口蹄疫病毒抗原多肽、融合抗原多肽及疫苗

技术领域

本发明涉及口蹄疫病毒抗原多肽，融合抗原多肽，以及含有上述抗原多肽和/或融合抗原多肽的口蹄疫病毒疫苗。本发明还涉及上述抗原多肽，融合抗原多肽和疫苗的制备及其应用。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒所引起的一种急性、热性、高度接触性传染的动物传染病。口蹄疫主要侵害偶蹄类动物，其临床诊断特征为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。成年动物感染口蹄疫后一般致死率不高但其发病率可达100％，发病动物的口、蹄部会出现大量水疱，精神沉郁，进而使得畜产量锐减。幼畜感染口蹄疫后则经常会不见症状地猝死，严重时致死率可达100％。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，因此每次爆发后只能屠宰和集体焚毁染病牲畜以绝后患，从而给畜牧产业造成巨大的经济损失。

口蹄疫病毒是口蹄疫的致病原，其属于细小核糖核酸病毒，具有多血清型、高变异性等特点。已知口蹄疫病毒目前有O、A、C、SAT1(南非I型)、SAT2(南非II型)、SAT3(南非III型)和Asial(亚洲I型)7个主要血清型。每种主型又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种。口蹄疫病毒各型之间的抗原性常常不同，彼此之间不能交互免疫，而且在同一种血清型中抗原变异的程度也很大，以至于能够有效地抵抗一种亚型的口蹄疫疫苗可能对同一血清型中的另一种亚型却没有保护。

因为口蹄疫病毒的高异变性和各血清型之间通常不能相互免疫，所以给口蹄疫的防治工作带来巨大的困难。目前仍迫切需要提供对口蹄疫病毒具有良好免疫原性的疫苗，理想的疫苗还应对多种不同亚型的口蹄疫病毒都具有良好的免疫原性，从而可以为牲畜提供广泛的免疫保护。

发明内容

本发明涉及口蹄疫病毒抗原多肽，融合抗原多肽，以及含有上述抗原多肽和/或融合抗原多肽的口蹄疫病毒疫苗，该抗原多肽，融合抗原多肽和疫苗可使宿主动物产生针对多种不同谱系口蹄疫病毒的免疫原性，从而为宿主动物提供针对多种不同谱系口蹄疫病毒的免疫保护。

就本发明而言，术语“免疫”是指，以适宜的形式和通过适宜的途径对宿主动物给与某一抗原后，诱导宿主动物产生针对该抗原的特异性的细胞介导的和/或基于抗体的免疫应答，例如，抗体和/或细胞因子的产生和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突细胞的活化，和/或其它细胞应答反应。

就本发明而言，术语“免疫原性”是指一种或多种抗原诱导宿主动物产生针对该一种或多种抗原的特异性的免疫反应的能力。

就本发明而言，术语“抗原多肽”是指由两个或两个以上氨基酸通过肽键共价连接形成的具有免疫原性的肽链结构。本发明的肽链结构可以是直链的，带分支结构的，和/或带环状结构的。

就本发明而言，术语“疫苗”是指含有一种或多种具有免疫原性的抗原并被配制成能向宿主动物给药形式的制剂。将疫苗引入到宿主动物体内后，该疫苗就能激发宿主动物产生针对该一种或多种抗原的免疫反应。

就本发明而言，术语“宿主动物”是指能够被口蹄疫病毒侵入并允许口蹄疫病毒在其体内复制的动物。在某些实施方式中，宿主动物是偶蹄动物。在某些实施方式中，宿主动物是猪、牛、羊等家畜动物。口蹄疫病毒在宿主动物中的侵入和复制可能使宿主动物产生口蹄疫的临床特征，也可能不使宿主动物产生任何临床特征。

本发明提供了一类人工合成的口蹄疫病毒抗原多肽。根据本发明的一个方面，本发明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列：

Cys Lys Tyr Ala Gly X1 Ser Leu X2 Asn Val Arg Gly Asp Leu X3 X4 Leu X5 Gln Lys Ala Ala Arg X6 Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr X7 Ala Ile Lys(SEQ ID NO：1)，其中，X1＝Gly或Ala，X2＝Thr，Leu或Pro，X3＝Gln或Leu，X4＝Val，Glu或Ala，X5＝Ala或Asp，X6＝Pro或Cys，X7＝Gly或Cys，且X6和X7必须有一个且只能有一个取Cys。

根据本发明的另一个方面，本发明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列：

Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly X1 Ser Leu X2 Asn Val Arg Gly Asp Leu X3 X4Leu X5 Gln Lys Ala Ala Arg X6 Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr X7 Ala Ile Lys(SEQ ID NO：2)，其中，X1＝Gly或Ala，X2＝Thr，Leu或Pro，X3＝Gln或Leu，X4＝Val，Glu或Ala，X5＝Ala或Asp，X6＝Pro或Cys，X7＝Gly或Cys，且X6和X7必须有一个且只能有一个取Cys。

根据本发明的另一个方面，本发明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列：

Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly X1 Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu X2 X3Leu X4 Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys(SEQ ID NO：3)，其中，X1＝Gly或Ala，X2＝Gln或Leu，X3＝Val，Glu或Ala，X4＝Ala或Asp。

根据本发明的另一个方面，本发明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列：

Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys

根据本发明的另一个方面，本发明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列：

Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys(SEQ ID NO：5)。

根据本发明的另一个方面，本发明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列：

Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys Ala Ile Lys(SEQ ID NO：6)。

