使用脂肪酶和脂肪酸甘油酯通过溶性鞘脂的酶促N-酰化反应制备鞘脂的方法

技术领域

本发明涉及由溶性鞘脂和羧酸酯酶促合成鞘脂和包含鞘脂的组合物，还涉及包含这些鞘脂或组合物的化妆品、皮肤病学或药物配制物。

背景技术

本发明涉及生物催化制备通式I的鞘脂的方法

所述方法通过使通式II的溶性鞘脂(lysosphingolipid)

与至少一种羧酸酯反应而进行，所述羧酸酯选自通式IIIa-e的化合物

其中R¹、R²和X如下所定义。

鞘脂用作化妆品和/或皮肤病学活性成分。

其中R²＝H的通式I的鞘脂被称为神经酰胺，并且是天然地存在于皮肤(角质层)中的极性脂质。在外部的角质细胞(corneocytes)中，神经酰胺是细胞膜的主要成分(脂质含量的40-65％)，并因此通过例如调节水渗透性而在其保护功能中起核心作用。随着年龄的增加，角质形成细胞失去其很大部分的神经酰胺合成活性，并且皮肤因此而丧失其部分保护作用，并且例如不再完全抑制表皮的水分流失。这可以至少部分地由局部施用神经酰胺而弥补(例如：Farwick，M.等，Int.J.Cosm.Sci.，2007，29(4)，319-329或Klee，S.K.等Basic Clinic.Dermatol.，2007，40，155-165)。

此外，已报道了神经酰胺在治疗特应性皮炎中的积极效果(Kerscher，M.等，Eur.J.Dermatol.，1991，1，39-43；Imokawa，G.等，J.Soc.Cosmet.Chem.1989，40，500-507)。

由于在许多工业化国家特别是德国中的人口发展，预期对神经酰胺的需求进一步增加。

在现有技术中，使用活化的羧酸衍生物，通过其中R²＝H的通式II的溶性鞘脂例如植物鞘氨醇(通式II，其中R²＝H且X＝CH₂-HCOH)的类似肖特-鲍曼(Schotten-Baumann)的N-酰化反应制备神经酰胺。

植物鞘氨醇通常是源自发酵生产的。

活化的羧酸通常为碳酰氯，其以自身的形式使用或原位地由羧酸制备。US6420604(Cosmoferm，NL)描述了通过使鞘氨醇碱与合适的碳酰卤反应而合成某些神经酰胺。此方法的特别的缺点在于一方面需要使用毒性的有机氯化合物，以及最终产物中的高盐负载。此外，对于本领域技术人员显而易见的是预期在使用高反应性碳酰卤的时候必然会形成大量的不期望的副产物。

另外的合成途径通过酸酐进行。因此，例如WO93/20038(Gist-Brocades，NL)教导了由羧酸和烷基苯基磺酰氯碱催化合成混合酸酐，以获得用于植物鞘氨醇的N-酰化反应的反应性羧酸衍生物。

所有这些途径的相同之处在于它们都取决于使用反应性羧酸衍生物。就此而言，缺点是这些物质的高腐蚀性以及它们对健康的危险，使得需要特殊的反应器体系以及预防措施，并因此增加了制备的复杂性。此外，对于产品的局部可施用性而言，必须确保其不含反应性以及毒性的前体和副产物。此外，还必然预期的是高盐负载，以及与之相关的用于产物纯化和废物处置的额外的复杂性。现有技术的方法的另外的缺点是仅获得低的前体和产物浓度；因此，WO93/20038(Gist-Brocades，NL)描述了最大值为15％(w/v)的在毒性溶剂二氯甲烷中的前体溶液，以及同时使用反应性和毒性的辅助试剂对甲苯磺酰氯以及三乙胺。此外，产物的纯度或产率(在各情况下都在80％的范围内)都不令人满意。

另一个缺点是分离的脂肪酸或脂肪酸衍生物的限制。脂肪酸主要地天然地以甘油酯(脂肪和油)的形式存在，由其必然首先获得脂肪酸。特别地，对于极敏感的脂肪酸例如多不饱和脂肪酸，为此需要复杂的方法以获得脂肪酸，同时避免副反应。迄今为止还没有由天然存在的甘油酯例如橄榄油、葵花油、亚麻子油、菜籽油、红花油、豆油、玉米油、花生油、棕榈油、棕榈仁油、椰子脂、蓖麻油、芝麻油、鳄梨油、猪脂肪(pig fat)、牛油、鲱鱼油、山茶油、可可脂、南瓜籽油、杏仁油、芒果脂、月见草油、开心果油(pistachio oil)、山核桃油、米糠油、沙棘油、芥子油、黑种草油、牛油树油脂、核桃油、桐油、葡萄籽油开始制备神经酰胺的方法。

因此，本发明的目的是提供以无害的和工业上可应用的方式获得神经酰胺的可选途径，通过该可选途径可以克服现有技术的至少一个缺点。

也可以通过生物催化而实现酰胺化反应，即使用酶作为催化剂。关于酶的工业应用的综述可以在例如Liese等(Industrial Biotransformations；Second，Completely Revised Edition，Wiley-VCH，Weinheim，2006)中找到。用于合成羧酸衍生物的优选的生物催化剂为水解酶(E.C.3.1.x.x)，特别是脂肪酶(三酰甘油水解酶，E.C.3.1.1.3)和酯酶(E.C.3.1.1.1)。

