法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-07-17
授权
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2011-03-30
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/566 申请日:20101021
实质审查的生效
2011-02-16
公开
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技术领域
本发明涉及基于单分子力谱的抗癌药物鉴定方法。
背景技术
癌症一直是人类健康的最大杀手。细胞的过度增殖是癌症发生和发展的原因，而且细胞的过度增殖一般都与配体诱导细胞信号通路尤其是生长因子信号通路的过度激活有关。因此抑制这种细胞信号通路的过度激活，成为治疗癌症的重要途径。生长因子细胞信号通路的激活首先是通过配体与其膜蛋白受体在细胞膜上结合，使受体产生自聚或异聚而被激活。然后通过激活的受体再磷酸化下游通路的蛋白，使其下游蛋白被激活，从而激活整个信号通路。因此，鉴定出能截断激活信号通路的任一环节的化合物就能发展治疗癌症的药物。
目前抗癌药物分子的主要鉴定方法之一是首先通过计算机模拟从化合物库中找出一些能与信号通路相关蛋白结合的候选物，然后对这些候选物分子进行细胞水平的实验，检测其是否能够抑制其配体诱导的下游蛋白的磷酸化水平，通过重复这些生化实验来达到抗癌药物鉴定的目的，再进一步进行动物实验。但是在鉴定过程中普遍存在周期长，操作复杂，花费高的问题，难以实现简便快捷的药物鉴定。因此，有必要发展一种简单快捷的药物鉴定方法。
单分子力谱方法是近年来迅速发展起来的一种检测技术。该方法不仅有极高的灵敏度，而且还能展现出大量分子检测时所掩盖下单个分子力的变化，已日益广泛地应用于细胞水平对生物分子结构和功能的动态变化、分子间相互作用和生化反应的动力学过程的研究。但目前还未见有利用该方法鉴定抗癌药物的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于单分子力谱检测膜蛋白受体-配体相互作用的抗癌药物鉴定方法。
本发明提供的抗癌药物的鉴定方法，包括如下步骤：
1)将靶标膜蛋白受体的配体修饰在原子力显微镜的针尖上，得到修饰后的针尖；
2)将离体的癌症细胞进行孵育，孵育完毕后将步骤1)所得修饰后的针尖和孵育后的所述离体的癌症细胞均置于原子力显微镜的样品池中，测定所述离体的癌症细胞中所述靶标膜蛋白受体与所述靶标膜蛋白受体的配体之间的结合力，得到所述离体的癌症细胞中所述靶标膜蛋白受体与所述靶标膜蛋白受体的配体之间的结合几率A；所述离体的癌症细胞为含有所述靶标膜蛋白受体的癌症细胞；
3)将所述离体的癌症细胞和待鉴定物质进行孵育，孵育完毕后将其与所述步骤1)所得修饰后的针尖均置于原子力显微镜的样品池中，测定孵育后的所述离体的癌症细胞中所述靶标膜蛋白受体与所述靶标膜蛋白受体的配体之间的结合力，得到所述孵育后的所述离体的癌症细胞中所述靶标膜蛋白受体与所述靶标膜蛋白受体的配体之间的结合几率B；所述离体的癌症细胞为含有所述靶标膜蛋白受体的癌症细胞；
4)如果所述结合几率B小于所述结合几率A，则所述待鉴定物质为候选的抗癌药物。
上述方法的步骤1)中，常用的各种氮化硅原子力显微镜针尖均适用于该方法。所述靶标膜蛋白受体的配体优选为TGFβ1，所述离体的癌症细胞优选为Hela细胞。所述修饰步骤是将原子力显微镜针尖与配体通过化学交联的方式进行修饰，具体包括如下步骤：a)将所述原子力显微镜的针尖置于MPTMS的甲苯溶液中反应，反应完毕后得到硅烷化的针尖；b)将所述步骤a)所得硅烷化的针尖置于ω-氮羟基琥珀酰亚胺酯多聚乙二醇α-马来酰亚胺((ω-N-hydroxy-succinimide-ester-poly(ethylene glycol)-α-maleimide，简称NHS-PEG-MAL)的二甲基亚砜溶液中进行反应，反应完毕得到活化后的针尖；c)将所述步骤b)得到的活化后的针尖与所述细胞配体于溶剂中进行反应，得到修饰后的针尖。
