多孔聚合物微球和功能复合聚合物微球及其制备方法和应用

具体实施方式

本发明所涉及的多孔聚合物微球的制备方法建立在分散聚合方法之上。分散聚合反应的体系一般由水、醇、分散剂、引发剂及单体组成。分散剂(Dispersant)在一些文献中也被称为稳定剂(Stabilizer)。分散聚合为沉淀聚合的一个特例，主要差别在于起始体系中有分散剂的存在。分散聚合体系在开始时为均相体系，聚合过程首先由引发剂引发单体聚合，当聚合物链超过临界长度后，便从溶剂中沉析出形成核，接着多个核互相聚集形成稳定成长的微球(growing particle)，直至单体消耗完全，反应结束。由于分散剂在微球生长过程中吸附于微球的表面，保证了微球的稳定生长，因此分散聚合被广泛用于单分散微球的制备。与经典分散聚合的重要区别是，本发明是采用含有亲水基团的自由基引发剂，在引发疏水性聚合物单体聚合的同时，由引发剂上的亲水基团在聚合物微球内部形成多孔结构。

本发明中，含有亲水基团的自由基引发剂是含有亲水基团的偶氮类自由基引发剂或其盐。其中，亲水基团可以是羧基、胺基、咪唑啉基团和脒基中的一种。上述自由基引发剂的使用前提是可溶于水、醇或醇水混合介质中，包括但不限于2，2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(简称AIBA或V-50)，2，2′-偶氮[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(简称VA-044)，4，4′-偶氮双(4-氰基戊酸)(简称ACVA或V-501)，偶氮二异丙基咪唑啉(简称AIP或VA-061)，2，2-偶氮双(2-脒唑啉丙烷)盐酸盐(简称V44)。上述引发剂既可以单独使用也可以组合使用。

对本发明中使用的疏水性单体没有特别的限制，只要其能够进行可自由基聚合即可。在可自由基聚合的疏水性单体中，优选含烯键的疏水性单体。含烯键的疏水性聚合物单体包括苯乙烯类单体，如：苯乙烯、甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、卞基氯苯乙烯、卞基溴苯乙烯等，(甲基)丙烯酸酯类单体，如：甲基丙烯酸缩水甘油酯，甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸羟乙酯，甲基丙烯酸羟丙酯，丙烯酸十二酯，以及乙烯基酯类单体：如醋酸乙烯酯等，以及上述单体的组合。

对聚合过程中所采用的分散剂没有特别的限制，只要其可以吸附在微球表面而使微球稳定即可。所选择的分散剂优选两亲性聚合物或水溶性聚合物。两亲性聚合物或水溶性聚合物包括但不限于聚N-乙烯基吡咯烷酮、羟丙基纤维素、聚丙烯酸钠、聚乙烯醇、聚乙二醇和聚乙烯基甲基醚等。分散剂的作用获得尺寸均匀的聚合物微球。

聚合过程中所采用的醇是对疏水性单体具有一定的溶解度同时与水有很好互溶性的醇，这样的醇优选为C1-C6醇，即甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇和己醇中的一种或他们的组合，最优选乙醇。醇的作用是增加可自由基聚合的疏水性单体在水/醇体系中的溶解性，最终形成均相体系。在水醇体系中，醇的用量依据自由基单体的性质，质量分数为65％～97％。

本发明所提供的多孔聚合物微球其尺寸在100nm～10μm之间，在优化制备条件下，可获得粒度分布小于10％，甚至接近5％的单分散多孔聚合物微球。

聚合物微球的孔径尺寸可由引发剂与单体的比例进行调节，孔径在2nm～50nm之间。

本发明所述的多孔聚合物微球，其具体制备过程包括以下步骤：

(1)将单体、醇、分散剂、引发剂和水混合形成反应液；其中引发剂占单体的重量比为1％～15％，醇占总醇水溶剂的质量分数为65％～97％，分散剂选自聚N-乙烯基吡咯烷酮、羟丙基纤维素、聚丙烯酸钠、聚乙烯醇、聚乙二醇和聚乙烯基甲基醚，分散剂占单体的重量比为5％～25％；

(2)加热反应液，引发聚合反应；其中反应温度为50℃～80℃，反应时间为0.5～20小时；

(3)终止反应，分离获得微球；微球可以通过离心，或加入盐，或沉淀剂进行沉淀分离。

以多孔聚苯乙烯类聚合物微球的制备为例，其制备过程如下：

(1)将聚苯乙烯类单体、醇、分散剂、引发剂和水混合形成反应液；其中引发剂占单体的重量比优选5％～8％，分散剂优选聚N-乙烯基吡咯烷酮，分散剂占单体的重量比优选8％～15％，醇占总醇水溶剂的质量分数优选85％～95％，醇优选乙醇；

