一种多孔聚羟基脂肪酸酯聚合物微球的微流控制备方法及制备得到的多孔聚合物微球及应用

技术领域

本发明属于生物材料领域，涉及一种多孔聚羟基脂肪酸酯(PHA)聚合物微球的微流控制备方法以及制备得到的多孔聚合物微球及其应用。

背景技术

近年来细胞疗法在组织工程及再生领域中受到了广泛关注。目前大部分细胞疗法采用直接注射法，即将细胞悬浮液直接注射到体内，由于缺乏足够的保护，细胞可能在注射过程中死亡，存活的细胞也只有少量留存于注射位点中，不足以起到有效修复组织的作用。利用生物材料为载体运载细胞，可以在注射过程中为细胞提供保护，提高细胞存活率，使大多数细胞可以留存在注射位点中，减少细胞流失，若负载干细胞还可以对其后续分化过程进行调控，从而提高组织再生的效果。

微球是一种优秀的细胞运输载体，由于其体积小，可以直接注射到需要修复的组织位点，且注射造成的创口小，可以减少患者痛苦，因此相较宏观尺寸的支架材料具有明显优势。具有多孔结构的微球载体可以装载细胞，在注射过程中为细胞提供保护，减少后续细胞流失，并且孔隙结构有利于养分及代谢产物的扩散，为细胞增殖及组织再生提供更大的空间。微球可以作为载体运输与需要修复的组织相关的细胞类型，也可以运载能够分泌具有治疗作用的生物因子的细胞，使其在体内持续分泌组织再生所需的信号因子，协助调节干细胞的分化及组织的再生修复。

聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，简称PHA)是一类由微生物合成的羟基脂肪酸组成的线性聚酯，作为细菌在代谢不平衡条件下的碳源和能量贮藏性物质，从而增加其在逆境中的生存能力。到目前已经发现PHA至少有150种不同的单体结构,并且还在不断地发掘出新的单体结构的PHA。这种单体的多元性给PHAs带来其理化性能的多样化，使得PHA具有良好的生物兼容性、生物降解性，且其降解产物无毒无害，作为体内移植支架具有良好的长期安全性。PHA在生物可降解材料应用领域具有明显的优势，在血管组织工程、软骨组织工程和人造神经导管等领域有良好的应用前景，是潜在的制备生物可降解微球的优异材料。

常见的生物聚合物微球的制备方法包括乳化法、喷雾干燥法、以及悬浮聚合法等，这些方法可用于量产，但准备步骤较多，得到的微球尺寸分布不均匀，产品状态难以控制，重复性较差。微流控技术为聚合物微球的生产制备提供了新策略，使用该方法可以对微球制备的过程进行精确控制，得到的微球粒径分布窄，尺寸可调控，重复性高。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多孔PHA聚合物微球的微流控制备方法以及制备得到的多孔聚合物微球及其应用。本发明的制备方法可以克服传统方法制备多孔微球粒径不均匀、性质不可控、且重复性差的问题，能够得到尺寸均一、形貌可控的用作细胞载体支架的多孔微球。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种多孔PHA聚合物微球的微流控制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(A)将PHA聚合物溶解于有机溶剂配置成聚合物有机溶液，将致孔剂溶于水配置成致孔剂水溶液；

(B)将PHA聚合物有机溶液与致孔剂水溶液混合进行超声预乳化，形成油包水预乳化体系，作为分散相；

(C)将水溶性表面活性聚合物溶于水中得到的水溶液作为连续相；

(D)用注射泵进行进样，使两相在T型微流控装置中混合，在T型管中生成聚合物液滴，收集聚合物液滴；

(E)去除所述PHA聚合物液滴中的有机溶剂，固化、冻干，得到所述多孔聚合物微球。

在本发明中，利用微流控技术稳定制备粒径分布均一的PHA聚合物微球，本发明所述的制备方法中，互不相溶的两相液体在微流控装置中混合时，流速较慢的内相在两相界面的剪切作用下“断裂”形成液滴，因此微流控装置的流道结构、两相流速、流体黏度以及表面活性剂的使用都会对液滴的形成及性质产生影响。本发明选择T型结构流道，可使得微球尺寸均一、稳定。此外，通过对两相流速、流体黏度、界面张力的调节，利用微流控技术对微球制备过程进行精确控制，可以实现对微球产品性质的调控。

