rv3127、Rv1733c、Rv1996、Rv2628、Rv0079、Rv3130c、Rv3131、Rv1813c、Rv2006、Rv2029c、Rv2627c、Rv2030c、Rv2629、Rv2450c、Rv1009、Rv0867c、Rv2389c、Rv1884c、Rv0288、Rv0685、Rv0824c、Rv2744、Rv3347c、Rv1130、Rv1169c、Rv1886、Rv1980c、Rv3804c、Rv3875、Rv1926c、Rv0467、Rv3873、Rv1908c、Rv1174c、Rv2780、Rv2620c、Rv1793、Rv1349和Rv3132；ii)一种或多种抗原，比如Rv1996、Rv2005、Rv2029、Rv2623、Rv2626和Rv2727；iii)一种或多种抗原，比如Rv2626、Rv1738、Rv2623、Rv1733、Rv2032、Rv3131、Rv3127、Rv3130c、Rv3804c和Rv1886c；以及iv)包括dosR抗原、再活化抗原和/或复苏抗原中至少一个的一种或多种抗原，如M.tuberculosis生命周期的每一阶段(潜伏、再活化和复苏)的一个抗原。

本发明疫苗制剂的突出优势是其施用可以是预防性的，即在暴露于细菌发生之前，或怀疑已发生，或在发生之后，即在已知或怀疑暴露之后，或治疗性，如与细菌感染有关的症状发生之后。这是因为与Mtb生命周期或感染和疾病进展，如复苏和再活化相关的抗原都被引入了疫苗。因此，该疫苗不仅可用于防止Mtb感染的初始的形成，还可用于防止潜伏Mtb感染的再活化。

在作用一种疫苗施用于人类之前，本遗传工程化的rBCG菌株根据本领域技术人员所熟知的方法进行测试。例如，在适当的动物模型，如在老鼠、豚鼠等进行毒性、致病性、安全性等测试，部分动物是免疫功能缺陷的。疫苗制剂诱导免疫反应的能力，一般同样在适当的动物模型，如老鼠、豚鼠等进行测试。此外，与接种有关的保护性研究、加强，以及后续的活Mtb测试也可以使用适当的动物模型比如老鼠豚鼠，以及非人类灵长动物中进行。最后，本领域的技术人员熟知如何在人类的知情同意下安排进行临床试验，以测试疫苗制剂的效力。细节方面，请参考，如2006年6月8日公开美国专利申请20060121054(Sun等人)，及其引用的参考。

“诱导免疫反应”意味着施用本发明的疫苗制剂引起特定抗体的合成(使用效价在1到1x10⁶之间，优选的1x10³；更佳在约1x10³到约1x10⁶，最佳大于1x10⁶)和/或细胞性增殖，根据检测，如通过细胞实验，确定其中IFN-γ的产生量，例如，通过引入³H胸腺嘧啶，或其他适当的途径。

在本发明的一个优选实施例中，免疫反应是一种保护性免疫反应，即免疫反应保护接种过的个体在以后免受Mtb的感染。但是，本领域的技术人员会认识到疫苗或免疫刺激制剂不必提供全面防护，以给患者带来好处。例如，制剂可诱导减缓或减轻疾病症状的进展的免疫反应，而不完全治愈。

以下是足以解释本发明操作非限制性例子。

实施例

实施例1.适当抗原的选择和根据这一选择的rBCG的设计

起始的一组Mtb蛋白(189个抗原，见表1)从可能的3989个Mtb ORF选出，依据的选择过程如下：

(1)所有3989个TB ORF产物现有数据的编辑：挖掘文献以进行整体分析(如各种条件下，如缺氧、休眠表达的上/下游调节，与巨噬细胞的相互作用，在肺组织的位置和持续性；铁调节；转录组学和蛋白组学框架；引起毒性降低的突变；潜在的高免疫反应等)。

