虾白斑综合征病毒iel启动子主要顺式作用元件及与其结合的转录因子和应用

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例

1、材料与方法

1.1报告基因质粒构建及其缺失和突变分析

以WSSV病毒基因组DNA为模板，采用表1中的引物序列PCR方法对ie1基因启动子从5′和3′端进行一系列的缺失和突变分析，方法和策略见图1，突变体中基因调控元件的位置以ie1转录起始位点(+1)推算。通过一系列的5′和3′端缺失分析，利用不同引物序列组合，产生一系列5′、3′启动子缺失序列。为进行Sp1结合位点基序(TGTGGGCGGAGCA)和TATA盒 (GTGTATATAAGAGCC)的突变分析，用突变引物Mut1和Mut2进行PCR获得定点诱变的ie1启动子克隆，每个PCR产物用Kpn I和Hind III消化，克隆到phRG-B载体。

表1用于构建报告基因质粒的引物序列(酶切位点如下划线所示)

1.2细胞培养、转染和荧光素酶活性分析

昆虫细胞系Sf9(购自Invitrogen公司)用无血清培养基Sf-900IISFM(GIBCO)补加50μg/ml gentamycin于28℃培养。在96孔培养板中，当细胞长成80％单层时用于转染。转染使用0.1μg报告质粒DNA，采用Effectene转染试剂(Qiagen)进行，在转染后48h用Dual-Luciferase Reporter AssaySystem(Promega)检测荧光素酶活性，检测方法按试剂说明书进行，检测仪器为FB12 Luminometer(Berthold detection systems，USA)。检测数据来 自3次独立试验结果，样品一式3孔，并进行统计学分析。

1.3.IE1启动子12-bp基序结合蛋白的提纯及生物质谱鉴定

Sf9细胞核蛋白提取参照PIERCR公司试剂盒说明书进行，蛋白浓度测定采用Lowry方法。

首先，设计两条含有WSSV ie1启动子12-bp片段的5′端磷酸化的引物，序列如下：

5′-ATTCCTAGAAATGGTGTAATCGCATTCCTAGAAATGGTGTAATCGC-3′和

5′-GCGATTACACCATTTCTAGGAATGCGATTACACCATTTCTAGGAAT-3′；

由于两条引物具有部分互补序列，可以建立self-primed PCR方法，并扩增含有多拷贝12-bp基序的DNA。然后，将该DNA分子连接于磁性颗粒表面，制备一种提纯12-bp结合蛋白的基质，继而通过亲和层析的方法从Sf9细胞核蛋白中提取该12-bp DNA结合蛋白。SDS-PAGE电泳进一步分离该DNA亲和层析纯化的蛋白，用质谱兼容的银染方法染色，切下相应蛋白条带进行生物质谱分析(mass spectrometric analysis)，利用NCBI蛋白质数据库检索数据。

1.4克隆Sf-PHB2基因

通过下载不同物种的同源序列，利用在线的CODE-HOP软件在蛋白质的保守区设计简并引物：5′-TGCACTTCCGGATGccntggttyca-3′和5′-GCCCTCGGCCTGCaydatyttytg-3′(y代表C或T；n代表A或C或G或T)利用RT-PCR的方法从Sf9细胞中扩增该基因部分片段，以该段DNA序列作为种子序列在草地夜蛾EST数据库中寻找同源序列，然后进行电子拼接，再以拼接的序列为种子序列，重复上述过程，直至拼接出最长片段，最后用NCBI的ORF Finder软件分析可能的读码框，通过SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)软件进行结构预测。

1.5Sf-PHB2的抗体制备及其细胞定位

根据基因克隆的结果设计引物扩增Sf-PHB2基因的编码区，并把该序列克隆到原核表达载体PET30a，IPTG诱导表达并纯化Sf-PHB2蛋白，通过免疫小鼠，制备了该蛋白的多克隆抗体，通过Western blot检测该抗体的特异性。Sf9细胞用PBS洗两次然后用冷乙醇在4℃固定15分钟。细胞用PBS稀释300倍的抗体在37℃下孵育1小时。之后用PBS洗3次，用200倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG(Sigma，USA)37℃下孵育1小时。用DAPI(Invitrogen，USA)染细胞核，用PBS洗3次后用激光共聚焦显微镜观察PHB2在Sf9细胞中的定位(Leica TCS SP2)。

