一种甲型H1N1流感疫苗及其应用

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

0.0067M、pH值为7.0的1×磷酸盐缓冲液(PBS)购买自Thermo公司(货号：SH30256.01B)

实施例1、甲型H1N1流感疫苗的制备

甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白HA(H1N1HA蛋白)购买自北京义翘神州生物技术有限公司(Sino Biological Inc.，货号：11055-V08H2)，其氨基酸序列为序列表中的序列1，其核苷酸序列为序列表中的序列2；

化合物C48/80购买自Sigma公司(货号：C2313)。

每15μl甲型H1N1流感疫苗1按照如下方法制备：将1ug甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白HA、10ug C48/80与浓度为0.0067M、pH值为7.0的PBS缓冲溶液混合，用PBS补至15μl，得到甲型H1N1流感疫苗1；

每15μl甲型H1N1流感疫苗2按照如下方法制备：将3ug甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白HA、10ug C48/80与浓度为0.0067M、pH值为7.0的PBS缓冲溶液混合，用PBS补至15μl，得到甲型H1N1流感疫苗2；

每15μl甲型H1N1流感疫苗3按照如下方法制备：将9ug甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白HA、10ug C48/80与浓度为0.0067M、pH值为7.0的PBS缓冲溶液混合，用PBS补至15μl，得到甲型H1N1流感疫苗3。

实施例2、甲型H1N1流感疫苗的功能鉴定

一、甲型H1N1流感疫苗免疫实验1

1、免疫

将4周龄SPF级Balb/c小鼠(每只小鼠的重量为16g左右)分为如下6组，每组4只，采用如下方式滴鼻免疫；

第A组(PBS组/阴性对照组)：将15ul浓度为0.0067M、pH值为7.0的PBS缓冲溶液滴鼻免疫；

第B组(无佐剂组)：将9μg H1N1HA蛋白溶于浓度为0.0067M、pH值为7.0的PBS缓冲溶液中，并用PBS缓冲溶液补至15ul，得到混合液进行滴鼻免疫；

第C组(HA蛋白低剂量组)：将15ul由实施例1得到的甲型H1N1流感疫苗1进行滴鼻免疫；

第D组(HA蛋白中剂量组)：将15ul由实施例1得到的甲型H1N1流感疫苗2进行滴鼻免疫；

第E组(HA蛋白高剂量组)：将15ul由实施例1得到的甲型H1N1流感疫苗3进行滴鼻免疫；

第F组(CT佐剂组/阳性对照组)：将9μg H1N1HA蛋白、0.1μg霍乱毒素CT(Sigma公司，货号：C8025)与浓度为0.0067M、pH值为7.0的PBS缓冲溶液中，并用PBS缓冲溶液补至15ul，得到混合液进行滴鼻免疫；

以上6组均在第0(从第一次免疫开始记作第0天)，7，14天进行3次免疫；免疫体积：15μl/只，7.5μl/鼻孔。

2、检测

1)血清中H1N1HA特异性抗体检测

将以上6组小鼠在免疫后第21天采集小鼠的血液，并分离血清。

将各组小鼠的血清进行Elisa检测，用以确认小鼠血清中是否有H1N1HA特异性结合抗体的存在。

Elisa具体实验方法如下：

1，将H1N1HA蛋白以1μg/ml的浓度包被96孔Elisa板，包被体积为100μl/孔，包被时间为4℃过夜(12h)。2，包被好的Elisa板用0.05％PBST(2L PBS溶液中加入1ml吐温，使吐温终浓度达到0.05％)溶液洗涤3次，甩干。3，0.05％PBST溶液中加入牛血清(FBS，购自Gibco，货号10099141)使FBS终浓度达到10％。用含10％FBS的PBST溶液封闭Elisa板，200μl每孔，37℃封闭2小时。4，重复步骤2中的洗涤。将各小鼠血清做2倍系列稀释，并100μl/孔加入洗涤后的Elisa板中，起始稀释比例为1∶100，37℃孵育1小时。5，重复步骤2中的洗涤，加入1∶2500稀释的辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(Promega，货号：W402B)，100μl/孔，37℃孵育1小时。6，重复步骤2中的洗涤，加入显色液TMB(100μl/孔)，避光显色5分钟。7，加入1M硫酸水溶液(50μl/孔)，终止显色，OD450nm读取吸光度值。

实验重复三次，结果取平均值。

结果如图1所示：

第A(PBS)、B(HA)、C(1ugHA)、D(3ugHA)、E(9ugHA)、F(CT)组的小鼠的血液IgG抗体几何平均滴度为5、53、3200、6400、128000、107634；

可以看出，第E组小鼠血清特异性IgG抗体几何平均滴度达到128000，与阳性对照(第F组，CT组)几何平均滴度107634相近。第E组免疫了甲型H1N1流感疫苗3的小鼠，其血清特异性抗体几何平均滴度128000比免疫了甲型H1N1流感疫苗1(第C组)和免疫了甲型H1N1流感疫苗2(第D组)的要高很多，后两者的特异性抗体几何平均滴度分别为3200和6400。所以，选择免疫了甲型H1N1流感疫苗3做为疫苗最优配方，并进行后续的评价和攻毒实验。