上述修饰步骤的步骤a)反应步骤中，温度为18-25℃，优选20℃，时间为1.5-2小时，优选2小时；所述MPTMS的甲苯溶液的体积百分浓度为1％；在所述步骤a)之后，所述步骤b)之前，还对所述硅烷化的针尖进行如下处理：将所述硅烷化的针尖依次用甲苯、丙酮和乙醇洗涤，氮气吹干；
所述步骤b)反应步骤中，温度为18-25℃，优选20℃，时间为2.5-3小时，优选3小时；所述NHS-PEG-MAL的二甲基亚砜溶液的浓度为1mg/ml；在所述步骤b)之后，所述步骤c)之前，还对所述活化后的针尖进行如下处理：将所述活化后的针尖用二甲基亚砜进行洗涤，再氮气吹干；
所述步骤c)中，温度为18-25℃，优选20℃，时间为0.5-1小时，优选0.5小时；所述溶剂选自PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液中的至少一种，其中，PBS缓冲液的pH值为7.2-7.6，优选7.4，摩尔浓度为0.01M，Tris-HCl缓冲液的pH值为7.2-7.6，优选7.4，浓度为0.05M。在所述步骤c)之后所述步骤2)之前，还对所述修饰后的针尖进行如下处理：用缓冲液洗涤所述修饰后的针尖；所述缓冲液选自PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液中的至少一种，优选PBS缓冲液；其中，PBS缓冲液的pH值为7.2-7.6，优选7.4，摩尔浓度为0.01M，Tris-HCl缓冲液的pH值为7.2-7.6，优选7.4，浓度为0.05M。
所述步骤2)和步骤3)孵育所述离体的癌症细胞步骤中，温度均为37℃，时间均为18-30小时，优选均为24小时；所述孵育步骤是在培养基中进行的。各种能够孵育该癌症细胞的培养基均适用，如可为胎牛血清体积百分比为10％的DMEM培养基。
所述步骤3)孵育待鉴定物质步骤中，温度为37℃，时间为0.5-2小时，优选为1小时。
上述步骤2)和3)中，结合力是按照如下方法得到：使原子力显微镜的针尖压到细胞表面，然后再提拉使针尖离开细胞。由结合力得到结合几率的具体方法为：计算有结合力的力曲线的个数占所有力曲线个数的比例，得到结合几率。
所述步骤2)和3)测定步骤中，加载速率为1.0×105pN/s，针尖与基底接触的时间为500ms。在测定步骤中，所用原子力显微镜的针尖，在使用之前，可清洗干净并用氮气吹干。
所述步骤4)中，所述候选的抗癌药物为能够抑制所述离体的癌症细胞与所述配体结合的抗癌药物；所述结合几率A与所述结合几率B之差不小于5％，如可为8.6％。
为了获得更准确的试验结果，上述方法步骤2)和步骤3)可重复若干次，如可重复3-5次。
所述待鉴定物质为式I所示柚皮素或式II所示白藜芦醇。
本发明利用单分子力谱的方法提供了一种基于膜蛋白受体-配体相互作用力的细胞水平鉴定抗癌药物的方法。该方法通过检测药物分子是否可以抑制膜蛋白受体与配体的结合，从而得到有望抑制肿瘤细胞生长的药物候选物。其基本原理(如图1所示)是：首先是将配体通过化学交联的方法修饰到AFM针尖上，然后在待测化合物存在下，通过单分子力谱观察细胞膜上受体与配体结合几率的变化。例如如果是在加入待测化合物后受体与配体的结合几率变小，说明该药物具有抑制配受体结合的作用。因此在待测化合物存在下，通过检测膜蛋白受体与配体的结合几率是否减小，从而实现抑制膜蛋白受体与配体的结合的抗癌药物的鉴定。该方法属于药物鉴定新方法，与其它药物鉴定方法相比，具有操作简便，周期短，节省开支等优势，可以快速鉴定得到抑制配受体结合的抗癌药物。
附图说明
图1为用原子力显微镜检测配受体结合示意图。
图2为对照和柚皮素与白藜芦醇浓度都为50μM时，配受体结合几率的变化。
图3为分别在阳性对照，柚皮素和白藜芦醇，观察小鼠肺脏上的肿瘤结节数。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，所述方法均为常规方法。下述实施例中所用3-巯丙基三乙氧基硅烷(MPTMS)和所用NHS-PEG-MAL均购自sigma公司；所用柚皮素购自陕西惠科植物开发有限公司；孵育步骤所用培养皿均为购自北京科友佳生物技术有限公司的35mm的玻璃底培养皿。