根据脂肪酶在细胞的代谢中的天然的功能，脂肪酶优选地催化酯类的水解分裂。然而，酯类的缩合形成也已在文献中描述多次。其代表性的实例可以在Drauz和Waldmann(Enzyme Catalysis in Organic Synthesis，A Comprehensive Handbook；Second，Completely Revised and Enlarged Edition，Vol.II，Wiley-VCH，Weinheim，2002)，Aehle(Enzymes in Industry，Production and Applications；Second，Completely Revised Edition，Wiley-VCH，Weinheim，2004)或Bornscheuer(Enzymes in Lipid Modification，Wiley-VCH，Weinheim，2000)中找到。

文献中还有在脂肪酶催化的缩合反应中使用胺类作为亲核试剂的实例。

例如，Y.-M.Xia等，J Mol Catal B，2004，31，111-115描述了通过由获自南极假丝酵母(Candida Antarctica，CALB)的脂肪酶催化的月桂酸甲酯与反应性伯胺的酰胺化而合成N-月桂酰-β-氨基丙腈(aminoproprionitrile)。除了对稀底物溶液(低于50mM)的限制以外，所述方法的缺点在于相对较低的转化率(仅不超过94.3％的转化率)。此外，在所示的反应中完全不需要区域选择性或化学选择性。

然而，在本发明的反应中可能绝对需要所述选择性，这是由于前体分子例如植物鞘氨醇可能具有多个反应性官能团。例如，这种选择性的问题由P.Tufvesson等：Biotechnol.Bioeng.，2007，97(3)，447-453所示：在使用乙醇胺和羧酸的由CALB催化的反应中，避免由酶催化的酯化的简单的选择性酰胺化是不可能的。仅通过多次添加前体和通过蒸馏除去反应水，就可能实现所期望的酰胺的富集。

在酶促酰胺化的另一个实例中，M.Nechab等：JOC，2007，72，6918-6923描述了使用CALB的(R)-构型的仲胺的立体选择性反应。观察到的产物的高光学纯度(99％ee)提示了CALB对于(R)-构型的胺类而言是特别优选的，因此由于例如植物鞘氨醇的S-构型，使得人们怀疑是否植物鞘氨醇在胺碳原子上与该催化剂反应。此外，再次使用极稀的底物溶液(100mM)，同时使用高浓度的生物催化剂(27％，CALB重量/底物重量)，因此大大限制了所述方法在工业上的吸引力。

WO94/26919(Gist-Brocades，NL)描述了使用羧酸酯且使用细菌脂肪酶或哺乳动物脂肪酶的植物鞘氨醇的酶促N-酰化反应。细菌脂肪酶和哺乳动物脂肪酶优选地用于所述方法中；特别是获自产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)的脂肪酶。特别地，该方法的缺点在于需要大量的生物催化剂(30-95％w/w)以实现仅中度的转化(不超过78％)。此外，发现大量的不期望的N，O-二酰化产物(最多到17％)。此外，仅使用底物的稀溶液(59-93mM)，导致低的空时产率。另外的缺点是使用植物鞘氨醇碱作为底物的限制，使得与使用植物鞘氨醇的酸加成产物例如硫酸植物鞘氨醇相比较，底物的成本大大增加。此外，还明确指出获自酵母和真菌的脂肪酶不适于作为催化剂。因此，WO94/26919中描述的方法作为现有的化学方法的经济学上有价值的可选方案而被排除。

因此，持续需要能够克服现有技术的缺点的用于溶性鞘脂的酶促酰胺化的方法。

发明内容

因此，本发明的目的是提供没有现有技术方法的一个或多个缺点的方法。具体而言，本发明的目的是开发可以使用容易获得的前体，而且可以以高浓度使用的方法。

其他未明确地提及的目的将由以下说明书、实施例和权利要求的内容而明显看出。

通过使用多元醇的全酯或偏酯作为用于制备鞘酯的酰基供体，出人意料地完全实现了本发明的目的。

先前从未描述这种形式(例如脂肪和油形式)的酰基供体，且因此也从未描述这种形式的三元醇甘油的酯。

其主要原因是本领域技术人员将预期在使用例如脂肪和油时，在反应过程中甘油单酯和甘油二酯大量累积。这将使得所期望的反应不可能容易地进行；具体而言，预期的复杂的且不确定的反应混合物将使产物的纯度不令人满意，由此使得其不可能在化妆品和/或皮肤病学中应用。

此外，单酰基甘油酯和二酰基甘油酯显示出显著的表面活性剂性质，这使得反应混合物的加工非常困难。此外，表面活性剂分子可能通过例如使生物催化剂与其载体物质分离(浸出(leaching))而严重地损害酶的活性和稳定性。这对于期望的生物催化过程而言将是致命的，主要表现在两方面：首先，催化剂将会由于浸出而被消耗，这意味将更频繁地补充新催化剂，因此将损害所述方法在经济上的吸引力。其次，通过浸出，产品将会被酶污染，使得其不可能用于化妆品和/或皮肤病学配制物中，特别是由于对于酶的过敏性反应的风险。

已出人意料地发现，在本发明的方法中，在任何时间都未检测到显著量的所述甘油单酯和甘油二酯。在使用脂肪/油时，在反应完成后唯一的可检测到的副产物是甘油。因此，举例而言，本发明的方法的一个优点是避免了甘油单酯或甘油二酯的上述缺点。

