具有β-葡萄糖苷酶作为白蚁卵识别信息素的人工白蚁卵及用其控制白蚁

实施本发明的最佳方式

具有运送卵的特征的昆虫如白蚁具有这样的特征，即通过以下方式照顾卵：将卵运送并堆叠在它们的巢中，并且舔舐卵的表面等，或与其它个体进行交哺。通过利用这种特征，可以灭杀或控制害虫。例如，白蚁将具有类似于天然卵的尺寸和形状，并且在其表面上含有卵识别信息素的模拟卵识别为卵，并且将该模拟卵运送到巢中它的卵块中。在巢中，白蚁进行护理行为，如舔舐模拟卵的表面，并且与其它个体进行交哺。因此，通过使模拟卵包含活性物质，例如，活性成分诸如杀虫活性成分、孵化抑制物质、繁殖抑制物质、或生长抑制成分，并且使白蚁将该模拟卵运送到卵块中，可以有效破坏群体的繁殖中心。

如上所述，本发明人已研究了在卵识别中有溶菌酶以外的物质用作卵识别信息素参与的可能性，以便进一步改善和稳定模拟卵的运送活性。结果是，他们通过添加β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21，该酶已知是白蚁的消化酶)、其生物学片段或其相关肽，成功地显著提高了模拟卵的运送活性，从而完成了本发明。换言之，在本发明中，β-葡萄糖苷酶(其仅仅作为白蚁的消化酶而为人所知)、其盐、其生物学片段或相关肽首次用作卵识别信息素，并且因此已获得令人满意的结果。

因此，在第一方面中，本发明提供模拟卵，所述模拟卵在其模拟白蚁的卵的基材中包含β-葡萄糖苷酶、其盐、其生物学片段或β-葡萄糖苷酶-相关肽作为卵识别信息素。

运送本发明的模拟卵并且可以通过本发明的方法灭杀的害虫可以是任何害虫，条件是它具有卵运送本能并且识别作为卵识别信息素的β-葡萄糖苷酶、其盐、其生物学片段或β-葡萄糖苷酶-相关肽。对其优选应用本发明的模拟卵和方法的害虫是白蚁。通过本发明灭杀的白蚁可以是任何种类的白蚁，并且不仅在日本，而且在世界范围内的白蚁可以是目标。通过本发明灭杀的白蚁的典型实例包括，但不限于，属于散白蚁属(Reticulitermes)和家白蚁属(Coptotermes)的白蚁。在本说明书中，害虫的灭杀还包括控制害虫。在本说明书中，害虫的意思是对人、农业动物、农产品、财产等造成有害效果的昆虫。其典型的实例包括白蚁。

在本发明中，β-葡萄糖苷酶、其盐、其生物学片段或相关肽用作卵识别信息素。β-葡萄糖苷酶广泛分布于微生物、植物和动物中。本发明中使用的β-葡萄糖苷酶可以源自任何种类，其来源的实例包括，但不限于，植物诸如杏树(almond)和苏铁科植物(cycad)；动物诸如白蚁、食木材性蟑螂、和蜗牛；和微生物诸如米曲霉(Aspergillus oryzae)、酵母、肠球菌(Enterococcal)、和属于杆菌(Bacillus)属的细菌。本发明中使用的β-葡萄糖苷酶可以是未提纯或提纯的。此外，本发明中使用的β-葡萄糖苷酶可以通过遗传重组方法制备。蛋白、多肽、或肽通过遗传重组方法的制备对于本领域的技术人员是熟知的。通常，期望的蛋白可以通过将期望蛋白的基因与载体连接并且将其引入到适当的宿主细诸如大肠杆菌(Escherichia coli)或酵母中，并增殖该细胞来获得。载体或宿主细胞的类型、载体引入条件、宿主细胞的培养条件、分离和提纯期望蛋白的方法等，可以由本领域技术人员从已知材料和已知方法中适当地选择。

本发明中使用的β-葡萄糖苷酶可以是盐的形式。β-葡萄糖苷酶盐可以是与能够形成盐的各种物质的盐，例如与有机酸的盐、与无机酸的盐、与有机碱的盐或与无机碱的盐。而且，例如，构成β-葡萄糖苷酶的天冬酰胺酸或谷氨酰胺酸的β-或γ-羧基与金属如钠或钾可以形成盐。而且，例如，可以与构成β-葡萄糖苷酶的碱性氨基酸的侧链形成盐。在本发明中，β-葡萄糖苷酶的生物学片段或β-葡萄糖苷酶-相关肽可以具有盐的形式。