优选地，步骤(A)所述PHA聚合物为聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸-co-3-羟基己酸)(P3HB3HV3HHx)，聚(3-羟基丁酸-3-羟基己酸)(PHBHHx)，聚(3-羟基丁酸-4-羟基丁酸)(P3HB4HB)，聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸)(PHBV)。

优选地，步骤(A)所述PHA聚合物有机溶液的浓度为0.1-20％(例如0.3％，1.5％，5％，10％，20％)。若聚合物浓度低于0.05％，不能形成均一的油包水预乳化体系，影响微球多孔结构的形成；若聚合物浓度高于20％，分散相黏度过高，连续相剪切力不足，无法使用微流控方法有效形成液滴。

优选地，步骤(A)所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或乙腈中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，步骤(A)所述致孔剂为碳酸氢铵。由于碳酸氢铵水解后生成二氧化碳及氨气，在有机溶剂挥发、PHA聚合物液滴固化形成微球时气体已同时被除去，在微球中留下孔隙结构，因此采用此方案制备多孔微球不需要在后续步骤中进行致孔剂的去除。采用该致孔剂，制备获得的微球内部具有海绵状的孔隙结构，且孔洞之间相互连通。

优选地，步骤(A)所述致孔剂水溶液的浓度为5-20％(例如5％，10％，15％，20％等)。

优选地，步骤(B)所述混合时PHA聚合物有机溶液与致孔剂水溶液的体积比为10:1-2:1。若PHA聚合物有机溶液与致孔剂水溶液的体积比例过大，则导致成孔效率差，制备的微球无法有效形成理想的多孔结构；若体积比例过小，则导致无法形成均一的预乳化体系，后续制备过程中会出现相分离，无法形成形貌均一、具有多孔结构的微球。

优选地，步骤(B)所述超声预乳化为使用超声破碎仪进行预乳化，乳化90s为一个循环，循环次数为1-5次(例如1次、2次、3次、4次或5次)。

优选地，步骤(C)所述水溶性表面活性聚合物为部分水解的聚乙烯醇(PVA)。部分水解的聚乙烯醇是一种乙酸乙烯酯与乙烯醇的共聚物，其中疏水的乙酸乙烯酯基团可以吸附于油相液滴表面，亲水的乙烯醇基团则溶于水相中，通过长链聚合物的空间位阻效应起到对油相液滴的稳定作用。同时，聚乙烯醇无毒，且具有生物可降解性，因此被广泛应用于生物医药领域中。

优选地，步骤(C)所述水溶液的浓度为0.1-0.5％(例如0.1％，0.25％，0.5％等)。

优选地，步骤(D)所述使两相在T型微流控装置中混合的具体方法为：先将所述连续相从T型管一端端口通入装置中，待其充满整个管道后，从垂直端口通入分散相，使两相在T型微流控装置中混合，在T型管中生成聚合物液滴，在另一端端口收集。

优选地，步骤(D)中所述两相在T型微流控装置中混合时分散相与连续相的流速比例为1:3-1:10，例如1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10等，在该流速比例下，可以稳定地制备得到单分散性较好、形貌为均匀球形的PHA聚合物微球，能够保证微球粒径在100～500μm，表面孔径在1～10μm。

优选地，所述分散相的流速为300μl/min，连续相流速为1500μL/min；两相流速比例为1:6时，可以稳定、高效地制备出单分散性高、形貌均匀的多孔微球，平均粒径为253μm。

优选地，步骤(E)所述去除所述聚合物液滴中的有机溶剂的方法采用搅拌挥发有机溶剂的方式。

优选地，步骤(E)所述固化的温度为4-60℃(例如4℃，25℃，35℃，60℃)，时间为2-18h(例如2h，4h，8h，12h，18h)。

优选地，步骤(E)所述冻干的温度为-50～-60℃(例如-50℃、-53℃、-55℃、-58℃或-60℃)，所述冻干的时间为8-18h(例如8h、10h、12h、15h或18h)。