1.6凝胶阻滞实验(EMSA)证明Sf-PHB2与12-bp的DNA的相互作用

用以下含有12-bp DNA片段作为EMSA的探针，探针的序列如下，12-bp序列如下划线所示：5′-TTACACCATTTCTAGGAATAAATG-3′。

通过PIERCE公司的3′末端生物素标记试剂盒标记该段DNA片段，采用该公司的凝胶阻滞实验(EMSA)试剂盒进一步验证Sf-PHB2与该12-bp DNA的相互作用。EMSA的实验方案如下：20fmol生物素标记的寡核苷酸与10μg Sf9细胞核蛋白在结合缓冲液(50mM Tris，pH 7.4，2.5mM EDTA，0.25mg/mlpoly(dI/dC)，250mM NaCl，2.5mM DTT，5mM MgCl₂和20％甘油)中室温抚育20分钟，为了验证Sf-PHB2结合DNA序列的特异性，本试验通过2、5或10倍过量非标记的寡核苷酸(冷探针)来竞争。为了supershift分析，在核蛋白与生物素标记的探针中加入1.0或0.5μl的Sf-PHB2抗体共孵育。结合复合物点样到5％非变性胶，然后在0.5×TBE(0.44M Tris base，0.44M boric acid和0.01M EDTA[pH 8.0])中电泳，电泳后把胶转移至尼龙膜并用紫外交联，通 过Pierce公司化学发光核酸检测试剂盒显色。

2、实验结果

2.1ie1启动子上游调控元件的鉴定

WSSV ie1启动子序列分析表明，存在几个推测的转录因子结合位点可能对启动子活性起重要的作用(图1)。为了检测WSSV ie1在Sf9细胞中的启动子活性，用PCR方法扩增了ie1基因5′端388-bp序列(从-335至+53bp)并且克隆到荧光素酶报告基因表达载体phRG-B中。为了确定ie1启动子基础活性所必需的最小序列，本实验从其5′端产生一系列的缺失和突变(图1)。结果表明，包含推测的转录起始序列CAGT元件的最小表达载体p(-25/+53)能够保持最小的启动子活性(13倍)，另外加上TATA盒(p(-35/+53))导致启动子活性增加17.8倍。同时，突变TATA盒(p(-35/+53)Δ)，导致活性减少10.5倍。缺失ie1启动子的3′端同样证明(-25至+53)是维持启动子基本活性的最小序列。这表明CAGT元件是转录起始位点，它和TATA盒共同组成了ie1启动子的核心序列。从5′远端进行的截短突变产生两个突变体，一个是暂定AP-1/CRE位点的缺失突变产生突变体p(-235/+53)，另一个是缺失Myc位点的缺失突变产生突变体p(-135/+53)。用这两个质粒转染Sf9细胞后，其荧光素酶活性与野生型启动子比较无明显变化，表明ie1启动子5′端-335～-135bp序列不存在任何上游调控元件，与该启动子的活性无关。可是，接下来缺失80bp产生的突变体p(-55/+53)，其启动子活性却明显下降至原来的1/11；随后构建的Sp1结合位点定点诱变突变体p(-55/+53)Δ和缺失突变体p(-35/53)，其启动子活性分别下降至原来的1/2.6和1/2.8。上述结果表明，在ie1启动子上游存在的Sp1结合位点，是一个重要的上游调控元件；而位于-135～-55bp之间的80bp序列， 存在一个目前尚不能预测的转录因子结合位点，主要负责激活该启动子的转录活性，是主要的上游调控元件。为精确分析上述主要的上游调控元件，在p(-55/+53)和p(-135/+53)之间又构建了另外5个5′端缺失突变体，分别为p(-120/+53)、p(-105/+53)、p(-85/+53)、p(-78+53)和p(-66/+53)，结果见图1。对转染细胞的检测结果表明，突变体从p(-120/+53)到p(-78/+53)的逐步截短缺失，并不影响启动子活性，而从p(-78/+53)到p(-66/+53)的12bp截短，使启动子活性骤降至原来的1/14。这表明，ie1启动子的主要上游调控元件就存在于这12-bp序列之中，该元件是一个未知转录因子的结合位点。