此外，在本发明中，β-葡萄糖苷酶的生物学片段可以用作卵识别信息素。β-葡萄糖苷酶的生物学片段是多肽或肽，其具有β-葡萄糖苷酶的部分氨基酸序列，并且具有与β-葡萄糖苷酶类似的卵识别活性。该片段是短链，且因此适于通过遗传重组方法大规模制备。

此外，在本发明中，β-葡萄糖苷酶-相关肽可以用作卵识到信息素。β-葡萄糖苷酶-相关肽是蛋白、多肽或肽，其具有与β-葡萄糖苷酶类似的卵识别活性，并且与β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的生物学片段不同。β-葡萄糖苷酶-相关肽可以源自天然来源，或可以是合成的化合物。通过技术如定点诱变法(site-directed mutagenesis method)，β-葡萄糖苷酶-相关肽可以具有与天然β-葡萄糖苷酶不同的氨基酸序列。例如，在本发明中可以制备和使用具有白蚁更喜好的氨基酸序列的β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶的生物学片段、或β-葡萄糖苷酶-相关肽。而且，例如，在本发明中可以制备和使用具有这样的氨基酸序列的β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶的生物学片段、或β-葡萄糖苷酶-相关肽，所述氨基酸序列对特定白蚁具有高特异性。

基材中β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶的生物学片段、或β-葡萄糖苷酶-相关肽的含量可以根据多种因素，诸如待使用的β-葡萄糖苷酶的种类、特征、和量，害虫的种类，活性物质的种类和量，以及期望效果的种类和程度而确定。

本发明的模拟卵必须具有与待灭杀的害虫的卵的形状、尺寸和特征类似的形状、尺寸和特征。本发明中使用的模拟卵的形式和尺寸可以通过模拟害虫的天然卵的形式和尺寸而制备。在白蚁的情形中，模拟卵的形式可以是长卵形或球形。在模拟白蚁卵具有长卵形的情形中，优选地，其短直径近似等于或稍微大于待灭杀的白蚁的卵的短直径。例如，当白蚁卵的短直径为约0.25至约0.45毫米时，长卵形模拟卵的短直径可以为约0.25至约0.6毫米，优选约0.4至约0.55毫米，并且更优选约0.45毫米。而且，在球形模拟白蚁卵的情形中，优选地，其直径近似等于或稍微大于待灭杀的白蚁的卵的短直径。例如，当白蚁卵的短直径为约0.25至约0.45毫米时，球形模拟卵的直径可以为约0.25至约0.6毫米，优选约0.4至约0.6毫米，并且更优选约0.45至约0.55毫米。从容易形成的观点考虑，球形模拟卵是优选的。

必要的是，本发明的模拟卵不仅物理性质如上述形状和尺寸以及重量或硬度，而且化学性质，特别是卵识别信息素的存在状态，都与害虫的天然卵的那些相同或类似。即，优选的是，当模拟卵的基材含有β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶的生物学片段、或β-葡萄糖苷酶-相关肽时，这些物质存在于基材的表面上。

本发明的模拟卵的基材可以是可以制备具有与害虫的天然卵的形状和特征类似的形状和特征的模拟卵的任意材料。优选用于制备本发明的模拟卵的基材包括：热塑性树脂如聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚酯，聚氯乙烯和聚碳酸酯；热固性树脂如尿素树脂，环氧树脂，酚醛树脂和聚氨基甲酸酯；和多孔材料如硅胶和沸石；陶瓷和玻璃。

基材含有β-葡萄糖苷酶、其盐、其生物学片段或β-葡萄糖苷酶-相关肽，以及活性成分，由此制备本发明的模拟卵。许多用于使这些物质包含在基材中的方法对于本领域技术人员是已知的。在制备基材中，可以将这些物质混合在其中，或可以将这些物质在制备基材以后包含在基材中。例如，在制备基材中，可以将这些物质混合或揉和(knead)在其中，或可以用这些物质覆盖、浸渍、涂敷或喷射(splay)所制备的基材。而且，由于用于将蛋白、多肽、或肽固定到固体支持物的方法是已知的，因此可以将这些方法应用于此。固定方法包括吸附法、共价键法、离子键法、包囊法等。