本发明方法的另一个优点在于，纯的多元醇例如甘油代表了在化妆品和皮肤病学中广泛地使用的溶剂并且也可以大量地保留在产物中。作为选择，通过使用水的提取步骤，可以容易地从最终产物中除去甘油。

本发明的方法的另一个优点在于，通过使用脂肪和油，特别是天然脂肪和油，其利用了容易获得的前体，并因此与使用不易获得的(部分地)合成的甲基酯、乙基酯和丙基酯相比较，从经济学角度而言显示出明显的优点。

本发明的方法的另一个优点在于，由于需要使用的酶的浓度相对较低例如低于所用的前体的10重量％，和/或生物催化剂可以重复使用多次例如至少10次，因此酰胺化反应可以以经济学上有价值的方式进行。因此本发明的方法的另一个优点在于可以制备高纯度的产物(例如活性物质含量＞90％且N，O-二酰化产物的比例低于5％)而不需要复杂的加工反应例如色谱或分步结晶。

因此，本发明涉及生物催化制备通式I的鞘脂的方法

所述方法通过在生物催化剂的存在下，所述生物催化剂包括属于酶分类E.C.3.1.1的至少一种羧酸酯水解酶，使通式II的溶性鞘脂

与至少一种羧酸酯反应而进行，所述羧酸酯选自通式IIIa-e的化合物

其中R¹各自独立地表示任选地不同的具有2至55个碳原子的直链或支化的烷基链，任选地包含一个或多个重键和/或芳环或杂芳环，任选地插入有氧原子或酯或酰胺官能团且任选地被选自烷基、羟基、酮或胺基团的至少一种其它基团所取代，

R²表示H、磷酸胆碱、乙醇胺、丝氨酸或糖，

X表示CH＝CH、CH₂-CH₂或CH₂-HCOH。

酶分类E.C.3.1.1的羧酸酯水解酶优选为能够从真菌类生物体分离的属于酶分类E.C.3.1.1的羧酸酯水解酶，和与能够从真菌类生物体分离的上述羧酸酯水解酶在氨基酸水平上至少60％同源，优选至少80％同源，更优选至少90％同源，特别优选至少95％、98％或99％同源的属于酶分类E.C.3.1.1的羧酸酯水解酶。

在本发明的上下文中，“氨基酸水平的同源性”是指可以借助于已知方法确定的“氨基酸一致性”。通常，使用具有考虑了具体需求的算法的计算机程序。用于确定一致性的优选的方法首先在待比较的序列之间产生最大的一致性。用于确定一致性的计算机程序包括但不限于GCG程序包，其包括：

-GAP(Deveroy，J.等，Nucleic Acid Research 12(1984)，387页，Genetics Computer Group University of Wisconsin，Medicine(WI)，和

-BLASTP，BLASTN和FASTA(Altschul，S.等，Journal of Molecular Biology 215(1990)，403-410页。BLAST程序可以获自the National Centre For Biotechnology Information(NCBI)以及其他来源(BLAST handbook，Altschul S.等，NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894；Altschul S.等，上述)。

本领域技术人员知道可获得各种用于计算两个核苷酸或氨基酸序列之间的相似度或一致性的计算机程序。因此，两个氨基酸序列之间的一致性百分比可以通过例如已被整合入GCG软件包(可通过http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970)确定，具体地，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，间隙权重(gap weight)为16、14、12、10、8、6、或4，且长度权重(length weight)为1、2、3、4、5、或6。本领域技术人员应认识到，使用不同的参数将导致略微不同的结果，但是两个氨基酸序列之间的一致性百分比整体上没有显著的不同。通常，使用预设定应用Blossom62矩阵(间隙权重：12，长度权重：1)。

对于本发明，根据上述算法，60％的一致性意味着60％的同源性。对于更高的一致性而言同样如此。

本发明的方法中的羧酸酯特别优选地选自通式IIIa-e的化合物，至少一种羧酸与甘油的酯，其中所述羧酸选自基于天然植物或动物油的具有6-30个碳原子，特别是8-22个碳原子的天然存在的脂肪酸。天然的脂肪酸为非支化的且由偶数个(even number)碳原子组成。任何双键都具有顺式构型。实例为：己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、异硬脂酸、硬脂酸、12-羟基硬脂酸、二羟基硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、岩芹酸、反油酸、花生酸、山嵛酸、芥酸、鳕油酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、花生四烯酸、9-或13-羟基十八碳二烯酸、15-羟基二十碳四烯酸和一系列所谓的α-羟基酸。同样，就此而言，羧酸特别优选为羟基官能化的酸的缩聚产物，例如聚-12-羟基硬脂酸或聚蓖麻油酸。

根据本发明，也可以使用溶性鞘脂的酸加成产物(其也被称为酸加成盐)，例如在先前提及的植物鞘氨醇的情况中在已确定的发酵过程中产生的那些，例如在P.Lersch，U.Schick，Spec.Chem.Mag.，2003，23(6)，30-31中所述。优选使用的溶性鞘脂的酸加成产物是溶性鞘脂的羧酸羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、碳酸盐、氢氧化物或卤化物，特别优选溶性鞘脂的氯化物和硫酸盐。

