法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-01-02
授权
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2011-09-28
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20110112
实质审查的生效
2011-08-17
公开
公开
技术领域
本发明涉及蔬菜害虫的分子鉴定技术，特别是一种鉴定抗阿维菌素小菜蛾种群的方法。
背景技术
小菜蛾Plutella xylostella(L.)又名菜蛾，方块蛾，属鳞翅目(Lepidoptera)，菜蛾科(Plutellidae)，世界各地均有分布。在我国20世纪70年代以来逐渐上升为长江流域中、下游地区十字花科蔬菜的主要害虫。小菜蛾主要为害十字花科植物，目前，对其防治以农药防治为主，物理防治和生物防治为辅。而化学防治中又以阿维菌素的使用最为广泛，主要是由于阿维菌素良好的防治效果和较低的价格决定的。阿维菌素作为一种高效经济的防治小菜蛾的药剂已经在田间使用很长时间。长期大面积反复施用必然导致小菜蛾抗药性产生，目前全国各地均有报道，其中在云南，广东等南方省份尤为严重，小菜蛾对阿维菌素抗性已经达到上千倍。为了有效防治小菜蛾，鉴定小菜蛾种群是否对阿维菌素产生抗性以及抗性程度，对于采取防治措施是否恰当非常有意义，目前鉴定小菜蛾的抗性大多通过生物测定，即采集至少300头小菜蛾，设置5-6个梯度浓度的阿维菌素，然后观察记录小菜蛾的半致死剂量。该方法比较繁琐，需要捕捉相当大数量的小菜蛾才能进行测定。
有研究表明位于小菜蛾细胞膜上的GluClα亚基是阿维菌素的作用受体之一。GluClα亚基基因的全长序列已于2008年由本实验室的梁延坡硕士克隆并且已在GenBank上登录(登陆ID＝GQ221939.1)。GluClα亚基基因表达量与小菜蛾对阿维菌素的抗性之间的关系，以及如何利用GluClα亚基基因采用分子检测方法进行小菜蛾抗性群体的鉴定的研究，对于小菜蛾的防治及抗性种群研究具有实用价值和指导性。到目前，并未见到有有效应用GluClα亚基基因来检测抗阿维菌素小菜蛾种群的方法。
发明内容
本发明通过设计出特异性引物，运用分子生物学方法和实时荧光定量PCR方法鉴定小菜蛾种群对阿维菌素的抗性情况，仅仅需要几头待测小菜蛾即可完成鉴定，具有便捷，准确的优点。
一种鉴定抗阿维菌素小菜蛾种群的方法，步骤如下：
(1)随机捕捉5～15头待测种群的小菜蛾，分别制备每头小菜蛾的cDNA，即10个重复的待测样品；
(2)制备小菜蛾敏感种群的cDNA，即阴性对照样品；
(3)分别以待测样品、阴性对照样品为模板，进行荧光定量PCR反应；
(4)统计计算比较待测样品与阴性对照样品的荧光定量PCR反应产物产量是否具有显著差异；
其特征在于：所述荧光定量PCR采用的引物如下：
YG-S16：CGTCTACATCCGCATCTTCC，
YG-A16CAAGATCGTCAGTCGTCCAA。
所述小菜蛾敏感种群指对阿维菌素的半致死剂量为：0.05ug/ml以下。
所述小菜蛾敏感种群为福建敏感种群。
所述荧光PCR的反应体系如下：
cDNA 1.0ul；dNTP 2.0ul；rTaq酶0.2ul；10×Buffer 2.0ul；10uM的YG-S160.4ul；10uM的YG-A160.4ul；ddH2O至20ul；