本发明中所述结合几率、加载速率均定义如下：结合几率是有结合力的力曲线占所有测得的力曲线的个数的百分比；加载速率是指单分子力谱测定中针尖在退针时的提升速率，其大小为AFM针尖微悬臂的力弹性常数与断键过程中针尖回退的速率的乘积，单位为pN/s。
下述实施例中所用原子力显微镜均购自安捷伦公司，所用针尖均为氮化硅针尖。该原子力显微镜均包括如下的配件：激光器(Laser)、AFM针尖(Tip)、微悬臂(Cantilever)、样品池(Sample Substrate)、光栅扫描和Z轴定位的压电扫描器(Piezo-scanner)、压电扫描控制器(XYZ Scanner Controller)、显示器(Displayer)、接受光反馈信号的控制器(Feedback Controller)和检测器(Detector)。
利用原子力显微镜测定结合力的原理如下：当针尖与被检测样品之间有微弱的相互作用力时，引起微悬臂弯曲，使从微悬臂反射到检测器上的激光发生偏移，由于光杠杆作用原理，即使小于0.01nm的微悬臂形变也可在光电检测器上产生10nm左右的激光点偏移，由此产生的电压变化对应着微悬臂的形变量，通过一定的函数变化便可得到微悬臂形变量的测量值。反馈系统根据产生的电压信号变化来调整针尖或者样品的Z向位置，控制针尖与样品位置的相对移动，即可进行形貌和力的测量。
实施例1、
1)取清洗干净的AFM针尖转移到含有体积百分浓度为1.0％的MPTMS的甲苯溶液中，于20℃反应2小时后，用甲苯反复清洗除去未反应的硅烷化试剂，再依次用丙酮和乙醇清洗3次，氮气吹干，得到硅烷化后的针尖。将硅烷化后的针尖浸入1mg/mlNHS-PEG-MAL的DMSO溶液中，于20℃反应3小时后，用DMSO清洗3次以除去未反应的NHS-PEG-MAL，氮气吹干后得到活化后的针尖。将活化的针尖于pH值为7.4、浓度为0.01M的PBS缓冲液中与TGFβ1配体(该配体在PBS缓冲液中的浓度为5μM)室温反应0.5h后，用pH值为7.4、浓度为0.01M的PBS缓冲液清洗3次后，得到修饰后的AFM针尖备用。
2)将HeLa细胞传到35mm培养皿37℃中孵育24小时(细胞覆盖度为80％)后，将步骤1)所得修饰后的AFM针尖和孵育后的HeLa细胞均置于原子力显微镜的样品池中，测定HeLa细胞中TβRII受体与TGFβ1配体之间的结合力，同一针尖和癌症细胞重复平行实验3次，得到HeLa细胞中TβRII受体与TGFβ1配体之间的结合几率A1；该测定步骤中，加载速率为1.0×105pN/s，针尖与基底接触的时间为500ms；
3)将步骤2)所用HeLa细胞传到35mm培养皿37℃中孵育24小时(细胞覆盖度为80％)后，再加入柚皮素37℃孵育1h(细胞覆盖度为80％)；孵育完毕后将步骤1)所得修饰后的AFM针尖和孵育后的HeLa细胞均置于原子力显微镜的样品池中，测定HeLa细胞中TβRII受体与TGFβ1配体之间的结合力，同一针尖和癌症细胞重复平行实验3次，得到HeLa细胞中TβRII受体与TGFβ1配体之间的结合几率B1；该测定步骤中，加载速率为1.0×105pN/s，针尖与基底接触的时间为500ms；
同时设置以下阻断对照：将hela细胞传到35mm培养皿37℃中孵育24小时使其细胞覆盖度为80％后，将阻断剂TβRII胞外段浓度为5ug/ml的PBS缓冲液(pH值为7.4、浓度为0.01M)加入该hela细胞中，使该阻断剂TβRII胞外段的终浓度为5ug/ml，再将修饰后的针尖浸入液面以下30min后，开始测定结合力，该测定步骤的测定条件与前述步骤2)和3)完全相同，得到该结合几率为3.5±0.8％。