另一方面，本发明提供了如上所述的制备方法制备得到的多孔聚合物微球，所述多孔聚合物微球粒径在100～500μm，表面孔径在1～10μm。

本发明利用微流控技术获得了稳定、均一的多孔聚合物微球，且微球尺寸可调，表面及内部具有大量孔隙结构。

另一方面，本发明提供了一种对如上所述的多孔聚合物微球进行表面优化处理的方法，所述方法为：利用氢氧化钠溶液或氢氧化钠-乙腈混合溶液对多孔微球进行表面处理。

在本发明中，利用氢氧化钠-乙腈混合溶液对多孔微球进行表面处理后，微球表面孔洞数量增多、孔径增大，表面积增大，可用于更高效地负载需要递送的药物，当孔径增大到容许细胞通过时，还可进行细胞及干细胞的负载运输，在递送过程中为细胞提供保护，用于组织工程修复应用。

优选地，所述氢氧化钠-乙腈混合溶液为浓度为0.25M的氢氧化钠水溶液，与乙腈按体积比3:7混合得到的混合溶液。

优选地，所述表面处理的时间为2-16min，例如2min、5min、8min、10min、13min或16min，优选地，所述处理时间为8-16min。

另一方面，本发明提供一种多孔支架材料，所述多孔支架材料包括如上所述的多孔PHA聚合物微球。

另一方面，本发明提供一种负载细胞的多孔支架，所述多孔支架包括如上所述的多孔聚合物微球，以及负载在所述多孔聚合物微球上的细胞。

本发明提供的多孔支架材料，用于细胞的负载运输，其中多孔聚合物微球用于细胞负载时，具体方案为将细胞与上述微流控方法制备获得的多孔微球共培养，形成细胞-微球复合物，可将其注射于需要修复的组织，实现局部组织修复。在本发明的一种实施方案中，所述细胞为小鼠的骨髓间充质干细胞。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明的制备方法能够制备得到粒径分布均一、形貌尺寸可控的多孔微球，解决了传统双乳化法制备的微球粒径分布不均匀、重复性差的缺陷。本发明还提供了一种多孔支架材料，多孔聚合物微球作为细胞运输的载体，其可用于装载各种细胞如干细胞，进行局部注射，用于组织的再生修复。

附图说明

图1为本发明中用于制备多孔PHA微球的微流控装置的结构示意图。

图2为实施例1步骤(11)冻干后得到的PHA微球的表面SEM图(聚合物溶液浓度为1.5％)，其中A图标尺为500μm，B图标尺为200μm。

图3为实施例1步骤(11)冻干后得到的PHA微球的截面SEM图(聚合物溶液浓度为1.5％)，其中A图标尺为100μm，B图标尺为200μm。

图4为实施例1中经过表面优化处理的多孔微球表面SEM图(聚合物溶液浓度为1.5％)，其中A图标尺为100μm，B图标尺为300μm。

图5为实施例1中将多孔微球与小鼠的骨髓间充质干细胞共培养10天内的细胞存活率。

图6为实施例1中将多孔微球与小鼠的骨髓间充质干细胞共培养第7天的细胞微球激光共聚焦图。

图7为使用搅拌预乳化方法制备的多孔P3HB3HV3HHx微球的表面SEM图片(聚合物溶液浓度为1.5％)，其中A图标尺为300μm，B图标尺为400μm。

图8为经1M氢氧化钠试剂处理30min后的多孔P3HB3HV3HHx微球的横截面SEM图片(聚合物溶液浓度为1.5％)，其中A图标尺为200μm，B图标尺为100μm。

图9为经1M氢氧化钠试剂处理60min后的多孔P3HB3HV3HHx微球的横截面SEM图片(聚合物溶液浓度为1.5％)，其中A图标尺为100μm，B图标尺为100μm。

图10为经1M氢氧化钠试剂处理90min后的多孔P3HB3HV3HHx微球的横截面SEM图片(聚合物溶液浓度为1.5％)，其中A图标尺为100μm，B图标尺为100μm。