2.2IE-1启动子主要顺式作用元件(12-bp基序)结合蛋白的提纯

首先合成含有12-bp基序的DNA引物，建立self-primed PCR方法，并扩增含有多拷贝12-bp基序的DNA。将该DNA分子连接于磁性颗粒表面，制备一种提纯12-bp结合蛋白的基质，继而通过亲和层析的方法从Sf9细胞核蛋白中纯化该12-bp DNA结合蛋白，SDS-PAGE分析的结果表明该蛋白大小约为32KDa(图2)。

2.3用生物质谱分析方法对该蛋白进行分子定性

从胶上切下蛋白条带并用胰酶消化，对消化的肽段进行质谱分析，获得了两段氨基酸序列(VPWFQYPIIYDIR和FNASQLITQR)，蛋白数据库搜索表明它与蚊子的Prohibitin 2(PHB2)蛋白(GenBank登录号：XM_001842599)是同源物，由此证明本亲和层析纯化获得的12-bp DNA序列结合蛋白是PHB2同源蛋白。目前关于PHB2的功能研究主要在哺乳动物中进行，还没有PHB2作为转录因子直接结合DNA的报道。

通过软件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)对蚊子、家蚕、 虾等无脊椎动物PHB2蛋白的结构分析发现，它具有螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix，HTH)结构域，但这种HTH结构域在有脊椎动物的PHB2蛋白并不存在。HTH是转录因子DNA结合结构域的典型特征，这提示在无脊椎动物中，它可能作为转录因子发挥作用。根据质谱分析搜索得到的是蚊子的PHB2氨基酸序列(图3)，GenBank中至今尚没有昆虫Sf9细胞PHB2蛋白的基因序列，这就需要从Sf9细胞克隆该基因序列。

2.4从Sf9细胞中克隆PHB2基因

通过CODEHOP软件设计了一对引物，通过RT-PCR的方法从Sf9细胞中扩增到了一段490bp的DNA序列。为了获得全长的cDNA，本试验用这490bp序列为模板，搜索草地夜蛾EST数据库，获得了几段EST序列(DY897934，DY793476，DV076437和DY784502)。根据这些序列拼接出了一条完整序列，通过软件预测读码框，对其编码的氨基酸进行BLAST分析，证明所得到的基因为PHB2同源物，被命名为sf-phb2。该基因编码299个氨基酸，分子量约为32KDa，通过结构预测同样发现Sf-PHB2蛋白也具有HTH结构域。质谱分析所得到的两段序列存在于所克隆基因编码的氨基酸序列之中(图5)。

2.5Sf-PHB2的抗体制备及其在Sf9细胞中的分布

本发明对Sf-PHB2进行结构预测分析发现它含有核定位信号。为证实该蛋白在细胞核中的存在，本实验通过原核表达Sf-PHB2蛋白，提纯后免疫小鼠，制备该蛋白的多克隆抗体，通过免疫荧光检测该蛋白在Sf9细胞中的表达情况。如图5所示，Sf-PHB2在Sf9细胞中主要表达在细胞质，少部分表达在细胞核。而用免疫前血清没有检测出免疫荧光信号。

2.6凝胶阻滞试验验证Sf-PHB2与WSSV ie1启动子12-bp DNA序列的结合

Sf-PHB2与12-bp序列结合的特异性通过EMSA来验证(图6)。当只加入Sf9细胞核蛋白时可检测到一条蛋白-DNA复合物条带(泳道5)；当加入不同剂量过量的非标记的冷探针时，该复合物条带变弱(泳道2，3和4)；而加入非标记的EBNA探针，条带强弱几乎没有改变(泳道6)；当加入1.0μl或0.5μl Sf-PHB2抗体进行Supershift分析，发现蛋白质-DNA复合物条带在加入抗体后出现了迁移(泳道7和8)，而加入同量免疫前血清几乎没有影响，表明抗体影响迁移是因为Sf-PHB与12-bp DNA形成复合物的缘故。这些结果表明，Sf-PHB2特异结合到WSSV ie1启动子的78到67核苷酸处(图6)。