2)疫苗安全性检测

由于C48/80佐剂是肥大细胞活化剂，需要对其潜在致过敏的可能性进行评价。为测试其安全性，检测了上述6组小鼠免疫21天时血清中总IgE的含量及特异性IgE的含量。

血清总IgE及特异性IgE检测方法：

血清总IgE的检测使用的是小鼠IgE的Elisa检测试剂盒(购自BD公司，货号：555248)，具体实验步骤按说明书进行。

血清特异性IgE检测方法同血清总IgE的检测方法，但包被Elisa板的蛋白为1μg/ml的H1N1HA蛋白，包被体积为100μl。

实验重复三次，结果取平均值。

结果如表1所示，

表1、血清中总IgE浓度

B组小鼠血清中总IgE含量约为76.36ng/ml、E组小鼠血清中总IgE含量约为83.99ng/ml，即免疫了HA9μg+c48/8010μg组与单独免疫了HA蛋白组血清中总IgE含量并未见显著差异。同时，各组小鼠血清中均未检测到H1N1HA特异性IgE的存在。从以上结果中可以看到，并未发现该佐剂配伍的甲流疫苗在小鼠体内具有致敏效果。

二、甲型H1N1流感疫苗免疫实验2

1、免疫

将4周龄SPF级Balb/c小鼠(每只小鼠的重量为16g左右)分为如下4组，每组20只。免疫第21天，对各组小鼠攻毒。每组中10只小鼠用作存活率的观察，另外10只用作体重指标的监测。免疫各组的疫苗配方和剂量如下，免疫方式为滴鼻免疫：

第一组(PBS组/阴性对照组)：将15ul浓度为0.0067M、pH值为7.0的PBS缓冲溶液滴鼻免疫；

第二组(无佐剂组)：将10μg H1N1HA蛋白溶于浓度为0.0067M、pH值为7.0的PBS缓冲溶液中，并用PBS缓冲溶液补至15ul，得到混合液进行滴鼻免疫；

第三组(HA蛋白高剂量组)：将15ul由实施例1得到的甲型H1N1流感疫苗3进行滴鼻免疫；

第四组(CT佐剂组/阳性对照组)：将9μg H1N1HA蛋白、0.1μg霍乱毒素CT(Sigma公司，货号：C8025)与浓度为0.0067M、pH值为7.0的PBS缓冲溶液中，并用PBS缓冲溶液补至15ul，得到混合液进行滴鼻免疫；

以上4组均在第0(从第一次免疫开始记作第0天)，7，14天进行3次免疫；免疫体积：15μl/只，7.5μl/鼻孔。

2、检测

1)血清及盥洗液中H1N1HA特异性抗体检测

将以上4组小鼠在免疫后第21天采集小鼠的血液，粪便，阴道盥洗液，肺盥洗液，鼻腔盥洗液。

将各组小鼠的血清、盥洗液及粪便进行Elisa检测(血清特异性IgG检测方法同前；粪便及盥洗液中的特异性IgA的检测方法与特异性IgG的检测方法相同，但使用的二抗为HRP标记的羊抗鼠IgA二抗，购自Santa Cruz公司，货号sc-3791)，实验重复三次，结果取平均值。

第一、二、三、四组的小鼠的血液IgG抗体几何平均滴度为4、49、90510、137187。

第一、二、三、四组的小鼠的阴道盥洗液IgA抗体几何平均滴度为1、1、43、98；

第一、二、三、四组的小鼠的新鲜粪便IgA抗体几何平均滴度为1、1、7、12；

第一、二、三、四组的小鼠的肺盥洗液IgA抗体几何平均滴度为1、1、11、11；

第一、二、三、四组的小鼠的鼻腔盥洗液IgA抗体几何平均滴度为1、1、11、32；

将上述部分结果作图如图2所示：其中A为第21天小鼠血清中抗H1N1HA特异性IgG抗体的几何平均滴度；B为第21天小鼠阴道盥洗液中抗H1N1HA特异性IgA抗体的几何平均滴度；C为第21天小鼠粪便中抗H1N1HA特异性IgA抗体的几何平均滴度；D为第21天小鼠肺盥洗液中抗H1N1HA特异性IgA抗体的几何平均滴度；E为第21天小鼠鼻腔盥洗液中抗H1N1HA特异性IgA抗体的几何平均滴度。PBS(第一组)、HA(第二组)、C48/80(第三组)、CT(第四组)；

由A可以看出，第21天C48/80组(第三组)小鼠的血清中产生了抗H1N1HA特异性IgG抗体，此结果与免疫实验1的结果相当，再次证明了该疫苗的免疫效果。同时，小鼠的粪便、阴道盥洗液及肺和鼻腔洗液中也都检测到了特异性IgA的存在(B-E)。这些结果说明，免疫21天，小鼠不但能够在血清中产生抗H1N1HA特异性IgG抗体，小鼠肠道、阴道及呼吸系统粘膜表面也产生了具有能与H1N1HA蛋白结合的IgA抗体。