PCR程序：95℃，5.0min；95℃0.5min，50-60℃0.5min，72℃1min，35循环；72℃10min，4℃停止。
本发明根据梁延坡在2009提交的GluClα亚基基因序列，设计了一序列GluClα亚基基因的特异性引物，并根据特异性引物对小菜蛾抗性与GluClα亚基基因表达量之间的关系进行研究，发现GluClα亚基基因表达量与小菜蛾对阿维菌素的抗性呈正相关。根据这一结果，发明人将选得的一对特异性引物F16结合荧光实时定量PCR技术及统计学方法提供一种坚定小菜蛾抗性种群的方法：测定小菜蛾的GluClα亚基基因表达量，并与与阴性对照的基因表达量比较是否具有显著差异，有显著差异说明待测小菜蛾为抗性种群，从而为进一步的防治手段及用药量提供指导和依据。由于本发明的方法的核心是采用分子生物学方法进行定量检测和统计，因此，在检测一个地区或一定区域的田间的小菜蛾是否为抗性种群时，仅仅需要捕捉少数几头做为检测的样品，每头为一个重复，用作荧光定量PCR的模板，不需要捕捉大量的小菜蛾用于进行阿维菌素致死剂量的测定以判断其是否为抗性种群。
本发明的方法，需要设阴性对照，即敏感种群小菜蛾作为模板的对照，其一般为在不接触任何药剂的环境下饲养5以上的小菜蛾后代，GluClα亚基基因表达量高于这类敏感种群且有显著差异的小菜蛾种群说明为阿维菌素选择压环境下的后代，对阿维菌素有抗性，需要调整用药量或者更换药物种类。根据本发明的方法，本领域普通技术人员可以采用任何符合这一要求的小菜蛾作为阴性对照。
附图说明
图1.总RNA电泳图。
图2.cDNA经Actin检测电泳结果。
图3.福建敏感种群四龄小菜蛾退火温度为50-60℃温度梯度下，F16引物PCR产物电泳结果
图4.福建敏感种群蛹期小菜蛾退火温度为50-60℃温度梯度下，F16引物PCR产物电泳结果
图5.使用同时设计的其它引物对小菜蛾cDNA进行PCR扩增的产物。
从左到右依次为：引物F14、F15、F17、F18和F19的电泳结果，每个引物4次重复。
图6.同时用其他小菜蛾种群的cDNA模板检测F16
海南(HN)种群和广州敏感(GM)种群小菜蛾使用F16和Actin引物PCR产物电泳结果，所得结果与福建敏感小菜蛾种群一致。
具体实施方式
1..材料与方法
11试验材料：福建敏感(FM)和福建抗性(FT)小菜蛾，均为本实验室饲养小菜蛾种群，其中福建抗性种群用阿维菌素持续汰选多代而得，福建敏感种群：用无药的甘蓝叶饲喂至少5年而得(其阿维菌素半致死剂量为0.05ug/ml以下)。
海南种群(HN)：海南种群小菜蛾为从海南田间采集而得。
广州敏感(GM)：广州敏感小菜蛾种群为本实验室长期饲养获得。
美国种群：从美国带回，在实验室用无药的甘蓝叶长期饲喂获得。
以上小菜蛾种群及其cDNA，本实验室均有保存，可向公众发放用于验证实验。
1.2试验基本情况。
首先根据已知的GluClα亚基基因序列设计小菜蛾特异性的荧光引物，然后提取福建敏感和抗性小菜蛾各龄期总RNA，反转录为cDNA，最后以所得的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，根据所得参数进行基因表达量分析。
1.3试验结果：所得数据用SPSS统计软件进行分析。
2.结果与分析
2.1福建抗性小菜蛾的抗性测定
由表1中可以看出，福建抗性小菜蛾相对于福建敏感的抗性倍数为180.51倍，抗性水平较高。
表1福建抗性小菜蛾种群同福建敏感小菜蛾种群对阿维菌素敏感性测定
2.2福建抗性和敏感小菜蛾总RNA的提取，反转录为cDNA