对本发明的模拟卵的基材施用的β-葡萄糖苷酶、其盐、其生物学片段或β-葡萄糖苷酶-相关肽的量可以容易地由本领域技术人员确定，这取决于多种因素，诸如害虫的物种(来源生物体)、物理化学性质等、种类，活性物质的种类和量、以及期望效果的种类和程度(参见，例如，本申请的实施例)。

优选地，使得基材包含β-葡萄糖苷酶、其盐、其生物学片段或β-葡萄糖苷酶-相关肽，和活性成分的模式的具体实例包括表面涂敷模式、基材添加模式、和胶囊溶解模式。在表面涂敷模式的一个实例中，将活性成分涂敷到基材的表面上，并且将β-葡萄糖苷酶、其盐、其生物学片段或β-葡萄糖苷酶-相关肽涂敷于其上。在基材添加模式的一个实例中，在其中混合有活性成分的基材的表面上，涂敷β-葡萄糖苷酶、其盐、其生物学片段或β-葡萄糖苷酶-相关肽。在胶囊溶解模式的一个实施中，将膜形基材成形为胶囊形基材，并且将活性成分密封在其中，并且将β-葡萄糖苷酶、其盐、其生物学片段或β-葡萄糖苷酶-相关肽涂敷在基材的表面上。

可以用于本发明的模拟卵和灭杀方法的活性物质可以是可以实现害虫的灭杀或控制的任意物质。例如，活性物质可以扰乱害虫的行为，并且因而导致群体的破坏。适于灭杀或控制害虫的活性物质包括杀虫活性成分、孵化抑制物质、繁殖抑制物质或生长抑制成分。可以根据多种因素，诸如活性物质的种类或害虫的种类和期望活性(要对害虫给予的破坏)的种类或程度，选择可以用于本发明的模拟卵和方法的活性物质的种类和量。通常，选择活性物质的种类和量，以使得可以对目标害虫充分施加期望的作用。然而，选择还在这样的考虑下进行，即以使得害虫的模拟卵的运送率不会下降，并且使得通过使用本发明的模拟卵和方法，对人和周围农业动物或有益昆虫不会产生不利影响。

可以将一种或两种以上的活性成分用于本发明的模拟卵和灭杀方法。例如，可以使用杀虫活性成分，诸如拟除虫菊酯化合物、有机磷化合物、氨基甲酸酯化合物、N-芳基二唑化合物、腙化合物、氨磺酰化合物或天然杀虫成分。另外，可以将昆虫生长调节剂如壳多糖合成抑制剂、保幼激素-样活性化合物和蜕皮激素-样活性化合物用作活性成分。不用说，可以用于本发明的活性成分不限于以上化合物。

在本发明的模拟卵中，优选地，活性成分是缓慢作用的。如上所述，害虫如白蚁将这样的模拟卵识别为卵并且将该模拟卵运送到巢中它的卵块中，所述模拟卵具有与天然卵类似的尺寸和形状，并且在其表面上包含卵识别信息素。害虫通过护理行为例如舔舐模拟卵的表面摄取活性成分。当群体的一些个体摄取活性成分时，活性成分通过经由口道食物和肛道食物的高频交哺而遍及整个群体。因此，本发明中使用的优选活性成分不在运送模拟卵时或害虫摄取以后即刻发挥作用，或以不影响行为如模拟卵运送或交哺的程度发挥作用，且在将模拟卵运送到巢中并且在许多个体之间进行交哺以后发挥作用。通过使用这种缓慢作用的活性成分，可以有效灭杀目标群体中的许多个体，并且活性成分的用量小。因此，对其它生态系统的影响也小。可以用于本发明的模拟卵的缓慢作用的活性成分不仅包括缓慢作用的杀虫成分如伏蚁腙(hydramethylnon)，还包括缓慢作用的孵化抑制成分、缓慢作用的繁殖抑制成分、以及缓慢作用的生长抑制成分，但不仅限于此。