在本发明的方法中使用溶性鞘脂的酸加成产物时，优选地，在酶促反应之前，通过溶性鞘脂的酸加成产物的去质子化制备溶性鞘脂。

以此方式获得的溶性鞘脂在下文中也被称为溶性鞘脂碱。

去质子化处理可以在溶性鞘脂的酸加成产物在常规有机溶剂中的溶液或混悬液中进行。可以使用的溶剂的实例为：石蜡、一元醇或多元醇(例如甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、环己醇、甲基环己醇、2-丁基-1-辛醇及其异构体、乙二醇、甘油、双丙酮醇、异丁醇等)、醚(二乙醚、叔丁基甲基醚、四氢呋喃、二氧六环、聚乙氧基化物、聚丙氧基化物和共聚物等)、酮(丙酮、甲基异丁基酮、甲基乙基酮等)、酯(柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、异丁酸异丁酯、乙酸异丁酯、异壬酸异壬酯、乙酸2-乙基己酯、乙酸环己酯、乙酸4-叔丁基环己酯)。优选毒理学上可接受的溶剂例如甲基异丁基酮或2-甲基-2-丁醇。

去质子化步骤可以在其中溶剂处于液态的反应温度下进行。优选在-80℃和+150℃之间的反应温度下进行，特别优选0℃和120℃之间的反应温度，更特别优选+25℃和+100℃之间的反应温度。

以此方式获得的溶性鞘脂碱的溶液本身可以用于酶促反应，或可以预先经过过滤。

在本发明的另一个实施方案中，去质子化步骤的溶剂可以通过本领域技术人员熟知的方法除去(例如，通过蒸馏除去，或通过沉淀/结晶溶性鞘脂碱并随后过滤而除去)。溶性鞘脂碱可以在酶促反应之前例如通过沉淀或结晶或通过蒸馏除去溶剂任选地被分离。优选在溶性鞘脂的酸加成产物的去质子化和生物催化制备之间进行过滤步骤(其中去质子化处理中产生的盐被除去)。

作为可选方案，可以在生物催化过程中通过溶性鞘脂的酸加成产物的去质子化而制备溶性鞘脂碱。

与活化相关的去质子化可以通过使用碱而进行，优选使用有机碱或无机碱。优选地，用作无机碱的是无机氢氧化物、碳酸盐、金属氢化物(例如：氢化锂铝、氢化钙、氢化钠等)、离子交换材料(例如阳离子或阴离子交换剂)，用作有机碱的是金属有机基团(organyl)(例如丁基锂)、醇盐、酰胺以及金属盐例如二异丙氨基锂。

已经出人意料地发现，在酶促反应中可以特别容易地反应的特别高质量的溶性鞘脂碱可以特别地由与酸加成盐反应不会形成任何水的那些碱提供。因此，特别优选的碱是与其反应的过程中不会释出水的那些碱。这些碱是质子化之后不会释出任何水的碱。优选地，使用碱金属醇盐作为碱，其可能以例如醇溶液存在。特别优选甲醇钠和甲醇钾。其同样可以以在有机溶剂中的溶液的形式使用。

在本发明的方法中用于避免反应中的水并且由此同样优选的另一个可选方案是使用与水结合的物质，优选与水结合的无机盐，例如，在使用碱金属和/或碱土金属氢氧化物作为碱时使用Na₂SO₄结合反应中产生的水。优选使用Na₂SO₄。

本发明所述方法中溶性鞘脂的酸加成产物与碱之间的摩尔比是10∶1至0.05∶1，优选3∶1至0.2∶1，特别优选1.4∶1至0.6∶1，更特别优选的是溶性鞘脂的酸加成产物与碱之间的摩尔比为等摩尔。

基于作为前体的通式IIIa-e的羧酸酯的初始质量，本发明的方法中生成的偏甘油酸酯的含量优选小于2.5％w/w，特别优选小于1％w/w，更特别优选小于0.5w/w。

在本发明的具体的实施方案中，将存在于用于制备溶性鞘脂碱的去质子化混合物中的任何水除去。用于此目的的除去水的方法为例如物理方法(例如蒸馏、膜方法、萃取或吸附(例如吸附至分子筛上))或化学方法(例如与金属氢化物和氧化物或其他反应物例如酸酐、酯等反应)。

如开始所述的那样，对于如WO94/26919(Gist-Brocades)中描述的现有技术而言，完全出人意料的是在本发明的方法中真菌脂肪酶可以用作有效的生物催化剂。

在本发明的方法中作为生物催化剂的特别是能够从真菌类生物体分离的属于酶分类E.C.3.1.1的羧酸酯水解酶，和/或与能够从真菌类生物体分离的上述羧酸酯水解酶在氨基酸水平上至少60％同源，优选至少80％同源，更优选至少90％同源，特别优选至少95％、98％或99％同源的属于酶分类E.C.3.1.1的羧酸酯水解酶，其中所述生物体选自：曲霉属(Aspergillus)、平脐蠕孢属(Bipolaris)、念珠菌属(Candida)、镰孢属(Fusarium)、地丝菌属(Geotrichum)、腐质霉属(Humicola)、小孢子菌属(Microsporum)、毛霉属(Mucor)、毕赤酵母属(Pichia)、嗜热丝孢菌(Thermomyces)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、根毛霉属(Rhizomucor)、小孢子菌属(Microsporum)、毛霉属(Mucor)、诺卡氏菌属(Nocardia)、糖酵母属(Saccharomyces)、链霉菌属(Streptomyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、接合糖酵母属(Zygosaccharomyces)。