由图1、2中可知，所提取的小菜蛾总RNA包含18S和28SrRNA清晰条带。从cDNA经Actin检测的电泳图可知，反转录效果较好。可以作为下一步的试验模板。
2.3特异性荧光引物的设计
根据GluClα亚基基因序列(GenBank ID＝GQ221939.1)全长用Primer 5.0软件设计了19对引物。
19对引物如下：
按照如下参数和程序在PCR仪上验证了各对引物的特异性：
反应体系：cDNA 1.0ul；dNTP 2.0ul；rTaq酶0.2ul；10×Buffer 2.0ul；Primer-S(10uM)0.4ul；Primer-A(10uM)0.4ul；ddH2O至20ul。
反应程序：95℃，5.0min；95℃0.5min，50-60℃0.5min，72℃1min，35循环；72℃10min，4℃停止。
对所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，发现只有第16对荧光引物F16特异性最强，如图3，图4。
YG-S16 CGTCTACATCCGCATCTTCC
YG-A16 CAAGATCGTCAGTCGTCCAA
使用其他引物经过PCR所得产物进行电泳，其典型的表现为电泳条带不单一，弥散现象严重，见图5。
同时用海南(HN)种群和广州敏感(GM)小菜蛾种群的cDNA模板检测引物F16，所得结果与福建敏感小菜蛾种群一致，见图6。将以上PCR产物回收，然后用全式金生物试剂有限公司的连接转化试剂盒，将PCR回收产物连接到Peasy-T1Cloning Vector上，然后转入Top10细胞。将包含有目的片段的Top10细胞摇菌过夜培养，送往擎科生物公司进行测序。
测序结果如Seq ID No.1所示，将此片段序列在NCBI上比对，比对结果表明，测序所得片段与梁延坡在2009年所提交的GluClα亚基基因序列一致性为99％，表明所得片段是GluClα亚基基因的特异性片段。
2.4实时荧光定量PCR
分别以福建敏感种群和福建抗性种群四龄小菜蛾cDNA为模板，以F16为引物，用天根生物科技有限公司的RealMasterMix试剂，按照如下程序和参数：95℃，5.0min；95℃0.5min，50-60℃0.5min，72℃1min，40个循环；72℃10min，4℃停止。
在Real-Time PCR仪上进行实时荧光定量PCR.反应结束后，统计所得数据如下：
表2福建敏感种群和福建抗性种群四龄小菜蛾GluClα亚基基因的表达量差异
注：R为抗性种群，S为敏感种群，F16为荧光引物，Actin为内参引物，4为四龄幼虫，a，b为差异显著性标记，2-ΔΔCt为抗性种群目的基因的表达量相对于敏感种群的差异倍数。
由表2数据可知，福建抗性和福建敏感四龄小菜蛾GluClα亚基基因的相对表达量存在显著差异。目前实验室福建抗性种群的GluClα亚基基因表达量是福建敏感种群的7.473倍。
2.5测定各龄期小菜蛾GluClα亚基基因的表达量的差异。
用同样的方法测定福建抗性品系相对于福建敏感品系卵期，一龄，二龄，三龄小菜蛾GluClα亚基基因的表达量的差异。结果如表3：
表3福建敏感种群和福建抗性种群小菜蛾各龄期GluClα亚基基因的表达量差异
R为抗性种群，S为敏感种群，a，b为差异显记，2-ΔΔCt为抗性种群目的基因的表达量相对于敏感种群的差异倍数。
由表3中可以看出，福建抗性和福建敏感种群各龄期中除了第二个龄期无显著差异外，其它各龄期皆有显著差异，其中在四龄时差异达到最大值，为7.473倍。