(2)通过交叉配对积累的数据确定基因的子集：选择那些在起始于上述不同标准的两个独立研究中显示有阳性证据的抗原。

(3)反复修正上述子集，根据独立研究公开的效力程度，确定候选者初始组(表1，189个抗原)。

(4)进行生物信息学研究以：

a)通过区域分析、细胞定位的预测、基因组内容观察、重复蛋白的识别，以及未知/假设Ag推定功能的确定(通过使用BLAST对nr数据库、NCBI、区域/基序(motifs)数据库，以及Mtb相关服务和数据库：TB-sgc-TB Structural Genomics Consortium(网址为www.doe-mbi.ucla.edu/TB/)、Tuberculist-结核分枝杆菌遗传相关数据库(网址为genolist.pasteur.fr/Tuberculist/)、TBDB-一个用于TB药物开发的整合平台(网址为www.doe-mbi.ucla.edu/Services/MTBreg/)以及BioHealthBaseserver(网址为www.biohealthbase.org/GSearch)进行序列类似性搜索)进一步表征初始的189个候选基因。

b)进行免疫信息学分析，以预测人类白细胞抗原(HLA)的结合目标(通过NetCTL)和通过数据库(IEDB)及文献检索试验性证明的T细胞抗原决定簇。使用各种检测，用于推定为强结合子的抗原决定簇的确定，以及用于根据预测(如，阈值、父型的数目/总体覆盖率)得到的大部分有效候选者的选定。

(5)对文献进行深度检索以得到189个抗原(表1)和/或其真系同源基因(orthologs)与致病性和疫苗开发有关的数据。

(6)通过集合所有的文献和数据分析(上述步骤4、5)建立189个候选者(表1)知识库。

在初始组中选定的抗原列于表1中，包括现有的疫苗候选者，以及已知：与Mtb生命周期的多个阶段(休眠、再活化、复苏)有关；组织特异性抗原；受饥饿影响的抗原；以及起始存在于致使Mtb株的基因组序列的抗原。

189候选抗原按以下14个分析得到的可能的重要性进行排序：

1)巨噬细胞幸存/持续；

2)通过MprAB二元系统表达的上游调节；

3)对氧缺乏的响应；

4)与再活化的相关性；

5)与休眠的相关性

6)在肺组织的表达；

7)与Rv2031(Acr)的共调节；

8)蛋白是否是分泌的；

9)作为B细胞免疫原的能力；

10)铁调节基因；

11)细胞壁相关或细胞壁发生；

12)存活疫苗的效力数据；

13)重复区的存在；

14)T细胞响应，通过a)已知的实验证据(如源自文献)以及b)通过丹麦科技大学的免疫信息学程序(cbs.dtu.dk/services/NetCTL)判定抗原是否含有一个或多个T细胞抗原决定簇确定；

189个基因中的每一个，这些特征中每一个存在与否都被评分，得到质量分，质量分被用于对189个基因进行排序和选择最佳的45个的尺度。

45个候选基因然后进一步使用同样的13个标准，通过指定每一个标准的内部权重，根据结果的强度和/或与疫苗开发的相关度进行排序。顶级排序的45个抗原的清单列在表2中，一起的还有其根据感染的分类/阶段(潜伏/休眠、复苏/再活化、传统的以及其他)得到的次级分组；在这些组中，抗原依据其分值排序。表3中列出的45个抗原，主要根据其质量分，次要其数量分优化为3个子组。

根据这一分析，用在rBCG中的抗原的最终组得以确定，通常选择总分最高的抗原。此外，作为最终的选择，抗原根据“型”进行分组，在rBCG中包括至少

一种或多种Mtb抗原，包括所谓的“传统的”Mtb抗原，比如85A、85B和TB10.4；以及至少一个选自Rv0867c、Rv1009、Rv1884c、Rv2389c、Rv2450c、Rv0867c、Rv0288、Rv1009、Rv0685、Rv0824c、Rv1349、Rv2744c、Rv3347c、Rv1130和Rv1169c的Mtb复苏/再活化抗原。