示例性的代表为例如：青灰曲霉(Aspergillus caesiellus)、白色曲霉(A.candidus)、碳黑曲霉(A.carbonarius)、肉色曲霉(A.carneus)、薛氏曲霉(A.chevalieri)、棒曲霉(A.clavatus)、A.costaricaensis、A.cretensis、弯头曲霉(A.deflectus)、黄柄曲霉(A.flaviceps)、黄色曲霉(A.flavus)、A.flocculatosus、烟曲霉(A.fumigatus)、灰绿曲霉(A.glaucus)、A.ibericus、A.lacticoffeatus、A.lentulus、A.neobridgeri、构巢曲霉(A.nidulans)、黑色曲霉(A.niger)、霉白曲霉(A.niveus)、赭色曲霉(A.ochraceus)、米曲霉(A.oryzae)、寄生曲霉(A.parasiticus)、青霉状曲霉(A.penicilloides)、A.piperis、假美丽曲霉(A.pseudoelegans)、假费希氏曲霉(A.pseudofisheri)、局限曲霉(A.restrictus)、A.roseoglobulus、菌核黑色曲霉(A.sclerotioniger)、酱油曲霉(A.sojae)、A.steynii、萨氏曲霉(A.sydowii)、土曲霉(A.terreus)、A.udagawae、焦曲霉(A.ustus)、杂色曲霉(A.versicolor)、A.westerdijkiae、澳大利亚平脐蠕孢(Bipolaris australiensis)、夏威夷平脐蠕孢(B.hawaiiensis)、穗状离蠕孢(B.picifera)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、柱状假丝酵母(C.cylindracea)、解脂假丝酵母(C.lipolytica)、皱褶假丝酵母(C.rugosa)、产朊假丝酵母(C.utilis)、粗壮假丝酵母(C.robusta)、乳酒假丝酵母(C.kefyr)、白色假丝酵母(C.albicans)、光滑假丝酵母(C.glabrata)、克鲁斯氏假丝酵母(C.krusei)、葡萄牙假丝酵母(C.lusitaniae)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、厚垣镰孢(Fusarium chlamydosporum)、天蓝镰孢(F.coeruleum)、双胞镰孢(F.dimerum)、F.incarnatum、串珠镰孢(F.moniliforme)尖孢镰孢(F.oxysporum)、层出镰孢(F.proliferatum)、甘蔗镰孢(F.sacchari)、半裸镰孢(F.semitectum)、腐皮镰孢(F.solani)、拟分枝孢镰孢(F.sporotrichoides)、胶孢镰孢(F.sub glutinans)、烟草镰孢(F.tabacinum)、轮枝镰孢(F.verticillioides)、白地霉(Geotrichum candidum)、克氏地霉(G.klebahnii)、棕黑腐质霉(Humicola fuscoatra var.Fuscoatra)、灰腐质霉(H.a grisea var.Grisea)、灰腐质霉(H.grisea var.Thermoidea)、特异腐质霉(H.insolens)、Microsporum amazonicum、头癣小孢子菌(M.audouinii)、M.audouinii var.Langeronii、M.audouinii var.Rivalierii、M.boullardii、犬小孢子菌(M.canis)、犬小孢子菌歪斜变种(M.canis var.distortum)、库克氏小孢子菌(M.cookei)、马小孢子菌(M.equinum)、铁锈色小孢子菌(M.ferrugineum)、棕黄色小孢子菌(M.fulvum)、鸡小孢子菌(M.gallinae)、石膏状小孢子菌(M.gypseum)、矮小孢子菌(M.nanum)、生色小孢子菌(M.persicolor)、早熟小孢子菌(M.praecox)、葡萄状小孢子菌(M.racemosum)、范布瑞西米氏小孢子菌(M.vanbreuseghemii Mucor javanicus)、M.pusillus、M.plumbeus、M.racemosus、M.hiemalis、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、巴西诺卡氏菌(N.brasiliensis)、豚鼠耳炎诺卡氏菌(N.otitidiscaviarum)、黄灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)、短密青霉(P.brevicompactum)、产黄青霉(P.chrysogenum)、沙门氏柏干酪青霉(P.camemberti)、指状青霉(P.digitatum)、柑桔青霉(P.citrinum)、普通青霉(P.commune)、棒青霉(P.corylophilum)、皮落青霉(P.crustosum)、圆弧青霉(P.cyclopium)、扩展青霉(P.expansum)、绳状青霉(P.funiculosum)、平滑青霉(P.glabrum)、灰绿青霉(P.glaucum)、灰棕黄青霉(P.griseofulvum)、意大利青霉(P.italicum)、马尼弗氏青霉(P.marneffei)、纳地青霉(P.nalgiovense)、P.nordicum、点青霉(P.notatum)、徘徊青霉(P.palitans)、变紫青霉(P.purpurrescens)、产紫青霉(P.purpurogenum)、奥尔森氏青霉(P.olsonii)、P.oryzae、娄格法尔特氏青霉(P.roqueforti)、变幻青霉(P.variabile)、鲜绿青霉(P.viridicatum)、疣孢青霉(P.verrucosum)、金合欢毕赤酵母(Pichia