在本发明的模拟卵中，还优选的是，基材由持续释放材料制成。其基材由持续释放材料制成的模拟卵是优选的，由此，模拟卵被运送到巢中，然后活性物质逐渐释放并被害虫摄取。这种模拟卵包括由可被害虫的唾液降解的材料制成的卵。优选地，使活性成份包含在基材内部(通过混入、混合、填充等)，模拟卵被运送到巢中，然后基材被害虫的唾液降解，并且由此释放内部活性成分。特别地，在以上基材添加模式或胶囊溶解模式等情形中，优选使用可以被害虫的唾液降解的基材。可以被害虫的唾液降解的基材的材料可以取决于害虫的唾液中的消化酶的种类而选择。例如，当害虫的唾液中含有纤维素酶时，可以使用由纤维素材料制成的基材。

本发明的模拟卵的特别优选类型是上述胶囊溶解类型。具体地，本发明的模拟卵可这样制备，即，通过将含有β-葡萄糖苷酶、其盐、β-葡萄糖苷酶的生物学片段或β-葡萄糖苷酶-相关肽的膜形基材成形为类似于天然卵的形状(即，成为胶囊形式)，并且使活性成分包含在胶囊内而制备。形成这种胶囊的方法对于本领域技术人员是已知的。所述膜的材料的实例包括氧化物膜和纤维素膜。优选地，膜形基材具有持续释放性质，并且优选使用例如可以被害虫的唾液降解的纤维素膜。由这种胶囊密封模式制备的模拟卵还适于在野外(field)灭杀大的群体。

含有由这种持续释放材料制成的基材的模拟卵在活性物质缓慢作用的情况下也有效，并且在活性物质不缓慢作用的情况下特别有效。

除了β-葡萄糖苷酶、其盐、β-葡萄糖苷酶的生物学片段或β-葡萄糖苷酶-相关肽以外，可以使本发明的模拟卵的基材包含一种或多种类型的其它卵识别信息素。其它卵识别信息素的类型或量可以根据目标害虫的种类适当选择。当害虫是白蚁时，可以使本发明的模拟卵的基材包含溶菌酶、其盐、溶菌酶的生物学片段或溶菌酶-相关肽。溶菌酶、其盐、溶菌酶的生物学片段或溶菌酶-相关肽可以源自任何物种的生物体，例如，可以源自卵清溶菌酶、其盐、其生物学片段或其相关肽。作为用于本发明的模拟卵的β-葡萄糖苷酶、其盐、β-葡萄糖苷酶的生物学片段或β-葡萄糖苷酶-相关肽以外使用的卵识别信息素，不是必需要使用高度提纯的产品。基材中卵识别信息素的含量可以根据多种因素，诸如待使用的β-葡萄糖苷酶的种类、特征、和量，害虫的种类，活性物质的种类或量，以及期望效果的种类或程度而确定。

溶菌酶盐可以是与能够形成盐的各种物质的盐，例如，与有机酸的盐、与无机酸的盐、与有机碱的盐，或与无机碱的盐。而且，例如，构成溶菌酶的天冬酰胺酸或谷氨酰胺酸的β-或γ-羧基与金属如钠或钾可以形成盐。而且，例如，可以与构成溶菌酶的碱性氨基酸的侧链形成盐。在本发明中，溶菌酶的生物学片段或溶菌酶-相关肽可以具有盐的形式。溶菌酶的生物学片段是多肽或肽，其具有溶菌酶的部分氨基酸序列，并且具有与溶菌酶类似的卵识别活性。溶菌酶-相关肽是蛋白、多肽或肽，其具有与溶菌酶类似的卵识别活性，并且与溶菌酶和溶菌酶的生物学片段不同。溶菌酶-相关肽可以源自天然来源或可以是合成的化合物。通过技术如定点诱变法，溶菌酶-相关肽可以具有与天然溶菌酶不同的氨基酸序列。

而且，例如，还优选的是，本发明的模拟卵的基材含有从目标害虫的卵提取的组分。由此，可以获得较高的卵运送效果。可以将来自卵的粗提取物包含在基材中，或可以将提纯的提取物包含在基材中。基材中的粗提取物或其提纯产物的含量可以根据多种因素，诸如待使用的β-葡萄糖苷酶、其盐、β-葡萄糖苷酶的生物学片段或β-葡萄糖苷酶-相关肽的种类、特征、和量，害虫的种类，以及期望效果的种类和程度而确定。本领域中已知的方法可以用作从卵提取和提纯有效成分的方法。