图11为使用超声预乳化方法制备的多孔P3HB3HV3HHx微球的表面SEM图片(聚合物溶液浓度为0.3％)，其中A图标尺为50μm，B图标尺为100μm。

图12为使用超声预乳化方法制备的多孔P3HB4HB微球的表面SEM图片(聚合物溶液浓度为1.5％)，其中A图标尺为100μm，B图标尺为40μm。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

在本实施例中，通过以下方法制备聚羟基脂肪酸酯微球，具体包括以下步骤：

1)聚合物溶液A：将0.3g P3HB3HV3HHx聚合物固体加入20ml二氯甲烷中，搅拌溶解，配置成无色透明的聚合物有机溶液；

2)致孔剂溶液B：将1.5g碳酸氢铵固体加入10ml水中溶解，配置成致孔剂水溶液；

3)分散相C：取7.5ml配置好的聚合物溶液A，加入2.5ml配置好的致孔剂溶液B，利用超声破碎仪在冰浴中预乳化，得到分散相乳化体系；

4)连续相D：取2g聚乙烯醇固体加入400ml水中，搅拌溶解，配置成溶液用作微流控方法制备微球的连续相；

5)收集相E：同连续相D；

6)玻璃注射器F：10ml玻璃注射器(带金属针头)；

7)塑料注射器G：60ml塑料注射器(带头皮针)；

8)将分散相C抽取到玻璃注射器F中，连续相D抽取到塑料注射器G中；

9)T型微流控装置：将塑料注射器G用头皮针接入T型管一端端口，将玻璃注射器F的针头直接接入垂直端口中(两相流动方向如图1中所示)，形成T型微流控装置，用于液滴生成，生成的液滴将有T型管另一端端口流出，进入收集相E；

10)在收集相E中收集在微流控装置中生成的聚合物液滴，同时进行搅拌使二氯甲烷溶剂挥发，聚合物液滴固化，形成固体聚羟基脂肪酸酯微球；

11)将获得的微球用超纯水洗涤3次，放置于-80℃进行预冻，随后于冻干机中在-50～-60℃下冻干18h；

12)氢氧化钠-乙腈试剂H：将0.25M氢氧化钠溶液与乙腈按体积比3:7混合；

13)收集冻干后的微球，用氢氧化钠-乙腈试剂H对微球表面进行处理，处理时间为2min、4min、8min、16min；

14)将处理后的微球用超纯水洗涤3次，放置于-80℃进行预冻，随后于冻干机中在-50～-60℃下冻干18h；

收集冻干后的微球，取少量样品用于扫描电镜分析，其余样品与小鼠的骨髓间充质细胞共培养10天，在固定时间点考察细胞的存活、生长情况。

对步骤(11)冻干后得到的P3HB3HV3HHx微球进行表面SEM(冷场发射扫描电子显微镜，Hitachi,S-4800)表征，结果如图2所示，其中A图标尺为500μm，B图标尺为200μm，由图2可以看出，微球尺寸在200-500μm之间，微球表面呈起伏褶皱状，分布有大量孔洞，孔径约为1-10μm。

对步骤(11)冻干后得到的P3HB3HV3HHx微球的截面进行SEM表征，结果如图3所示，其中A图标尺为100μm，B图标尺为200μm，由图3可以看出，微球内部呈海绵状，具有大量孔洞结构，孔径范围分布广，且孔洞之间相互连通，可以为细胞生长、营养及代谢物质的输送提供良好的条件。

对步骤(14)冻干后得到的P3HB3HV3HHx微球进行表面SEM表征，结果如图4所示，其中A图标尺为100μm，B图标尺为300μm，由图4可以看出，冻干后微球表面孔洞的孔径略有增大，部分孔径可达20-25μm，有利于细胞进入微球内部生长。

图5为将使用氢氧化钠-乙腈试剂H表面处理8min的多孔微球及不具备多孔结构的实心微球与小鼠的骨髓间充质干细胞共培养10天内的细胞存活率。由该图可以看出，细胞活性在接种的前7天内呈现增长趋势，说明细胞生长状态良好，数量增多，第10天时细胞活性较第7天有所下降，可能是贴附于微球表面的细胞由于密度增大导致的接触抑制作用，且内层细胞较难获得充足的营养物质，部分凋亡脱落。