(2)加热反应液，引发聚合反应；其中反应温度优选65℃～75℃，反应时间优选4～20小时；

(3)终止反应，分离得到多孔聚合物微球。

本发明还提供一种功能复合微球的制备方法，即：通过小分子和(或)无机纳米颗粒材料在多孔聚合物微球的孔道内的负载，获得功能聚合物复合微球。上述小分子及无机纳米颗粒在微球孔道内的负载即可在微球制备过程中实现，也可在微球形成后实现。

小分子选自具亲水性或水溶性的荧光染料。

无机纳米颗粒选自水溶性的荧光量子点、磁性纳米颗粒及贵金属纳米颗粒。

上述小分子及无机纳米材料既可分别被负载于多孔微球的孔道内部，形成具有被负载物质性质的功能微球，又可以同时被负载于同一微球的孔道内部形成兼具不同负载物质性质的功能化聚合物微球，如：在多孔微球孔道内部负载磁性氧化铁纳米颗粒，可获得磁性复合微球；在多孔微球孔道内同时负载具有不同荧光性质的量子点，可得到荧光性质依赖于不同种类量子点间比例的荧光微球；在多孔微球孔道内部同时负载磁性氧化铁纳米颗粒和荧光染料或荧光量子点可得到兼具磁性-荧光的复合聚合物微球。

与已有商用产品相比，本发明提供的功能聚合物复合微球，其重要的特征是微球表面更为光滑，同时被负载物质可均匀地分布于微球基底中，形成均匀的复合结构。另外一个重要的特征是，所获得的功能复合微球在水中可形成稳定的分散体系，依据所得微球的尺寸，一般功能微球的胶体溶液可静置10小时-3天无沉淀析出。上述特征和性质有利于提高功能微球在生物分离、分析与检测中的应用效果。

本发明提供的磁性聚合物复合微球，在表面经过生物修饰后，可用于生物磁分离。

本发明提供的荧光聚合物复合微球，在经表面修饰后，可以被用作荧光探针用于生物分析与检测。

本发明提供的兼具磁性和荧光性质的功能聚合物复合微球(磁性-荧光功能聚合物复合微球)，在经表面生物修饰后，可用于高通量生物分析与检测。以免疫夹心法为例，其原理见图1，具体的检测方法与步骤如下：

(1)将可识别不同种类待测目标的抗体分别修饰于具有不同荧光性质的磁性-荧光微球表面；

(2)将步骤(1)获得的兼具荧光和磁性的免疫微球与待测目标在溶液中进行共同孵育；

(3)磁分离上述磁性-荧光微球，并重新分散于水溶液中；

(4)将可识别不同待测物目标的抗体分别修饰于固体基片表面的不同位置上，然后引入步骤(3)获得的微球的分散液，经孵育，清洗，及对固体基片表面包被不同抗体位置荧光的检测，实现高通量生物分析。其中，抗体在固体基片表面的定位可以采用酶标板来实现。

以同一体系中同时含有大肠杆菌和沙门氏菌样本的检测为例，其检测步骤如下：

(1)在荧光中心发射峰位有明显区别的两种磁性-荧光聚合物复合微球表面分别修饰大肠杆菌的抗体和沙门氏菌的抗体；

(2)向同时含有一定量的大肠杆菌和沙门氏菌的待测溶液中加入分别修饰有大肠杆菌抗体和修饰沙门氏菌抗体的磁性-荧光微球，孵育5～60分钟，优选10分钟；

(3)磁分离分别结合有大肠杆菌和沙门氏菌的磁性-荧光微球，磁分离时间为3～90分钟，优选30分钟，然后将磁分离得到的磁性-荧光微球重新分散于磷酸生理缓冲液；

(4)将沙门氏菌抗体和大肠杆菌抗体分别包被于酶标板的两个不同的孔的底部，再引入步骤(3)获得的磁性微球的分散液，孵育5～120分钟，优选30分钟，用磷酸生理缓冲液清洗孔底，然后对孔底荧光进行检测，根据已知标准工作曲线测得待测溶液中不同细菌的数目。

多孔聚合物微球制备的具体实施例

实施例1

将0.09g 2，2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐、0.3g聚N-乙烯基吡咯烷酮和1.8g苯乙烯单体、3mL水、27mL无水乙醇混合放入100mL的三口烧瓶中，在机械搅拌下通入氮气除氧30分钟，转速150转/分钟。然后，在70℃下加热上述反应溶液，反应8小时，然后将反应液冷却至室温，离心分离后再用去离子水洗涤3次，得到聚苯乙烯微球。聚合物微球的透射电镜(TEM)结果见图2，统计结果表明，微球的平均粒径为600nm，相对标准偏差为5％。BET测试结果显示所得到的聚合物微球具有多孔结构，孔径大小在2nm～30nm之间，平均孔径大小约为10nm。