此外，基于其他标准如在动物模型中显示有保护效应、抗原的表达通过Mtb而非BCG或抗原在BCG的表达减少选择抗原(J Mattow et al.，Electrophoresis，22：2936-2946，2001，P.R.Jungblut，Molecular Microbiology，33：1103-1117，1999，H.J.Mollenkopf et al，Infection andImmunity，72：6471-6479)。这种Mtb特异性抗原包括Rv1511、Rv2520c、Rv3407、Rv2802c和Rv3710。

用于在rBCG中表达的抗原的优选组合包括以下：

1)传统抗原Rv1886c、Rv3804c；

2)复苏和再活化抗原Rv0867c、Rv1884c、Rv2389c；以及

3)Mtb特异性抗原Rv3407。

实施例2.构建遗传工程化的重组BCG，以表达至少一个传统的Mtb抗原、至少一个Mtb复苏/再活化且其中的DosR调节子是上游调节的。

材料和方法：基本

在下文描述的rBCG的构建中，限制性核酸内切酶(以下称为REs)(New England BiolabsBeverly，MA)，T4 DNA连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)以及Taq聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据生产商的操作手册进行使用；质粒DNA使用少量(QiagenMiniprepR kit，Santa Clara，CA)或大量(Qiagen MaxiprepR kit，Santa Clara，CA)质粒DNA纯化套装根据生产商的操作手册制备(Qiagen Santa Clara，CA)；无核酸酶分子生物学级Milli-Q水、Tris-HCl(pH7.5)、EDTA pH8.0、1M MgCl2、100％(v/v)乙醇、超纯琼脂糖，以及琼脂糖凝胶电泳缓冲液购自Invitrogen，Carlsbad，CA。RE消化酶、PCR、DNA连接反应和琼脂糖凝胶电泳根据公知的程序进行(Sambrook，et al.，Molecular Cloning：一本实验手册1、2、3；1989)；(Straus，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.Mar；87(5)：1889-93；1990)。验证下文所述每一个重组质粒的DNA序列的核苷酸测序，通过使用Applied Biosystems 373A型自动测序仪进行传统的自动化DNA测序技术完成。

PCR引物购自商业化供应商如Sigma(St.Louis，MO)或使用Applied Biosystems DNA合成仪(373A型)。PCR引物以150-250μM的浓度使用，PCR反应的退火温度由Clonemanager4.1版软件(Scientific and Educational Software Inc.，Durham NC)确定。PCR在BioRad热循环仪(BioRad，Hercules，CA)进行。用于扩增的PCR引物由软件CloneManager4.1版(Scientific and Educational Software Inc.，Durham NC)设计。RE酶切和接着的PCR通过标准程序(Straus et al，supra 1990；以及Sambrook et al.，supra 1989)的琼脂糖凝胶电泳进行分析。阳性克隆定义为显示适当RE图谱和/或PCR图谱。通过这一程序识别的质粒进一步使用如上所述的标准DNA测序程序进行评价。

大肠杆菌菌株，如DH5α和Stable2^R，购自Invitrogen(Carlsbad，CA)，作为重组质粒的初始寄主。通过使用高压电脉冲设备如Gene Pulser(BioRad Laboratories，Hercules，CA)，如(Strausetal，supra 1990)所述，设置为100-200Ω、15-25μF和1.0-2.5kV，制造电穿孔将重组质粒引入大肠杆菌菌株。最佳的电穿孔条件通过确定引起每微克DNA/细菌最大转换率得以确定。

大肠杆菌菌株一般培养在传统的大豆琼脂(Difco，Detroit，MI)或大豆肉汤(Difco，Detroit，MI)中，培养基根据制造商的指南配制。除非另有声明，所有的细菌的培养条件均为37℃，5％(v/v)CO₂、慢搅。需要时，培养基添加有抗生素(Sigma，St.Louis，MO)。菌株一般以-80℃，悬浮在(Difco)含有30％(v/v)甘油(Sigma，St.Louis，MO)，大约109菌落形成单位(在此称为cfu)每毫升的条件保存。