图6为将使用氢氧化钠-乙腈试剂H表面处理8min的多孔微球及不具备多孔结构的实心微球与小鼠的骨髓间充质干细胞共培养第7天的细胞微球激光共聚焦图。由该图可以看出，共培养至第7天时，有大量细胞贴附于微球表面生长，且有部分细胞从微球表面的孔洞进入内部生长，说明本实施例的多孔微球的内部孔洞结构可以提供细胞穿梭进入及后续生长的空间，拥有应用于细胞装载递送的潜力。

实施例2

在本实施例中，通过以下方法制备聚羟基脂肪酸酯微球，具体包括以下步骤：

1)聚合物溶液A：将0.3g P3HB3HV3HHx固体加入20ml二氯甲烷中，搅拌溶解，配置成无色透明的聚合物有机溶液；

2)致孔剂溶液B：将1.5g碳酸氢铵固体加入10ml水中溶解，配置成致孔剂水溶液；

3)分散相C：取7.5ml配置好的聚合物溶液A，加入2.5ml配置好的致孔剂溶液B，利用顶置式均质器搅拌预乳化，转速为20000rpm，时间2min，得到分散相乳化体系；

4)连续相D：取2g聚乙烯醇固体加入400ml水中，搅拌溶解，配置成溶液用作微流控方法制备微球的连续相；

5)收集相E：同连续相D；

6)玻璃注射器F：10ml玻璃注射器(带金属针头)；

7)塑料注射器G：60ml塑料注射器(带头皮针)；

8)将分散相C抽取到玻璃注射器F中，连续相D抽取到塑料注射器G中；

9)T型微流控装置：将塑料注射器G用头皮针接入T型管一端端口，将玻璃注射器F的针头直接接入垂直端口中(两相流动方向如图1中所示)，形成T型微流控装置，用于液滴生成，生成的液滴将有T型管另一端端口流出，进入收集相E；

10)将收集相E加热至35℃，收集在微流控装置中生成的聚合物液滴，同时进行搅拌使二氯甲烷溶剂挥发，聚合物液滴固化，形成固体聚羟基脂肪酸酯微球；

11)将获得的微球用超纯水洗涤3次，放置于-80℃进行预冻，随后于冻干机中在-50～-60℃下冻干18h；

对步骤(11)冻干后得到的P3HB3HV3HHx进行表面SEM表征，结果如图7所示，其中A图标尺为300μm，B图标尺为400μm，由图7可以看出，采用搅拌预乳化方法制备得到的微球粒径在500μm左右，表面孔洞较少，孔径在5-30μm，最大可达80μm左右，但不具备内部连通的网络状结构。

实施例3

在本实施例中，通过以下方法制备聚羟基脂肪酸酯微球，具体包括以下步骤：

1)聚合物溶液A：将0.3g P3HB3HV3HHx固体加入20ml二氯甲烷中，搅拌溶解，配置成无色透明的聚合物有机溶液；

2)致孔剂溶液B：将1.5g碳酸氢铵固体加入10ml水中溶解，配置成致孔剂水溶液；

3)分散相C：取7.5ml配置好的聚合物溶液A，加入2.5ml配置好的致孔剂溶液B，利用超声破碎仪在冰浴中预乳化，得到分散相乳化体系；

4)连续相D：取2g聚乙烯醇固体加入400ml水中，搅拌溶解，配置成溶液用作微流控方法制备微球的连续相；

5)收集相E：同连续相D；

6)玻璃注射器F：10ml玻璃注射器(带金属针头)；

7)塑料注射器G：60ml塑料注射器(带头皮针)；

8)将分散相C抽取到玻璃注射器F中，连续相D抽取到塑料注射器G中；

9)T型微流控装置：将塑料注射器G用头皮针接入T型管一端端口，将玻璃注射器F的针头直接接入垂直端口中(两相流动方向如图1中所示)，形成T型微流控装置，用于液滴生成，生成的液滴将有T型管另一端端口流出，进入收集相E；