其中，所用阻断剂TβRII胞外段的制备方法如下：将pET-21b-TβRII胞外段(ECD)(Crescenzo G.D.，Pham P.L.；Durocher Y.，O′Connor-McCourt M.D.Transforming growthfactor-beta(TGF-beta)binding to the extracellular domain of the type TGF II-betareceptor：receptor capture on a biosensor surface using a new coiled-coil capture systemdemonstrates that avidity contributes significantly to high affinity binding.J.Mol.Biol.，2003，328，1173-1183)的转化至菌株E.coli DH-5α。N末端组氨酸标记的TβRII ECD蛋白用1mM IPTG的诱导，用Ni-NTA琼脂胶在蛋白变性条件下纯化(agarose，Qiagen，USA)。再用参考文献Wang Q.，Bai Z.，Li X.，Hou L.，Zhang B.The evidences of human orphan receptor COUP-TF inhibiting telomerase activity throughdecreasing hTERT II transcription.Cancer Lett.，2004，214，81-90中提供的方法使蛋白重新折叠。样品首先用含100mM NaCl和0.5-2.0M尿素的Tris-HCl(20mM，pH8.0)溶液稀释，然后依次在缓冲溶液I(0.5M urea，20mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mM NaCl，25％NP-40，0.2mM PMSF)和缓冲溶液II(20mM Tris-HCl，1mM EDTA，50mM NaCl，0.25％NP-40，0.2mM PMSF)中透析24h。
该pET-21b-TβRII胞外段可从中国科学院化学研究所获得。
上述检测结果均列于图2中。由图可知，TGFβ1配体与TβRII受体的结合几率A1为25.1±2.8％。在加入50μM柚皮素孵育1h后，TGFβ1配体与TβRII受体的结合几率明显减小，结合几率B1降低到16.5±1.6％，该结合几率A1与结合几率B1的差值为8.6％，大于5％，说明柚皮素可以抑制TGFβ1配体与TβRII受体的结合。
按照与上完全相同的步骤，仅将步骤3)中待鉴定药物替换为白藜芦醇，所得结合几率A2与B2没有显著变化，结合几率A2为25.1±2.8％，结合几率B2为24.6％±2.7％，该差值为0.5％，小于5％，说明白藜芦醇不能抑制TGFβ1配体与TβRII受体的结合。
生化实验验证：
为了验证单分子力谱鉴定方法的有效性，按照如下步骤进行动物实验：
如图3所示，将4T1细胞接种于Balb/c小鼠第四脂肪垫下，15万/只。接种3天分组，每组十只，阳性对照组灌胃溶液(0.2％CMC-Na水溶液)，给药组分别灌胃给药柚皮素、白藜芦醇各100mg/kg，共给药21天，处死动物，观察肺脏上转移的肿瘤结节数。
将阳性对照组溶液直接让小鼠喝下去。
所得结果如图3所示。由图可知，经过柚皮素处理后肺脏上肿瘤的结节数明显地减少而白藜芦醇却不能。这与本发明提供的鉴定方法所得实验结果几乎相同。因此本发明提供的利用单分子力谱检测膜蛋白受体-配体相互作用的方法可用来鉴定抗癌药物。
机译： 确定基于蒽环类抗癌药物治疗有效性的方法和诊断支持方法以基于蒽环类抗癌药物治疗的有效性
机译： 基因表达谱，鉴定wnt途径模块化剂的方法，制备基因表达谱，筛选与骨负荷相关的重塑剂以及与调节骨重塑和/或骨矿化的蛋白质结合的试剂，治疗骨矿化疾病或病症，调节细胞中的骨矿化和患者中的骨矿化和/或骨重塑，并确定化合物或组合物是否增强负荷作用。骨细胞活性/功能和/或矿化的活性，用于治疗低骨量状况和成分的候选药物
机译： 基于氮杂苯咪唑的化合物，其合成和药物成分的方法，基于氮杂苯并咪唑的化合物调节丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的方法，用于鉴定蛋白质/蛋白质成分的方法，用于鉴定蛋白质/蛋白质的方法/方法含基于氮杂氮杂咪唑的化合物的蛋白激酶相关异常情况