分支杆菌菌株培养在液体培养基，如Middlebrook 7H9或Saulton合成培养基，优选在37℃培养。菌株可以静态或动态培养。此外，BCG的生长率可以通过添加油酸(0.06％v/v；研究诊断商品目录号：01257)和洗涤剂如Tyloxapol(0.05％v/v；研究诊断商品目录号：70400)提高。BCG的纯化培养可以通过将100微升在磷酸盐缓冲液(在此称为PBS)梯度稀释(如每步10倍至10^-8)的BCG培养物的小份平均散布在含有25-30ml固体培养基的3.5英寸培养皿上进行评价，固体培养基可以是Middlebrook 7H10。此外，培养的纯化度可以进一步使用可购得的培养基如巯乙酸培养基(科学实验商品目录号1891)和大豆酪蛋白培养基(BD，商品目录号211768)。

为了将所需的抗原表达片断插入产气荚膜梭菌溶血素的染色体中，表达他处所述的BCG1331衍生物，质量在芯片中进行设计，由DNA2.0(Menlo Park，CA)合成。这一载体(pJFINT)的显著特点包括E.coli的colE1复制起点、通过转录终止剂rrnBT1分离得到的3个多克隆位点、pEX18gm的T2，以及噬菌体L5的attP噬菌体整合区，以及rnhA，噬菌体L5的attP噬菌体整合区和噬菌体L5的整合酶基因(GenBank#Z18946)。L5序列的起始上游，包括有一个由源自Tn10(GenBank#AAM97345)卡那霉素抗性等位基因aphA和sacB基因(GenBank#NP_391325)构成的选择性标记框。标记框侧接有源自Tn1000转座子的γΔ游离酶结合位点同向重复序列。这一质粒在分支杆菌属中不能复制，L5attP序列使得与分支杆菌染色体的attB区的高频重组得以实现，以利于将质粒序列整合入染色体中。标记框然后可以通过在含有10％的蔗糖的固体培养基中引入γΔ游离酶和无标记菌株的选择从整合的染色体中敲除。

在芯片中设计抗原表达框以表达编码Rv0867c、Rv1884c和Rv2389c，通过优化处于Mycobacterium bovis的hsp60启动子的转录控制下的核糖体位点将抗原基因间隔，表达框由DNA2.0(Carlsbad CA)合成。类似的设计和构建第二表达框以编码处于hsp60启动子的转录控制下的Rv1886c、Rv3804c和Rv3407c。最后，设计和构建编码处于hsp60启动子的转录控制下的Rv3133c(DosR)的第三框。这3个抗原表达框连接至pJFINT，这样每一个表达框都由一个转录终止子分隔(图2)。得到的质粒，pRC108，被电融合至E.coliStable2，质粒序列的卡那霉素抗性克隆也被检验。

质粒从100ml E.coli培养基中分离，并电融合至丹麦BCG1331的pfo表达衍生物中。在电融合之后，细胞在含有10％(v/v)OADC并补充有0.05％(v/v)Tyloxapol的7H9培养基中培养过夜，7H9琼脂的表面含有50ug/ml的卡那霉素。因为质粒并不编码分支杆菌复制起点，所有菌落的卡那霉素抗性测试通过质粒整合进BCG基因组的attB位点得到确认。个别菌落被选择用于PCR分析，以及接种至含有10％(v/v)OADC和0.05％(v/v)Tyloxapol的7H9培养基中以进行抗原表达分析。卡那霉素抗性克隆的PCR特征显示在重组BCG的染色体中存在整个质粒序列，具体为AFV-102pRC108。AFV-102pRC108培养物使用7H9清洗，并用于接种至无蛋白的7H9Tyloxapol培养基。AFV-102pRC108培养物的上清通过离心收获，使用兔多克隆抗血清免疫固定至Rpf蛋白的葡萄糖转移酶区。Rv1009，与所有Rpf的葡萄糖转移酶区或兔多克隆抗Rv0867c肽血清交叉反应。这显示了Rv0867c、Rv1884c和Rv2389c的产量提高了，高于这些蛋白的BCG同族体的背景(图3A)。这一上清被类似地使用兔多克隆抗Ag85复合体血清进行免疫印迹分析，观察到Rv1886c和Rv3804c的超表达(图3B)。使用兔多克隆抗Rv3407血清对细胞团进行免疫印迹分析，证实了Rv3407的表达，而其同族体在BCG正常是沉默的(图3C)。同样可以使用DosR特异性兔多克隆抗血清对细胞颗粒进行免疫印迹分析，以证实DosR本身的超表达，使用兔抗Rv1733c血清以证实DosR调节蛋白的上游调节作用(图3D)。