10)在收集相E中收集在微流控装置中生成的聚合物液滴，同时进行搅拌使二氯甲烷溶剂挥发，聚合物液滴固化，形成固体聚羟基脂肪酸酯微球；

11)将获得的微球用超纯水洗涤3次，放置于-80℃进行预冻，随后于冻干机中在-50～-60℃下冻干18h；

12)氢氧化钠溶液H：将氢氧化钠溶于纯净水中配置成浓度为1M的氢氧化钠溶液；

13)收集冻干后的微球，用氢氧化钠溶液H对微球表面进行处理，处理时间为30min、60min、90min；

14)将处理后的微球用超纯水洗涤3次，放置于-80℃进行预冻，随后于冻干机中在-50～-60℃下冻干18h；

对步骤(14)冻干后得到的P3HB3HV3HHx微球进行表面SEM表征，结果如图8、图9、图10所示。

图8为1M的氢氧化钠溶液处理30min的多孔微球，其中A图标尺为200μm，B图标尺为100μm。由图A可以看出处理30min后的微球粒径在200-300μm，表面有大量孔洞，孔径大小在1-10μm左右，相比处理前没有明显变化。由图B可以看出，部分处理后的微球表面被溶解，出现不规则形状。

图9为1M的氢氧化钠溶液处理60min的多孔微球，其中A图、B图标尺均为100μm。由图中可以看出处理60min后的微球粒径在200-300μm，表面进一步出现不规则形状和海绵状形貌，有大量孔洞分布，孔径大部分在1-10μm，部分孔径可达15-20μm左右。

图10为1M的氢氧化钠溶液处理90min的多孔微球，其中A图、B图标尺均为100μm。由图中可以看出处理90min后的微球粒径在200-300μm，表面进一步溶解，出现絮状形貌，表面孔径在1-10μm，部分孔径可达15-20μm左右，部分微球无法维持规则的球状结构。

实施例4

在本实施例中，通过以下方法制备聚羟基脂肪酸酯微球，具体包括以下步骤：

1)聚合物溶液A：将0.06g P3HB3HV3HHx固体加入20ml二氯甲烷中，搅拌溶解，配置成无色透明的聚合物有机溶液；

2)致孔剂溶液B：将1.5g碳酸氢铵固体加入10ml水中溶解，配置成致孔剂水溶液；

3)分散相C：取7.5ml配置好的聚合物溶液A，加入2.5ml配置好的致孔剂溶液B，利用超声破碎仪在冰浴中预乳化，得到分散相乳化体系；

4)连续相D：取2g聚乙烯醇固体加入400ml水中，搅拌溶解，配置成溶液用作微流控方法制备微球的连续相；

5)收集相E：同连续相D；

6)玻璃注射器F：10ml玻璃注射器(带金属针头)；

7)塑料注射器G：60ml塑料注射器(带头皮针)；

8)将分散相C抽取到玻璃注射器F中，连续相D抽取到塑料注射器G中；

9)T型微流控装置：将塑料注射器G用头皮针接入T型管一端端口，将玻璃注射器F的针头直接接入垂直端口中(两相流动方向如图1中所示)，形成T型微流控装置，用于液滴生成，生成的液滴将有T型管另一端端口流出，进入收集相E；

10)在收集相E中收集在微流控装置中生成的聚合物液滴，同时进行搅拌使二氯甲烷溶剂挥发，聚合物液滴固化，形成固体聚羟基脂肪酸酯微球；

11)将获得的微球用超纯水洗涤3次，放置于-80℃进行预冻，随后于冻干机中在-50～-60℃下冻干18h；

对步骤(11)冻干后得到的P3HB3HV3HHx微球进行表面SEM表征，结果如图2所示，其中A图标尺为50μm，B图标尺为100μm，由图11可以看出，采用0.3％聚合物浓度、超声预乳化方法制备得到的微球粒径在50-150μm左右，具有丰富的、互相连通呈网络状的多孔结构，孔径在1-5μm左右，表面较大的孔洞可达5-10μm，最大可达约10μm左右。