实施例2

将0.09g 2，2′-偶氮[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐、0.3g聚乙烯基吡咯烷酮和1.8g苯乙烯单体、3mL水、27mL无水乙醇混合放入100mL的三口烧瓶中，在机械搅拌下通入氮气除氧30分钟，转速150转/分钟。然后，在75℃下加热上述反应溶液，反应3小时，离心分离得到多孔的聚苯乙烯微球。TEM测试结果表明微球的平均粒径为492nm，相对标准偏差为10％，见图3。BET测试结果表明该聚合物微球具有多孔结构。

实施例3

将0.09g 4，4′-偶氮双(4-氰基戊酸)、0.3g聚乙烯基吡咯烷酮和1.8g苯乙烯单体、3mL水、27mL无水乙醇混合放入100mL的三口烧瓶中，在机械搅拌下通入氮气除氧30分钟，转速150转/分钟。然后，在75℃下加热上述反应溶液，反应5小时，然后将反应液冷却至室温，离心分离得到聚苯乙烯微球。TEM测试结果表明微球的平均粒径为250nm，相对标准偏差为5％，见图4。BET测试结果表明该聚合物微球具有多孔结构。

实施例4

将0.09g 2，2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐、0.3g聚乙烯基吡咯烷酮和1.8g甲基丙烯酸缩水甘油酯单体、3mL水、27mL无水乙醇混合放入100mL的三口烧瓶中，在机械搅拌下通入氮气除氧30分钟，转速150转/分钟。然后，在75℃下加热上述反应溶液，反应12小时，然后将反应液冷却至室温，离心分离聚合物微球。经去离子水洗涤3次，得到多孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球，见图5。微球的平均粒径为2.2μm，粒径相对标准偏差为5％。

实施例5

将0.24g 2，2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐、0.6g聚N-乙烯基吡咯烷酮和3.2g苯乙烯单体、4mL水、36mL无水乙醇混合放入100mL的三口烧瓶中，在机械搅拌下通入氮气除氧30分钟，转速150转/分钟。然后，在80℃下加热上述反应溶液，反应1小时，然后将反应液冷却至室温。加入2M的氯化钠溶液沉淀所制备的微球，经洗涤纯化后，得到的多孔聚苯乙烯微球，微球孔径在3～50nm之间。

实施例6

将0.15g 2，2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐、0.15g聚乙烯醇、1g甲基苯乙烯单体和0.5g甲基丙烯酸缩水甘油酯单体、2mL水、18mL无水乙醇混合放入50mL的三口烧瓶中，在机械搅拌下通入氮气除氧30分钟，转速150转/分钟。然后，在75℃下加热上述反应溶液，反应2小时，然后将反应液冷却至室温，经加盐沉淀，洗涤得到多孔共聚物微球。

实施例7

将0.15g 4，4′-偶氮双(4-氰基戊酸)、0.5g聚N-乙烯基吡咯烷酮和3g甲基丙烯酸甲酯单体、9mL水、27mL无水甲醇混合放入50mL的三口烧瓶中，在机械搅拌下通入氮气除氧30分钟，转速150转/分钟。然后，在70℃下加热上述反应溶液，反应4小时，然后将反应液冷却至室温，经分离，洗涤，得到多孔聚甲基丙烯酸甲酯微球。TEM测试结果表明微球的平均粒径为2.8μm，见图6。

功能化聚合物复合微球实施例

实施例8

取实施例1制备的多孔聚合物微球100mg分散在于50mL去离子水中形成溶液，将5mL浓度为1mg/mL磁性氧化铁纳米粒子(按中国专利申请200610114459.X制备)加入到上述溶液中，常温机械搅拌2小时，转速150转/分钟，通过离心分离得到磁性聚合物微球。制备得到的磁性聚合物微球水溶液在常温下静置12小时无沉淀析出。图7为本实施例制备的磁性多孔聚合物微球的TEM照片，图8为商品化磁性聚合物微球DynabeadsMyOne^TM Streptavidin T1的TEM照片。从图7和图8可以明显看出，本发明实施例8制备的磁性多孔聚合物微球表面更为光滑。

实施例9

将0.09g 2，2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐、0.3g聚N-乙烯基吡咯烷酮和1.8g甲基丙烯酸缩水甘油酯单体、3mL水、27mL无水乙醇混合放入100mL的三口烧瓶中，在机械搅拌下通入氮气除氧30分钟，转速150转/分钟。然后，在75℃下加热上述反应溶液，反应5小时加入2mL浓度为5mg/mL磁性氧化铁纳米粒子，再继续反应4小时然后将反应液冷却至室温，离心分离得到的多孔聚合物微球。经去离子水洗涤3次，得到磁性聚合物微球。在外加磁场下，磁性复合微球可以很快被富集，见图9。