2.5对F16引物鉴定阿维菌素抗性小菜蛾和敏感小菜蛾的验证
为了验证F16引物在用实时荧光定量PCR方法中鉴定小菜蛾抗阿维菌素品系的可靠性，我们采集了田间的小菜蛾四龄幼虫重复了以上的试验。田间采集地点分别是云南弥渡县，云南通海县，北京南口县，蔬菜所试验农场。
这些地方均多年且常年使用阿维菌素用来防治小菜蛾，且均有关于小菜蛾对阿维菌素不同程度抗性的报道，2010年以上四个田间种群对阿维菌素的抗性水平检测结果如表7。
表4各田间种群小菜蛾对阿维菌素的抗性水平监测(2010年)
由表4可知，云南弥渡县，云南通海县，北京南口县，蔬菜所试验农场小菜蛾种群相比于实验室饲养的福建敏感种群均表现较高水平的抗性，尤其是云南通海种群，其对阿维菌素的抗性倍数达到680倍。
分别提取云南弥渡县，云南通海县，北京南口县，蔬菜所试验农场四龄小菜蛾的RNA，然后反转录为cDNA，以所得cDNA为模板，运用实时荧光定量PCR的方法测定了各种群中GluClα亚基基因的相对表达量。其试验结果如表5所示：
表5各田间种群与福建敏感种群四龄小菜蛾GluClα亚基基因的相对表达量差异
R为抗性种群，S为福建敏感种群，a，b为差异显著性标记，Avg为平均值，SE为标准差，2-ΔΔCt为抗性种群目的基因的表达量相对于敏感种群的差异倍数。
由表5可知，各地所采集的四龄小菜蛾GluClα亚基基因的表达量与福建敏感之间均有显著差异，其中以北京南口县采集的四龄小菜蛾GluClα亚基基因的表达量跟实验室汰选的种群最为接近。以上结果也证明所得试验室数据与田间阿维菌素生物测定的结果一致。
此外，我们还用实验室饲养的其它不接触阿维菌素的小菜蛾实验室种群，比如抗BT美国小菜蛾种群，进行了以上试验。所得结果如表6：
表6美国种群与福建敏感种群四龄小菜蛾GluClα亚基基因的相对表达量差异
Avg为平均值，SE为标准差，a，b为差异显著性标记，2-ΔΔCt为抗性种群目的基因的表达量相对于敏感种群的差异倍数。
由表6可知，抗BT美国小菜蛾种群相对于福建敏感而言，其GluClα亚基基因的表达量更低，由此也可以推出抗BT美国小菜蛾实验室种群相比于福建敏感小菜蛾对阿维菌素更为敏感。这可能与抗BT美国小菜蛾种群更早的在实验室饲养，从而更早的与阿维菌素相隔离有关。
3.0结论
通过运用实时荧光定量PCR的方法对福建敏感和福建抗性的小菜蛾种群GluClα亚基基因进行相对定量试验，说明所设计F16引物实时荧光定量PCR中可以用来鉴定小菜蛾品系是否对阿维菌素存在抗性。并且通过对田间种群和实验室饲养抗BT美国小菜蛾种群的试验进一步验证了这种分子鉴定手段的可靠性。从而建立了一种快速高效的鉴定小菜蛾是否对阿维菌素存在抗性的分子手段。
机译： 产生IL-13的人类Tr1-细胞的数量;产生IL-13和IL-10的人类TR1克隆;鉴定和富集人类Tr1细胞群体的方法;产生IL-13的人类Tr1细胞的丰富种群;产生IL-13的人类Tr1-细胞的鉴定试剂盒种群;产生IL-13的人类Tr1细胞的数量，用于预防和/或治疗免疫反应;测定产生IL-13的人类Tr1-细胞群体的方法;产生IL-13的人Tr1-细胞的人口数量;产生IL-13增强免疫反应的人Tr1-细胞的分离种群
机译： 鉴定具有改善的产奶特性的牛的方法，鉴定牛的繁殖种群的方法，鉴定用于多次排卵和胚胎移植（moet）的牛的方法以及提高奶牛种群产奶量的方法
机译： 包含抗伊维菌素（22,23二羟基阿维菌素bia和22,23二羟基阿维菌素b1b）的混合物，用于抗绝对疫霉菌及其生产方法。