为了完成疫苗的构建，使其适用于人类使用，该整合质粒的标记框然后被敲除。可电融合的AFV-102prc108细胞与质粒pYUB870hyg电穿孔融合(electroporated)，质粒pYUB870hyg编码Tn1000的γΔ游离酶、一个sacB等位基因，以及潮霉素(hygromycin)抗性基因(GenBank#ABD64366)。卡那霉素和潮霉素双抗性转化体在7H10培养基中被筛选，并被接种至含有10％(v/v)OADC和0.05％(v/v)Tyloxapol并无抗生素的7H9液体培养基。生长七天后，液体培养物的稀释物涂布在含有10％蔗糖的7H10上，以选择其内的aphA-sacB标记已经消除且由于稀释以及抗sacB等位基因的选择而已遗失pYUB870hyg质粒的重组体。

蔗糖抗性转化体被选出，用于整合抗原框的PCR分析，并如前被接种至7H9液体培养基用于免疫印迹分析。PCR分析显示抗原表达框仍存在于染色体中，而潮霉素抗性标记和sacB基因已被消除。使用抗Rpf、Ag85复合体、Rv3407和DosR血清对上清和细胞团进行的免疫印迹分析证实从染色体切除标记框没有影响插入抗原框的表达。

菌株AERAS-407通过从AFV-102prc108移除抗生物抗性标记而被构建。

实施例3.免疫原性和通过在老鼠中接种AERAS-407诱导的防护的验证

为了显示由AERAS-407诱导的免疫反应以及验证其抗肺结核的保护效力，对4组10c57/BL老鼠皮下注射接种1)盐，2)BCG、3)BCG-PfoA或4)AERAS-407中的一种。组2、3和4中的老鼠获得5×10⁵cfu的BCG或重组BCG。10周后，从每一组中取5只老鼠解剖用于免疫实验，其余的动物接种100cfu的雾化M.tuberculosis Erdman。

设计肽微阵列芯片以检测体液免疫反应。芯片固定有重复的50个氨基酸肽，这些肽源自Rv1886c、Rv3804c、Rv3407c、Rv0867c、Rv1884c、Rv2389c、Rv3133c的序列和所有BCG编码的DosR调节蛋白，DosR调节蛋白至少由超表达的DosR 2倍诱导(即有氧条件下，DosR调节的基因在BCG中组成表达DosR调节子的转录至少超过野生型母本2倍)。每一组的混合血清使用3个肽芯片在37℃下孵化1小时。芯片然后使用pH7.2的磷酸盐缓冲液PBS清洗，并使用结合了羊抗鼠IgG血清(Abcam，Cambridge，MA)的异硫氰酸荧光素(FIFC)在37℃下孵化1小时。芯片然后再次使用PBS清洗，免疫荧光使用Genepix4000B阵列扫描仪(Molecular Devices，Sunnyvale，Sunnyvale，CA)读取。每一组3个芯片的每一个肽斑的值被平均。与未接种的老鼠或接种BCG或BCG-PfoA的老鼠相比，接种AERAS-407的老鼠对源自Rv1886c、Rv3804c、Rv3407c、Rv0867c、Rv1884c、Rv2389c的肽和DosR调节蛋白显示更强的抗体反应。