acaciae)、P.amylophilia、P.ciferrii，巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、P.alni、美国毕赤酵母(P.Americana)、P.amethionina、红橡胶树毕赤酵母(P.angophorae)、安格斯毕赤酵母(P.angusta)、异常毕赤酵母(P.anomala)、P.antillensis、P.barkeri、P.besseyi、异落毕赤酵母(P.bimundalis)、双孢毕赤酵母(P.bispora)、P.bovis、P.cactophila、加拿大毕赤酵母(P.Canadensis)、P.capsulata、P.caribaea、P.castillae、钱巴德氏毕赤酵母(P.chambardii)、荷兰毕赤酵母(P.delftensis)、P.deserticola、P.dryadoides、P.euphorbiae、P.euphorbiiphila、费比恩毕赤酵母(P.fabianii)、P.faecalis、粉状毕赤酵母(P.farinose)、发酵毕赤酵母(P.fermentans)、P.finlandica、泌液毕赤酵母(P.fluxuum)、P.galaeiformis、P.glucozyma、季也蒙毕赤酵母(P.guilliermondii)、P.hampshirensis、甲虫毕赤酵母(P.haplophila)、P.heedii、P.heimii、P.henricii、P.holstii、P.inositovora、杰丁毕赤酵母(P.jadinii)、P.japonica、克鲁弗利氏毕赤酵母(P.kluyveri)、P.kodamae、P.lynferdii、P.maganishii、中型毕赤酵母(P.media)、膜璞毕赤酵母(P.membranifaciens)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)、P.methylivoria、P.mexicana、P.meyerae、P.minuta、P.mississippiensis、P.nakasei、P.nakazawae、挪威毕赤酵母(P.norvegensis)、P.oezlemii、P.ofunaensis、奥默列氏毕赤酵母(P.ohmeri)、指甲毕赤酵母(P.onychis)、P.opuntiae、P.petersonii、P.philodendri、P.philogaea、皮杰普氏毕赤酵母(P.pijperi)、P.pini、P.populi、P.pseudocactophila、栎毕赤酵母(P.quercuum)、P.rabaulensis、罗丹纳毕赤酵母(P.rhodanensis)、柳毕赤酵母(P.salicaria)、棘胫小蠹毕赤酵母(P.scolyti)、赛沟毕赤酵母(P.segobiensis)、森林毕赤酵母(P.silvicola)、斯巴达克毕赤酵母(P.spartinae)、树干毕赤酵母(P.stipitis)、法国斯特拉斯堡毕赤酵母(P.strasburgensis)、亚膜汉逊酵母(P.subpelliculosa)、P.sydowiorum、P.tannicola、P.thermotolerans、帽孢毕赤酵母(P.toletana)、喜海藻糖毕赤酵母(P.trehalophila)、P.triangularis、P.veronae、威克曼氏毕赤酵母(P.wickerhamii)、P.xylosa、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginose)、无根根霉(Rhizopus arrhizus)、戴列马根霉(R.delemar)、雪白根霉(R.niveus)、米根霉(R.oryzae)、无接合孢子根霉(R.azygosporus)、小孢根霉(R.microsporus)、希伯来根霉(R.schipperae)、匍枝根霉(R.stolonifer)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、Saccharomyces barnettii、巴杨氏糖酵母(S.bayanus)、S.castellii、酿酒糖酵母(S.cerevisiae)、大连糖酵母(S.dairenensis)、微小糖酵母(S.exiguous)、奇异糖酵母(S.paradoxus)、巴斯德酵母(S.pastorianus)、S.rosinii、S.servazii、S.spencoerorum、S.transvaalensis、单孢糖酵母(S.unisporus)、拜烈氏糖酵母(S.bailii)、链霉菌属(Streptomyces spp.)、阿萨希丝孢酵母(Trichosporon asahii)、星状丝孢酵母(T.asteroids)、白吉利氏丝孢酵母(T.beigelii)、T.coremiiforme、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、T.faecale、T.gracile、皮瘤丝孢酵母(T.inkin)、粘性丝孢酵母(T.mucoides)、卵形丝孢酵母(T.ovoides)、茁芽丝孢酵母(T.pullulans)、双孢接合糖酵母(Zygosaccharomyces bisporus)、Z.cidri、发酵接合糖酵母(Z.fermantati)、弗罗棱接合糖酵母(Z.florentinus)、蜂蜜接合糖酵母(Z.mellis)、小椭圆接合糖酵母(Z.microellipsoides)、Z.mrakii、鲁氏接合糖酵母(Z.rouxii)。