2)中和活性抗体检测

将免疫实验2免疫21天收集的4组小鼠血清，进行微量中和实验，具体实验方法如下：

1，实验前一天，将MDCK细胞(ATCC公司，货号CRL-2935^TM)以1.5×10⁴/孔的密度接种96孔细胞培养板，37℃培养过夜。2，所有待测小鼠血清56℃灭活，45分。3，所有待测小鼠血清做系列2倍稀释，起始稀释浓度为1∶5，将稀释好的各浓度血清100μl与100μl 100个TCID₅₀的甲流活病毒A/California/04/2009株分别混合，37℃孵育2小时。4，将孵育好的血清-病毒混合液转移至准备好的长有MDCK细胞的96孔细胞培养板中。5，37℃培养3天后，观察每孔的细胞病变效应(CPE)。

实验重复三次，结果取平均值。

第一、二、三、四组的小鼠的血清中和抗体几何平均滴度为＜10、10、607、1062；

作图如图3所示，PBS为第一组、HA为第二组、C48/80为第三组、CT为第四组；从图3中可以看出，免疫21天，C48/80(第三组)小鼠血清的中和抗体几何平均滴度达到了607，接近CT组(第四组)的1062。

3)攻毒实验

对免疫实验2的4组免疫过的小鼠均在第21天时攻毒1×10⁶TCID₅₀甲流活病毒A/California/04/2009株(Bao L，Xu L，Zhan L，Deng W，Zhu H，et al.(2010)Challenge and polymorphism analysis of the novel A(H1N1)influenza virus to normal animals.Virus Res 151：60-65，公众可从中国医学科学院病原生物学研究所和清华大学获得。)，具体攻毒实验方法按照如下文章中记载的进行：Xu L，Bao L，Lv Q，Deng W，Ma Y，et al.(2010)A single-amino-acid substitution in the HA protein changes the replication and pathogenicity of the 2009 pandemic A(H1N1)influenza viruses in vitro and in vivo.Virol J 7：325。简言之，小鼠免疫第21天时，将1x10⁶TCID₅₀的甲流活病毒A/California/04/2009株50μl，以滴鼻的方式攻击小鼠，在为期14天的时间内，检测小鼠的存活率和体重变化情况。

结果如下：

第一、二、三、四组小鼠攻毒14天后，小鼠的存活率分别为0、0、90％、100％；

第一、二、三、四组小鼠攻毒7天后，小鼠的体重分别降到了原始体重的75％、69％、84％、89％；当攻毒14天后，第一、二组小鼠全部死亡，而第三、四小组存活下来的小鼠体重有所恢复，体重分别为原始体重的89％、94％。

将上述结果作图。如图4所示，A为存活率，B为体重变化百分比，表示的是小鼠攻毒后体重占攻毒前(即免疫21天时)体重的百分率。PBS(第一组)、HA(第二组)、C48/80(第三组)、CT(第四组)；

从图中看出，攻毒后，C48/80(第三组)小鼠在第14天的存活率达90％。攻毒后7天，小鼠体重开始恢复。

4)C48/80佐剂引发Th1/Th2平衡型免疫反应

血清中IgG的亚类，通常与CD4+T细胞活化相关。IgG1与Th2类免疫反应相关，IgG2a则与Th1类免疫反应相关。

血清特异性IgG亚类的Elisa检测方法同前，但使用的二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3二抗，均购自Santa Cruz公司，货号分别为sc-2060、sc-2061、sc-2062、sc-2063。

结果如图5所示，免疫21天时，小鼠血清中各IgG亚类几何平均滴度如下：

HA(第二组)IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3的H1N1HA特异性抗体几何平均滴度为13、2、4、1；

c48/80(第三组)IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3的H1N1HA特异性抗体几何平均滴度为为48503、696、5572、20；

CT(第四组)IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3的H1N1HA特异性抗体几何平均滴度为为36758、541、13929、184；

表明，C48/80佐剂引发的免疫反应与CT佐剂类似，引发了Th1/Th2平衡型免疫反应。

5)脾细胞刺激实验

脾细胞刺激实验的具体方法如下：

小鼠免疫21天时，无菌条件下取脾，分离小鼠脾淋巴细胞。用RPMI1640培养基制备脾淋巴细胞单细胞悬液(培养基中含有10％的FBS)，将悬液转移至48孔细胞培养板中，使细胞达到2.5×10⁶个/孔。随后，每孔中加入H1N1HA蛋白，使每孔中蛋白终浓度达到5μg/ml。37℃培养72小时后，取每孔上清液，离心去除残余细胞，用购买自BD公司(货号：560485)的小鼠Th1/Th2/Th17细胞因子检测试剂盒检测上清液中IL-2、IL-4、IL-6、IFN γ、TNF、IL-17、IL-10细胞因子的含量。

结果如表2所示，产生的细胞因子IL-2与Th1类反应相关，产生的细胞因子IL-6和IL-10与Th2类反应相关。

说明，C48/80组(第三组)小鼠IL-2、6、10与对照组相比均有显著升高，进一步表明该佐剂引发Th1/Th2平衡型免疫反应。

表2、免疫第21天小鼠脾细胞在HA蛋白刺激下细胞因子产生情况。(n＝3只/组)