一种苦参药材及其制剂中苦参碱和氧化苦参碱同时定量新方法

技术领域

本发明涉及一种苦参药材及其制剂中苦参碱和氧化苦参碱同时定量新方法。

背景技术

苦参为豆科植物Sophora flavescens Ait.的干燥根。是一种常用中药，具清热燥湿，杀虫，利尿之功效。用于热痢，便血，黄疸尿闭，赤白带下，阴肿阴痒，湿疹，湿疮，皮肤瘙痒，疥癣麻风等症。制剂系指复方鹿仙草片，为彝族用药，其处方由鹿仙草1250g、九香虫(炒)500g、黄药子325g、苦参125g、天花粉250g、土茯苓250g组成，制备方法是：处方中的六味药材，鹿仙草、黄药子、天花粉、土茯苓粉碎成粗粉，加水煎煮三次，每次1.5小时，合并煎液，静置12小时，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.20(55℃)的清膏，喷雾干燥；苦参粉碎成粗粉，加60％乙醇回流提取三次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.10(55℃)的清膏，喷雾干燥；九香虫加60％乙醇回流提取三次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为0.95～1.00(55℃)的清膏，备用。取上述两种喷雾干燥粉，加入适量淀粉、微晶纤维素，混匀，再加入九香虫清膏，制粒，干燥，压制成1000片，包薄膜衣，即得。该药的功能主治：舒肝解郁，活血解毒。用于肝郁气滞，毒瘀互阻所致的原发性肝癌。

苦参的主含苦参碱和氧化苦参碱，为喹诺里西啶类生物碱，具抗炎、抗肿瘤、镇痛、抗心率失常，镇咳，杀菌等广泛的生物活性。目前苦参药材及其组成的成方制剂，其含量测定都是控制苦参碱和氧化苦参碱总量，因为二者存在着互变异构现象。对苦参碱和氧化苦参碱的含量测定，有薄层扫描法，毛细管电泳法，高效液相法等多种方法，最常用的多是高效液相法。其特点：第一，不论药材还是制剂，前处理方法都比较繁琐、复杂，需用三氯甲烷等毒害溶剂纯化处理，费时长，成本高、效率低、污染环境，危害健康，并直接影响测定结果的准确性。第二，反相色谱中所用的流动相都是缓冲盐中添加十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠等，流动相中溶质增多，比重增大，压力增高，稍不注意就会损伤仪器和色谱柱。第三，如采用正相色谱，必须是特定的氨基柱，其流动相中的有机相要达90％以上，测定成本升高。将目前有关苦参碱和氧化苦参碱的质量控制方法归纳、分析如下：

方法1取苦参药材粉末约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液0.5ml，精密加入三氯甲烷20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，加在中性氧化铝柱(100～200目，5g，内径1cm)上，依次用三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇(7∶3)混合溶液各20ml洗脱，合并收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加无水乙醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，即得。色谱柱：氨基柱；流动相：乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液(80∶10∶10)；测定成分：苦参碱和氧化苦参碱(该方法为中国药典2010年版一部苦参药材测定)。

方法1 分析：本测定方法的样品前处理需花费三氯甲烷等毒性溶剂70ml、时间约2.5～4小时，并且要特定的氨基柱，有机相的比例为90％，其中磷酸的浓度达0.3％。曾测定过0.1％的磷酸溶液的pH值为2.3左右，依次类推0.3％的pH值应在2.0以下，酸度太高，易损坏色谱柱。90％的有机相中较昂贵的乙腈比例占80％，可以说其测定成本最高。在内径1cm的色谱柱上，填加5g氧化铝，其高度约4～5cm，氧化铝粒度又是100～200目，范围太宽，各自比例又无规定，会因100目和200目的比例不同，影响色谱柱的被洗脱的效果，进而影响测定结果的准确性和重现性。

方法2 取复方鹿仙草胶囊内容物，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液0.1ml及三氯甲烷25ml，回流提取30分钟，冷却，倾出提取液，加少量三氯甲烷洗涤容器两次，合并，滤过，滤液在60℃水浴蒸干，残渣加pH1.0硫酸水溶液25ml，分次溶解，一并转移至分液漏斗中，加浓氨水调节pH至9.0～10.0，加入乙醚25ml，萃取三次，乙醚液弃去，所得水液水浴挥至无乙醚味，转移至25ml量瓶中，加pH1.0硫酸水溶液至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。色谱柱：alltima C18(5μm，4.6mm×250mm)；流动相：乙腈-0.02mol/L硫酸铵-十二烷基硫酸钠(36∶64∶0.62)(用20％硫酸溶液调节pH值至3.0)；测定成分：氧化苦参碱(朱良辉等“HPLC法测定复方鹿仙草胶囊中氧化苦参碱的含量”江西中医学院学报2006年18卷6期)。