为检测由AERAS-407诱导的细胞免疫反应，摘取每一动物体的脾并均化。在多孔平板的R10培养基中，脾细胞浓度被调节至5x10⁵个细胞/孔，并在37℃孵化3天，孔中添加有浓度为1μg/ml的纯化Rv1886c、Rv3804c、Rv3407c、Rv0867c、Rv1884c或Rv2389c。此外，每一老鼠的脾细胞孵化时添加有Rv2623和Rv3130，因为这些蛋白在DosR超表达菌株已知是高度上游调节的，且为常见的有效T细胞免疫原。培育3天后，从脾细胞培养物中收取上清，并通过ELISA确定分析在响应抗原刺激中产生的干扰素-γ。未刺激脾细胞的对照培养或PMA/PHA刺激的脾细胞被涵盖，分别用作阴性和阳性对照。

为量化接种AERAS-407提供的防护，在接种M.tuberculosis10周后，每一组中的5只剩余老鼠被解剖，并从每一动物体无菌收获肺和脾。肺和脾在PBS中被均化，稀释涂布在7H10琼脂上。培育4周后，计算每一动物肺和脾的M.tuberculosis菌斑数，并使用稀释因子矫正。这个值就是存在于每一动物的肺和脾中活结核菌的数量。与接种盐溶液相比，BCG接种一般会引起cfu/肺和脾数接近对数减少。接种AERAS-407引起存在于老鼠的肺和脾的Mtb更大的减少。

实施例4.第二遗传工程化的重组卡介苗的构建，以超表达选定的传统的肺结核抗原和DosR调节子

通过在attb位点整合至染色体，第二次组合的抗原(TB10.4、Ag85B、Ag85A和Rv3407)在rBCGAFV102菌株中同样超表达。这一构建与实施例2描述的构建Aeras407的方法类似。为整合这第二组抗原，如实施例2所描述的pJFINT的构建方法构建整合质粒pAF707(示意性描述在图4中)，其不同之处在于：潮霉素抗性基因用于取代卡那霉素抗性基因，且PBlaf启动子被用于驱动抗原TB10.4、Ag85B、Ag85A和Rv3407以超表达所需抗原。所有其它的常规材料和方法与实施例2描述的类似。得到的菌株标记为Aeras406。最终菌株进一步通过PCR，接着测序分析进行研究，以证实具有所需的基因型。菌株进一步通过SDS-PAGE分析和如实施例2(数据未显示)所述的免疫印迹测试，被证实超表达选定的抗原。

实施例5.非人类灵长类动物接种AERAS-407对肺结核的防护

AERAS-407的保护效力，特别是与防止潜伏性感染和疾病再活化相关的增强的能力，最好在恒河猴中测试，因为老鼠不会引起肉芽肿潜伏点，而人类和其它灵长类动物会。为评价AERAS-407在NHP的保护效力，4组6只重量和性别相当的恒河猴接种1)盐溶液，2)BCG1331，3BCG-Pfo，或4)AERAS-407。组2-4的每一动物分别通过真皮内注射接种5x10⁵cfu的BCG或rBCG。接种15周后，所有动物通过呼吸道吸入接种大约300cfu的M.tuberculosisErdman。每月通过胸X光、体重、饮食、咳嗽、昏睡和对TB特异性蛋白的免疫反应评价所有动物的肺结核临床症状，连续评价6个月。所有在6个月的观察期中死亡的动物进行尸检，组织病理学和器官的Mtb量如实施例3所述进行测量。所有垂死的动物被人道地处死并类似的检测。接种6个月后，所有存活的动物被安乐死并进行尸检，用于确定其组织病理学和肺、肝和脾中的Mtb量。接种AERAS-407引起死亡、组织损伤的减少，在试验性的感染动物的肺中，活Mtb体的数量更低。

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