还可以在基材中包含甘油，以维持或稳定本发明的模拟卵中的β-葡萄糖苷酶、其盐、其生物学片段或β-葡萄糖苷酶-相关肽作为卵识别信息素的活性，并且将其保持在基材的表面上。为了同样的目的，纤维素酶、其盐、其生物学片段或纤维素酶-相关肽也可包含在基材中。用于本发明的纤维素酶、其盐、其生物学片段或纤维素酶-相关肽可以源自任何物种的生物体，或可以是合成的化合物。

纤维素酶的盐可以是与能够形成盐的各种物质的盐，例如，与有机酸的盐、与无机酸的盐、与有机碱的盐，或与无机碱的盐。而且，例如，构成纤维素酶的天冬酰胺酸或谷氨酰胺酸的β-或γ-羧基与金属如钠或钾可以形成盐。而且，例如，可以与构成纤维素酶的碱性氨基酸的侧链形成盐。在本发明中，纤维素酶的生物学片段或纤维素酶-相关肽可以具有盐的形式。纤维素酶的生物学片段是多肽或肽，其具有纤维素酶的部分氨基酸序列，并且具有与纤维素酶类似的活性和作用。纤维素酶-相关肽是蛋白、多肽或肽，其具有与纤维素酶类似的活性和作用，并且与纤维素酶和纤维素酶的生物学片段不同。纤维素酶-相关肽可以源自天然来源或可以是合成的化合物。通过技术如定点诱变法，纤维素酶-相关肽可以具有与天然纤维素酶不同的氨基酸序列。

高度提纯的甘油或纤维素酶不是必需使用的。基材中甘油或纤维素酶的含量可以根据多种因素，诸如待使用的β-葡萄糖苷酶的种类、特征、和量，害虫的种类，活性物质的种类或量，以及期望效果的种类或程度而确定。

在另一个方面中，本发明提供一种用于灭杀害虫的方法，所述方法包括对害虫提供本发明的模拟卵。通过本发明的方法灭杀或控制的害虫可以是任何害虫，条件是它具有卵运送本能并且将β-葡萄糖苷酶、其盐、其生物学片段或β-葡萄糖苷酶-相关肽识别为卵识别信息素。将本发明的模拟卵应用于白蚁，能够诱导卵运送和卵保护行为，并且使白蚁将模拟卵运送到其巢中的卵块中。其不仅使白蚁运送模拟卵到巢中的孵育室(breeding room)，还能够诱导护理行为如舔舐模拟卵的表面。通过使模拟卵含有活性成分如杀虫活性成分或生长抑制成分，可能极其有效地灭杀害虫。

对其优选应用本发明的灭杀方法的害虫是白蚁。在灭杀白蚁的情况下，可以将本发明的模拟卵放置在蚁路或巢材料的一部分上。通过钻在蚁路上钻孔，并且可以将本发明的模拟卵注射到孔中。还可以将本发明的模拟卵包封在保护膜如玻璃纸中，以便在野外保持耐久性。在此情况下，可以对保护膜添加摄取促进物质如木材提取液体或腐烂的木材提取液体。为了本发明的害虫灭杀方法使用监控站也是有效的。

由于通过使用本发明的模拟卵能够简单地诱导和观察昆虫的卵运送行为，本发明的模拟卵也适合作为生物学研究的工具，用于学习和研究昆虫的行为和信息素。因此，在又一个方面中，本发明提供一种用于生物学研究的工具，所述用于生物学研究的工具基本包含本发明的模拟卵。本发明的工具可以是本发明的模拟卵本身，所述模拟卵和测试必需的装置的组合，例如，测试试剂盒。使用本发明的工具，能够研究昆虫的行为和信息素，或能够研究昆虫的群居行为诸如卵运送行为或梳理行为(grooming behavior)。