本发明的方法中特别优选使用的羧酸酯水解酶为选自以下的酶：获自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶(入藏号(accessionnumber)O59952)、获自南极假丝酵母(Candida Antarctica)的脂肪酶A和B(入藏号P41365)、和获自米黑毛霉(Mucor miehei)的脂肪酶(入藏号P19515)、获自腐质霉属(Humicola spp.)(入藏号O59952)的脂肪酶、(获自Rhizomucor javanicus(入藏号S32492)的脂肪酶、获自米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶(入藏号P61872)、获自皱褶假丝酵母(Candida rugosa)的脂肪酶(入藏号P20261、P32946、P32947、P3294和P32949)、获自雪白根霉(Rhizopus niveus)的脂肪酶(入藏号P61871)、获自沙门氏柏干酪青霉(Penicillium camemberti)的脂肪酶(入藏号P25234)、获自黑色曲霉(Aspergillus niger)的脂肪酶(ABG73613、ABG73614和ABG37906)和获自圆弧青霉(Penicillium cyclopium)的脂肪酶(入藏号P61869)，以及在每种情况下在氨基酸水平上至少60％同源，优选至少80％同源，更优选至少90％同源，特别优选至少95％、98％或99％同源的那些。关于同源性可以参考上述定义。

商业上的实例以及本发明的方法中同样优选地使用的羧酸酯水解酶为商购产品Lipozyme TL IM、Novozym 435、Lipozyme IM 20、Lipase SP382、Lipase SP525、Lipase SP523(都是Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark的商品)、Chirazyme L2、Chirazyme L5、Chirazyme L8、Chirazyme L9(都是Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany的商品)、和Lipase M“Amano”、Lipase F-AP 15“Amano”、Lipase AY“Amano”、Lipase N “Amano”、Lipase R“Amano”、Lipase A“Amano”、Lipase D“Amano”、Lipase G“Amano”(都是Amano，Japan的商品)。

优选地，生物催化剂以无水形式或部分水合的形式使用。其可以固定化地使用或以冷冻干产物的形式使用。可以用于固定化的载体是惰性的有机或无机载体。优选地使用的惰性载体或在酶的固定化形式中存在的惰性载体是具有以下粒径分布的那些微粒载体：其中至少90％的颗粒具有10-5000μm的粒径，优选具有50μm-2000μm的粒径。可以特别地使用的有机载体是包括以下物质或由以下物质组成的那些：聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、PTFE和/或其他聚合物。根据待固定化的酶，可以特别地使用酸性或碱性离子交换树脂例如Duolite A568、Duolite XAD 761、Duolite XAD 1180、Duolite XAD 7HP、Amberlite IR 120、Amberlite IR 400、Amberlite CG 50、Amberlyst 15(都为Rohm and Haas的产品)或Lewatit CNP 105和Lewatit VP OC 1600(Lanxess，Leverkusen，Germany的产品)作为载体材料。可以使用的无机载体为本领域中已知的氧化物和/或陶瓷载体。特别地，可以使用的无机载体为例如硅藻土、沸石、硅石、可控孔度玻璃(CPG)或其他载体，例如L.Cao，“Carrier-bound Immobilized Enzymes：Principles，Application and Design”，Wiley-VCH：2005，Weinheim，Germany中描述的那些。在酶的固定化形式中存在的惰性载体或用于产生酶的固定化形式所用的惰性载体特别优选地由聚乙烯基苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯组成。

根据本发明，在颗粒上的固定化可能为共价地或非共价地，优选为非共价地。对于非共价地固定化，载体可以使用例如酶的水溶液温育或浸渍，所述酶的水溶液可以任选地包含其他成分例如无机盐或洗涤剂。该温育/浸渍可以在例如0℃-50℃的温度下进行，优选在0℃-40℃的温度下进行。温育/浸渍优选地在几分钟至若干小时的时间段内进行。可以通过使用用于蛋白质测定的常规方法测定溶液中的酶的浓度，从而跟踪温育的进展。在达到期望的固定化程度之后，可以优选地使用水洗涤载体并且任选地干燥。

也可以以静止细胞的形式或以干的形式使用包含合适的生物催化剂的全细胞，优选地通过现有技术的方法透化。

根据本发明，生物催化剂与所用的底物的定量比可以为0.01％(w/w)至300％(w/w)。优选的质量比由在相应反应条件下的生物催化剂的比活性得出(特别地取决于底物、其浓度、溶剂和反应温度)。根据这些参数，优选的生物催化剂的量是使得可以在1-96小时，优选8-24小时的时期内使反应物完全转化的量。基于前体的总质量，所使用的生物催化剂的量优选在1％(w/w)-100％(w/w)的范围内，特别优选在1％(w/w)-50％(w/w)的范围内，特别是在1％(w/w)-20％(w/w)的范围内。

在具体的实施方案中，回收生物催化剂。

根据本发明，在酶促反应开始时存在的反应物溶性鞘脂与羧酸酯的摩尔比可以为1∶10至10∶1。就此而言，术语“摩尔比”指溶性鞘脂胺与酰基供体羧酸酯基团的摩尔比。优选使用1∶3-3∶1的量的比例。特别优选使用1∶1.4-1.4∶1的量的比例，特别是等摩尔比例的量。

反应物可以以不包含其他增溶剂的熔融状态存在，或者可以溶解于或混悬于有机溶剂中。反应优选在有机溶剂中进行。特别适合的溶剂是在20℃至130℃的温度下能够以高浓度溶解反应物的那些溶剂。已证明的特别适合的实例(不限于这些溶剂)是酮例如甲基异丁基酮或环己酮，空间位阻的仲醇例如2-丁基-1-辛醇、甲基环己醇、1-甲氧基-2-丙醇、2，3-丁二醇2-辛醇、双丙酮醇、2-甲基-2-丁醇，空间位阻的酯例如乙酸4-叔丁基环己基酯、乙酸2-乙基己基酯、乙酸环己基酯，和醚例如1，4-二氧六环、四氢呋喃和Varonic APM(Evonik Goldschmidt GmbH，Essen，Germany)。已被证明不适合的溶剂是被生物催化剂以显著的活性转化的那些溶剂，特别是酯。在使用植物鞘氨醇作为前体并使用丁酸乙酯的反应中，除期望的产物以外，可能例如检测显著量的N-丁酰植物鞘氨醇和与所使用的酰基供体的酯交换反应产物(例如硬脂酸甲酯)。使用乙酸丁酯时也是如此(形成N-乙酰基植物鞘氨醇和酰基供体丁基酯)。

反应优选在无水条件下进行，无水条件的定义为通过Karl Fischer方法测定的水含量不超过0.100M，优选不超过0.010M，且特别优选最大值为0.005M。