方法2分析：本测定方法的样品前处理也比较麻烦，需花费有机溶剂115ml，时间约3～4小时，虽然无色谱柱除杂，三氯甲烷提取液的水浴蒸干，但硫酸水溶液的溶解转移以及浓氨水调节pH至9.0～10.0后，乙醚液的三次萃取除杂，步骤繁琐，易造成结果的重现性欠佳。最为关键的是：将溶液调碱性后，生物碱游离，易溶于亲脂性溶剂，再用乙醚除杂，或多或少都会损失掉一些待测成分，给测定结果带来偏差，影响测定数值的准确性。本方法的流动相为缓冲盐体系，柱压高，如若后处理不到位，易损伤色谱柱和仪器。本流动相只能测定氧化苦参碱。

方法3 取复方鹿仙草片，研细，取约0.8g，精密称定，加水30ml使溶解，用浓氨试液调节pH至9～10，用三氯甲烷振摇提取3次(30ml、20ml、20ml)，合并三氯甲烷液，通过中性氧化铝柱(100～200目，7g)上，流速每秒1～2滴，收集三氯甲烷液，再用三氯甲烷-甲醇(7∶3)混合溶液20ml洗脱，合并洗脱液与三氯甲烷液，置60℃水浴上蒸干，残渣加流动相使溶解，定量转移至10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-含0.17％庚烷磺酸钠及0.08％冰醋酸的水溶液-四氢呋喃(23∶77∶0.5)；测定成分：氧化苦参碱(复方鹿仙草片的国家标准YBZ06102009)。

方法3 分析：本测定方法为复方鹿仙草片国家标准，仅样品前处理需花费三氯甲烷毒性溶剂90ml，时间7～8小时，经试验得知，药粉加水后，并不能溶解而成为混悬液，经用浓氨调节pH至碱性后，黏度增加，再用三氯甲烷萃取时，乳化严重，长时间很难分层，影响了结果的准确性。70ml的萃取液与20ml洗脱液，流经100～200目的氧化铝柱7g之上，花费时间约2小时，再在60℃水浴上蒸干，又要花费2小时，程序越长，成分损失越多，方法的准确性和重现性越差。与方法2相同流动相为缓冲盐体系，只能测定氧化苦参碱。

方法4 取复方鹿仙草颗粒，研细，取约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液0.5ml，精密加入三氯甲烷20ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，通过中性氧化铝柱(100～200目，5g，内径1cm)上，依次用三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇(7∶3)混合溶液各25ml洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加无水乙醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，即得。色谱柱：氨基柱(5μm，4.6mm×250mm)；流动相：乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液(80∶10∶10)；测定成分：苦参碱和氧化苦参碱(耿家玲等“复方鹿仙草颗粒含量测定方法研究”云南中医中药杂志2009年30卷7期)。

方法4分析：与方法1完全相同，方法的弊端也完全一样，在此不再赘述。

综上所述，目前有关苦参药材及其制剂的定量测定方法可归纳为：样品的前处理繁琐、费时、提取溶剂均为毒性较大的三氯甲烷，污染环境，危害健康，影响测定结果的准确性。流动相系统，不是易损伤仪器和色谱柱的缓冲盐体系，就是需特定色谱柱、测定成本高的有机相体系。而且缓冲盐体系只测定氧化苦参碱。还未查阅到简便、快捷、低污染、色谱柱耐用性广的苦参药材及其制剂中苦参碱和氧化苦参碱同时定量的反相色谱法。

发明内容

通过研究，样品以含水甲醇提取，吸取一定量，氧化铝柱除杂，含水甲醇洗脱，滤过，续滤液进样的程序，取代了原方法的氨试液碱化，氯仿提取、中性氧化铝柱除杂，氯仿与氯仿-甲醇(7∶3)洗脱，洗脱液蒸干，定容，滤过，滤液进样的程序。并首次以普通的反相色谱柱，非缓冲盐体系，乙腈-甲醇-乙醇-0.1％磷酸(2.5～3∶2.5～3.5∶0.3～0.8∶92.7～94.7)为流动相，进行了苦参药材及其制剂中苦参碱和氧化苦参碱的同时定量测定，生物碱波峰分离良好，色谱柱耐用性广。

通过方法学考察，苦参碱进样量在0.0435～1.0875μg，与峰面积呈良好的线性关系(见图1)，回归方程为：Y＝1652490X+3517，γ＝0.99997；氧化苦参碱进样量在0.0515～1.946μg，与峰面积呈良好的线性关系(见图2)，回归方程为：Y＝1445790X-1324，γ＝0.999999。采用加样回收实验，结果表明：苦参碱的平均回收率为101.20％(n＝9)，RSD为1.99％(见表1)；氧化苦参碱的平均回收率为100.00％(n＝9)，RSD为1.29％(见表2)。精密度(见表3)、稳定性(见表4)、重复性(见表5)、专属性(见图3.4.5)与柱耐用性(见表6、图7.8.9.)实验均符合方法学要求。适用苦参药材及其制剂中苦参碱和氧化苦参碱同时定量测定。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：