实施例10

取实施例2制备的多孔聚合物微球100mg分散在于50mL去离子水中形成溶液，将5mL浓度为1mg/mL金纳米粒子加入到上述溶液中，60℃下机械搅拌2小时，转速150转/分钟，通过离心分离得到负载有金纳米粒子聚合物微球，见图10。

实施例11

取实施例5制备的多孔聚合物微球300mg分散在于50mL去离子水中形成溶液，将2mL浓度为1×10^-5mol/mL荧光桃红B荧光染料加入到上述溶液中，40℃下机械搅拌3小时，转速100转/分钟，通过离心分离得到荧光聚合物微球。荧光显微镜照片见图11。

实施例12

取实施例1制备的多孔聚合物微球200mg分散在于80mL去离子水中形成溶液，将3mL浓度为4×10^-5mol/mL发射波长为650nm的CdTe水溶液(按文献J.Phys.Chem.B，2003，107，8提供方法制备)加入到上述溶液中，常温机械搅拌2小时，转速200转/分钟，离心分离得到荧光发射峰位在650nm的荧光聚合物微球。

实施例13

(1)按实施例1制备条件，在微球聚合反应开始2小时后加入3mL浓度为3mg/mL磁性氧化铁纳米粒子，经9小时反应得到磁性聚合物微球，经分离、洗涤后重新分散于溶液中，再加入2.5mL浓度为4×10^-5mol/mL发射波长为650nm的CdTe常温机械搅拌2小时，转速150转/分钟，磁分离得到荧光中心发射峰位在650nm的磁性聚合物微球。

(2)按实施例1制备条件，在微球聚合反应开始2小时后加入3mL浓度为3mg/mL磁性氧化铁纳米粒子，经8小时反应得到磁性聚合物微球，经分离、洗涤后重新分散于溶液中，再加入2.5mL浓度为4×10^-5mol/mL发射波长为540nm的CdTe常温机械搅拌2小时，转速150转/分钟，磁分离得到荧光中心发射峰位在540nm的磁性聚合物微球。

磁性-荧光双功能聚合物复合微球在高通量生物检测中的应用实施例

实施例14

(1)取按实施13制备的荧光中心发射峰位在540nm磁性-荧光双功能聚合物微球1mg与大肠杆菌单克隆抗体100μg在1mL磷酸生理缓冲液混合1小时，将混合溶液置于磁场中收集磁性微球，小心的吸走上清液，再加1mL磷酸生理缓冲液后用漩涡混合器使磁性微球重新分散，如此反复清洗3次，得到的磁性微球加入1mL浓度为1％的牛血清白蛋白的磷酸生理缓冲液，孵育1小时，再重复磁分离清洗步骤3次，最后将得到的对大肠杆菌具有免疫识别功能的免疫磁性-荧光微球分散于1mL磷酸生理缓冲液；

同上再取按实施13制备的荧光中心发射峰位在650nm磁性-荧光双功能聚合物微球1mg与沙门氏菌单克隆抗体100μg在1mL磷酸生理缓冲液混合1小时，将混合溶液置于磁场中收集磁性微球，小心的吸走上清液，再加1mL磷酸生理缓冲液后用漩涡混合器使磁性微球重新分散，如此反复清洗3次，得到的磁性微球加入1mL浓度为1％的牛血清白蛋白的磷酸生理缓冲液，孵育1小时，再重复磁分离清洗步骤3次，最后将得到的对沙门氏菌具有免疫识别功能的免疫磁性-荧光微球分散于1mL磷酸生理缓冲液；

(2)向1mL同时含有3×10³cfu大肠杆菌和8×10²cfu沙门氏菌的待测溶液中依次加入步骤(1)得到的表面分别修饰有大肠杆菌单克隆抗体和沙门氏菌单克隆抗体的免疫磁性-荧光微球各100μL，在25℃下孵育10分钟；

(3)孵育完成后，磁分离免疫磁性-荧光微球，小心的吸走上清液，再加1mL磷酸生理缓冲液后用漩涡混合器使磁性微球重新分散，重复磁分离清洗步骤三次，将得到的磁性-荧光双功能聚合物微球分散至1mL的磷酸生理缓冲液中；

(4)向孔底分别修饰有沙门氏菌单克隆抗体和大肠杆菌单克隆抗体的两个酶标板的孔中分别加入100μL步骤(3)得到的微球分散液，25℃下孵育30分钟，然后用磷酸生理缓冲液洗去未结合的磁性-荧光微球，用VERSAMAX连续波长酶标仪测定上述两孔的荧光强度，然后根据标准曲线测定待测溶液中细菌的cfu数目。实测结果如下：大肠杆菌为3.5×10³cfu；沙门氏菌为7.2×10²cfu。