实施例5

在本实施例中，通过以下方法制备聚羟基脂肪酸酯微球，具体包括以下步骤：

1)聚合物溶液A：将0.3g P3HB4HB固体加入20ml二氯甲烷中，搅拌溶解，配置成无色透明的聚合物有机溶液；

4)连续相D：取2g聚乙烯醇固体加入400ml水中，搅拌溶解，配置成溶液用作微流控方法制备微球的连续相；

5)收集相E：同连续相D；

6)玻璃注射器F：10ml玻璃注射器(带金属针头)；

7)塑料注射器G：60ml塑料注射器(带头皮针)；

8)将聚合物溶液A抽取到玻璃注射器F中，连续相D抽取到塑料注射器G中；

9)T型微流控装置：将塑料注射器G用头皮针接入T型管一端端口，将玻璃注射器F的针头直接接入垂直端口中(两相流动方向如图1中所示)，形成T型微流控装置，用于液滴生成，生成的液滴将有T型管另一端端口流出，进入收集相E；

10)在收集相E中收集在微流控装置中生成的聚合物液滴，同时进行搅拌使二氯甲烷溶剂挥发，聚合物液滴固化，形成固体聚羟基脂肪酸酯微球；

11)将获得的微球用超纯水洗涤3次，放置于-80℃进行预冻，随后于冻干机中在-50～-60℃下冻干18h；

对步骤(11)冻干后得到的P3HB4HB微球进行表面SEM表征，结果如图2所示，其中A图标尺为100μm，B图标尺为40μm，由图12可以看出，采用本实施例方法制备得到的P3HB4HB微球粒径为50-100μm，表面分布有一定数量的孔洞，孔径在1-5μm左右。

实施例6

根据实施例1所述的方法，所不同的是，采用0.3g、0.12g、0.06g的Mw为25000的P3HB3HV3HHx聚合物加入20ml二氯甲烷中,通过显微镜及扫描电镜表征发现，降低聚合物浓度，形成的微球粒径从200-500μm减小至50-100μm，说明采用本方法可以有效对微球的尺寸在较大范围内进行调控，以适应不同的应用需求。

对比例1

根据实施例1所述的方法，所不同的是，采用7.5％的吉利丁水溶液作为致孔剂溶液，将收集到的固化的P3HB3HV3HHx微球用纯净水洗涤3次，加入40℃水浴中搅拌2h除去吉利丁，形成多孔微球。通过扫描电镜表征发现，采用吉利丁水溶液作为致孔剂溶液的聚羟基脂肪酸酯微球表面孔隙孔径小、数量少，无法有效形成多孔结构。

对比例2

根据实施例1所述的方法，所不同的是，采用1％的吐温20水溶液作为致孔剂溶液。通过超声预乳化方法发现，吐温20水溶液作为致孔剂溶液无法与聚合物有机溶液形成均一、稳定的预乳化体系。通过扫描电镜表征发现，采用吐温20水溶液作为致孔剂溶液的聚羟基脂肪酸酯微球表面孔隙孔径小、数量少，无法有效形成多孔结构。

对比例3

根据实施例1所述的方法，所不同的是，采用夫西地酸与聚羟基脂肪酸酯固体溶于二氯甲烷中，采用的夫西地酸与聚羟基脂肪酸酯的质量比为2:3、1:1、3:2，制备成总浓度为1.5％的有机溶液作为分散相。制备得到的微球通过扫描电镜表征发现，夫西地酸在聚羟基脂肪酸酯中无法均匀地发生相分离，导致后续无法通过除去聚羟基脂肪酸酯骨架中的夫西地酸获得多孔结构。

对比例4

根据实施例6所述的方法，所不同的是，采用7.5ml配置好的聚合物溶液A，加入2.5ml配置好的致孔剂溶液B，利用超声破碎仪在冰浴中预乳化，发现超声后的体系有明显分层现象，无法形成稳定、均一的预乳化体系，难以获得具有均匀多孔结构的聚羟基脂肪酸酯微球。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的多孔聚合物微球的微流控制备方法以及制备得到的多孔聚合物微球及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。