1.色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-甲醇-乙醇-0.1％磷酸(2.5～3∶2.5～3.5∶0.3～0.8∶92.7～94.7)；柱温：30～50℃；检测波长：210nm；流速：1.0ml/min；理论板数：按氧化苦参碱峰计算应不低于2000。

2.对照品溶液制备  分别精密称取经五氧化二磷减压干燥24小时的苦参碱和氧化苦参碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含苦参碱20～25μg、氧化苦参碱25～30μg的溶液，即得。

3.供试品溶液制备  取苦参药材细粉约0.1～0.3g，精密称定；或苦参制剂约0.7～0.9g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)15分钟(苦参药材30分钟)，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1～3ml，置中性氧化铝柱(φ1cm，100-120目中性氧化铝1.5～2.5g)上，用80％甲醇洗脱至10ml的量瓶中至约8～9ml，加1滴磷酸，用80％的甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。即得。

4.测定方法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10～15μl，注入液相色谱仪，测定苦参碱和氧化苦参碱的含量。

本发明的原理如下：

苦参碱和氧化苦参碱在自然界多以各种盐的形式存在，即阳离子体状态存在，可溶于甲醇与含适量水的甲醇中。加碱碱化后，变为分子体状态，溶解性能发生变化，易溶于三氯甲烷、苯等有机溶剂。所以直接以含水甲醇提取药材或制剂中呈阳离子体状态的二者，再吸取一定量，通过氧化铝柱进行纯化，即可得到近似无色的供试品溶液。简便、快捷、避开了毒性大的有机溶剂提取、洗脱与蒸干等污染环境的操作步骤。再依据苦参碱和氧化苦参碱的进样量在一定范围内，与其峰面积呈现良好的线性关系，而用于定量测定。

本发明的创新点及有益效果如下：

(1)利用苦参碱和氧化苦参碱在离子体状态下，可溶于甲醇与含适量水的甲醇中的特性，以含水甲醇提取，吸取一定量，氧化铝柱除杂，含水甲醇洗脱，滤过，取滤液进样的程序，取代了原方法的氨试液碱化，三氯甲烷提取、中性氧化铝柱除杂，三氯甲烷与三氯甲烷-甲醇(7∶3)洗脱，洗脱液蒸干，定容，滤过，滤液进样的程序。大大简化了样品前处理程序，做到无浓缩、蒸干、萃取等步骤，简便、快捷、省时、省能源、有效提高了工作效率与方法的重现性和准确性，排除了三氯甲烷对操作人员的健康毒害以及严重的环境污染。

(2)首次以普通的反相色谱柱，非缓冲盐的流动相体系，乙腈-甲醇-乙醇-0.1％磷酸(2.5～3∶2.5～3.5∶0.3～0.8∶92.7～94.7)为流动相，进行苦参药材及其制剂中苦参碱和氧化苦参碱的同时定量测定，生物碱波峰分离良好。与缓冲盐流动相体系相比，有效降低了仪器的损害程度，延长了色谱柱寿命，解决了在缓冲盐流动相体系，苦参碱和氧化苦参碱难以同时定量的难题；与特定的氨基柱系列相比，使流动相中的有机相由90％降到了5.3～7.3％，大大降低了检测成本。

(3)本测定方法完成一批药材或复方鹿仙草片的定量测定，按平行2份样品计算，只需药材0.2～0.6g(或制剂1.4～1.8g)，前处理时间1.5小时，溶剂70ml。与原国家标准YBZ06102009相比，节约有机溶剂130ml、时间6小时，简便、快捷，操作步骤的减少，有效提高了方法的重现性和准确性，降低成本、排除污染。

(4)色谱柱的耐用性试验结果说明，在多种色谱柱上，本方法都获得良好的分离效果及相同的含量数据(见表6及图4.图7-B.图8-B.图9-B)，有效拓宽了苦参碱和氧化苦参碱的检测途径，结束了只有特定的氨基柱才能同时测定该二种生物碱的历史，具广泛的应用前景。

(5)本发明方法的问世，不但解决了苦参药材及其制剂中苦参碱和氧化苦参碱的同时快速测定难题，还为含苦参碱和氧化苦参碱的其他中药材，如山豆根及其复方制剂提供了定量测定新途径，具表帅与示范作用。

附图说明

图1苦参碱的线性关系图

图2氧化苦参碱的线性关系图

图3为苦参碱和氧化苦参碱对照品HPLC色谱图

图4为复方鹿仙草片的HPLC色谱图

图5为复方鹿仙草空白样品的HPLC色谱图

图6为苦参药材的HPLC色谱图

图7耐用性试验-日本岛津VP-ODS色谱柱(5μm，4.6×250mm)

图8耐用性试验-迪马dimonsil色谱柱(5μm，4.6×150mm)

图9耐用性试验-Grace Smart色谱柱(5μm，4.6×250mm)

图1、图2中，纵坐标为峰面积；横坐标为进样量(μg)

图3～图9中，1为苦参碱色谱峰，2为氧化苦参碱色谱峰。

图7～图9中，A为对照品图  B为样品图