将通过下列实施例更具体和详细地描述本发明，但是实施例仅用于示例，并且它们无意限制本发明。

实施例1

实施例1：制备模拟卵和验证β-葡萄糖苷酶的卵识别活性

通过使用黄胸散白蚁(Reticulitermes speratus)工蚁(工蚁白蚁)，研究白蚁卵提取物、β-葡萄糖苷酶、卵清溶菌酶、纤维素酶、卵清溶菌酶和纤维素酶的混合物、卵清溶菌酶和β-葡萄糖苷酶的混合物、卵清溶菌酶和β-葡萄糖苷酶和纤维素酶的混合物、以及作为对照的50％的甘油水溶液的卵识别活性。

各个测试样品制备如下。

将800μL的超纯水加入到在Eppendorf管中的400mg的黄胸散白蚁卵中，搅匀，并且进行超声处理5分钟，并且在15,000rpm进行离心30分钟。将上清液冻干，并且将5.0mg冻干的粉末溶解在100μL的30％的甘油水溶液中(白蚁卵提取物)。杏树来源的β-葡萄糖苷酶(产品#：G0395-5KU，批#：047K4037，SIGMA-ALDRICH(西格玛奥德里奇))(1.0mg)溶解在10μL的50％的甘油水溶液中(β-葡萄糖苷酶)。使用透析膜SnakeSkin(7000MWCO，产品#：68700，PIERCE)使鸡卵清溶菌酶(产品#：L7651-10G，批#：056K16901，SIGMA-ALDRICH(西格玛奥德里奇))脱盐，然后将2.0mg的脱盐的鸡卵清溶菌酶溶解在10μL的50％的甘油水溶液中(卵清溶菌酶)。绿色木霉(trichoderma viridae)来源的纤维素酶(产品#：C1794-5KU，批#：074K1304，SIGMA-ALDRICH(西格玛奥德里奇))(1.0mg)溶解在10μL的50％的甘油水溶液中(纤维素酶)。卵清溶菌酶(2.0mg)和1.0mg的纤维素酶溶解在10μL的50％的甘油水溶液中(卵清溶菌酶和纤维素酶的混合物溶液)。卵清溶菌酶(2.0mg)和1.0mg的β-葡萄糖苷酶溶解在10μL的50％的甘油水溶液中(卵清溶菌酶和β-葡萄糖苷酶的混合物)。卵清溶菌酶(2.0mg)、1.0mg的β-葡萄糖苷酶和1.0mg的纤维素酶溶解在10μL的50％的甘油水溶液中(卵清溶菌酶、β-葡萄糖苷酶和纤维素酶的混合物)。

将2.0μL各种测试样品添加到相等量的100个具有0.5mm的直径的玻璃珠，并且充分混合，由此，将测试样品涂敷在玻璃珠的表面上。将仅涂敷有50％的甘油水溶液的玻璃珠用作对照。

将10个白蚁卵和20个通过以上方法得到的模拟卵随机放置在直径为30mm的培养皿上，并且将10只黄胸散白蚁的工蚁白蚁(工蚁)放置于其中，并且容许培养血在25℃恒温室中静置。测试开始24小时和48小时后，研究模拟卵进入到卵块中的运送率(对于每一份测试样品，以相同的方法进行实验)。对于每一种测试重复8次实验。将运送率转化成反正弦根(arcsine root)，并且通过双侧T检验与对照进行统计学比较。工蚁白蚁将分散在培养皿上的卵聚拢以形成卵块，并且显示了保育行为。涂敷有测试样品中每一种的模拟卵进入到卵块中的运送率(24小时后)显示在图1中。模拟卵进入到卵块中的运送率(48小时后)显示在图2中。

由于β-葡萄糖苷酶的添加，卵识别活性显著增加了。经24小时和48小时的观察，与仅有溶菌酶和纤维素酶的实验(其中未添加β-葡萄糖苷酶)相比，添加了β-葡萄糖苷酶的实验显示了显著高的卵识别活性(P＜0.001，双侧T-检验)。特别地，含有β-葡萄糖苷酶、溶菌酶和纤维素酶的模拟卵显示了高运送活性。

工业适用性

本发明提供害虫，特别是白蚁的有效灭杀和控制，并且可应用于杀虫剂生产、害虫驱除工业、建筑工业和园艺工业领域。另外，本发明还可应用于生物学研究领域。