高底物浓度对于反应速率是特别有利的。当转化率高时由此产生高的产物浓度，但出人意料地是当转化率高时对于酶活性没有负面作用。由于在酶促反应中常常观察到产物抑制作用，因此这对于本领域技术人员而言是出人意料的。此外，已出人意料地发现从反应混合物中除去一种反应产物(神经酰胺或醇)对于获得非常高的定量转化而言不是绝对必需的。根据本领域技术人员熟知的Le Chatelier的理论，这对于本发明的平衡反应而言应该是期望的。现有技术(WO94/26919，Gist-Brocades)的仅67-78％的反应转化率导致对其必要性的期望。然而，根据本发明，可以在更低的底物浓度下有效地反应。

在本发明的上下文中，对于各反应物，反应开始时优选的反应物浓度为0.01M-3M，特别是0.2M-2M，特别优选是0.5M-1.0M。

对于反应温度，已发现特别适合的温度是底物可以均匀地溶解在溶剂中的那些温度。就此而言，已证明20℃-130℃的反应温度是有利的。特别地，在高温下，由于颜色变化，需要对反应混合物进行小心的脱气。然而，已出人意料地发现，在100℃及以下的反应温度下这类预防措施是不需要的。因此，反应温度优选40℃-90℃，且特别优选70℃-85℃。

反应优选在小于1巴的压力下进行，优选在小于0.5巴的压力下进行，特别优选在小于0.05巴的压力下进行。

反应可以在间歇过程(搅拌容器)中进行，或在固定床反应器中连续地或半连续地进行。特别地，人们认为在间歇过程中，生物催化剂的失活率高。在这里应注意的是由于通过搅拌产生的机械应力而导致的生物催化剂的机械破坏，以及伴随由反应物和溶剂导致的失活作用的生物催化剂的热失活。这种作用对于本领域技术人员而言是已知的，并且文献中公开了适当的补救措施。因此，例如当在搅拌过程中发生生物催化剂的机械磨损时，可以通过使用固定床而将其避免。本领域技术人员熟知的其他反应器种类也同样适于避免机械上的酶失活。在使用酯作为酰基供体时，还预期生物催化剂将会被释出的醇化学地失活(例如：Y.Yoshida等，J.Biosci.Bioeng.，2006，102(1)，66-68)。用于避免这种失活的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括例如通过蒸馏或使用膜方法而从反应混合物中除去醇。然而，已出人意料地发现，即使不使用上述方法，也可以将生物催化剂重复使用若干次而没有活性的显著损失。

在使用天然甘油酯时，特别地预期的是甘油单酯和甘油二酯将至少以中间产物的形式在反应混合物中累积，并且如果转化不完全，其会导致对产物的显著的污染。由于上述的偏甘油酯的表面活性剂性质，还预期可能会发生生物催化剂的显著失活。然而，已出人意料地发现所预期的偏甘油酯几乎检测不到。在反应过程中，通过气相色谱分析至多能够检测到痕量(＜1％w/w)。

现有技术中描述的所有方法的共同点在于所得的产物是鞘脂和高比例的(高至全部产物的19％)的相应的N，O-二酰化产物的组合物。这些组合物完全不能用于化妆品组合物中，这例如是由于N，O-二酰化产物的比例不少于5％。已另外出人意料地发现，在本发明的方法中，仲胺官能团的酰胺化明显地优先于醇官能团之一的酯化。而应当预期的是相反的行为，特别是优先伯(也就是说空间上容易接近的)醇官能团。现有技术(WO94/26919，Gist-Brocades)描述了相似的情形：在使用细菌脂肪酶时并且甚至在酰基供体相对于植物鞘氨醇而言为60％摩尔过量的情况下，其中获得的反应产物包含显著比例的N，O-二酰化产物(单酰化产物∶二酰化产物＞1∶5)。

相反，在本发明的方法中可以显示出，只要反应混合物中仍然存在溶性鞘脂，则即使在酰基供体相对于溶性鞘脂而言为3.6倍过量的情况下，仍没有显著的二酰化作用。仅在溶性鞘脂已被完全转化为鞘脂的情况下才可能检测到缓慢的酯化反应活性。在以化学计量使用溶性鞘脂和酰基供体的情况下，几乎观察不到上述的不期望的副反应。

因此本发明涉及即使以酶促反应的粗产物形式也能够获得特别纯的N-酰基植物鞘氨醇的方法。式I的目标化合物的转化率优选为大于80％，特别优选大于85％，更特别优选大于90％的理论上预期的转化率。

本发明的方法还适于制备包含式I的化合物以及0.001-19质量％，优选0.005-19质量％，特别优选0.01-5质量％的相应的N，O-二酰化产物的组合物。

因此，本发明还涉及使用本发明的方法制备的包含式I的化合物以及0.001-19质量％，优选0.005-19质量％，特别优选0.01-5质量％的相应的N，O-二酰化产物的组合物。

本发明还涉及使用本发明的方法制备的鞘脂。

本发明还涉及用于从反应混合物中分离鞘脂的方法。由于鞘脂的有利的物理性质，可以通过结晶/沉淀而容易地自反应溶液中分离鞘脂，并且因此已然很高的粗产物的纯度可以以简单的方式而进一步提高。

本发明的鞘脂和组合物特别适于制备化妆品和药物配制物。因此，本发明还涉及包含本发明的至少一种鞘脂和/或本发明的一种组合物的化妆品或药物配制物。

在下文详述的实施例中以实例的方式对本发明进行描述，而无意将本发明限于实施例中所提及的实施方案，本发明的应用范围由整个说明书和权利要求得出。