根据本发明的另一个方面，本发明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列：

Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys Ala Ile Lys(SEQ ID NO：7)。

本发明的抗原多肽包含上述氨基酸序列在一个或多个氨基酸位点进行一个或多个氨基酸的替换、添加和/或删除所产生的序列。氨基酸替换包括保守替换和非保守替换。保守替换是指性质相似的氨基酸之间的替换，例如极性氨基酸之间的替换(如谷氨酰胺和天冬酰胺之间的替换)，疏水性氨基酸之间的替换(如亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和缬氨酸之间的替换)，以及带相同电荷的氨基酸之间的替换(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸之间的替换，或者谷氨酸和天冬氨酸之间的替换)等。非保守替换是指不同性质的氨基酸之间的替换，本发明所包含的非保守替换将不会改变所述抗原多肽针对口蹄疫病毒的特异性免疫原性和活性。本发明所述的氨基酸的替换、添加和/或删除将不超过1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一类包含两个或更多个本发明的抗原多肽的融合抗原多肽。融合抗原多肽所包含的多个抗原多肽彼此之间共价或非共价连接。共价连接例如可以是通过酯键、醚键、磷酸酯键、酰胺键、肽键、二酰亚胺键、碳-硫键，或者碳-磷键相互连接。非共价连接例如可以是通过离子间的相互作用力、疏水作用，或者氢键相互连接。

在本发明的一个实施方式中，融合抗原多肽所含的多个抗原多肽通过连接链连接。就本发明而言，术语“连接链”是指，用于共价或非共价连接相邻的两个多肽序列的结构单元，该结构单元的引入不会对融合抗原多肽的免疫原性产生损害。连接链可包括一个或多个氨基酸残基，连接链还可以包括例如C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、芳基或杂芳基等结构。现有技术披露了一些已知的连接链，本领域技术人员可以根据需要容易地加以选择。

在本发明的另一个实施方式中，融合抗原多肽中所用的连接链由一个或多个赖氨酸，丙氨酸，甘氨酸，丝氨酸和/或脯氨酸或其任意组合组成。例如连接链由1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个或更多个前述氨基酸或其任意组合组成。在本发明的另一个实施方式中，融合抗原多肽中所用的连接链为由一个或多个赖氨酸组成的短肽，例如短肽序列Lys Lys，Lys Lys Lys，Lys Lys Lys Lys，Lys Lys Lys Lys Lys，Lys Lys Lys Lys Lys Lys。在本发明的另一个实施方式中，融合抗原多肽中所用的连接链为由一个或多个赖氨酸和丙氨酸混合组成的短肽，例如Lys Ala Lys，Ala Lys Ala，Lys Ala Ala Lys，Ala Lys Lys Ala，Lys Lys Ala Lys，Ala Lys Ala Lys，Lys Lys Ala Lys Lys或者Lys Ala Lys Lys Ala Lys。在本发明的另一个实施方式中，融合抗原多肽中所用的连接链为由一个或多个脯氨酸，和/或丝氨酸和/或甘氨酸混合组成的多肽，例如Pro Ser Pro，Ser Pro Ser，Ser Ser Pro，Pro Pro Ser，Gly Ser Gly，Ser Gly Ser，Ser Ser Gly Ser，Gly Gly Ser Gly，Gly Ser Gly Ser，Gly Ser Gly Ser Ser，Gly Gly Gly Gly Ser。

融合抗原多肽所包含的抗原多肽数量例如可以是2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个或者更多个。融合抗原多肽所包含的抗原多肽可以是相同的也可以是不相同的。例如，融合抗原多肽包含两个SEQ ID NO.1所示的抗原多肽，或者包含两个SEQ ID NO.2所示的抗原多肽，亦或者包含一个SEQ ID NO.1所示的抗原多肽和一个SEQ ID NO.2所示的抗原多肽。

融合抗原多肽包含的抗原多肽可以是天然的口蹄疫病毒抗原多肽序列，也可以是人工合成的口蹄疫病毒抗原多肽。在本发明的一个实施方式中，融合抗原多肽包含一个或多个本发明提供的抗原多肽序列和一个或多个天然抗原多肽序列。例如，融合抗原多肽包含一段本发明提供的抗原多肽序列和一段天然抗原多肽序列。又例如，融合抗原多肽包含至少一段本发明提供的抗原多肽序列和至少一段天然的抗原多肽序列。

在本发明的另一个实施方式中，本发明的融合抗原多肽包含口蹄疫病毒表面壳蛋白VP1的全部或部分氨基酸序列。已知的O型口蹄疫病毒的壳蛋白VP1的一种天然氨基酸序列含有213个氨基酸，其氨基酸序列如下：

Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Glu Ser Tyr Val Gly Gln Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Ser Ile Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Pro His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val His Pro Ser Ala Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Ser Leu(GenBank No.：ADH32342.1)(SEQ ID NO：8)。

在本发明的另一个实施方式中，本发明的融合抗原多肽包含如下所示的一种或多种天然抗原多肽序列：

Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys(SEQ ID NO：9)；

Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys(SEQ ID NO：10)。

在本发明的另一个方面，本发明提供了一类包含本发明的抗原多肽和T辅助细胞表位的融合抗原多肽。融合抗原多肽所包含的抗原多肽和T辅助细胞表位可以分别是一个或多个，例如融合抗原多肽分别包含1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个或更多个抗原多肽和T辅助细胞表位。融合抗原多肽所包含的抗原多肽可以是相同的也可以是不相同的，所包含的T辅助细胞表位可以是相同的也可以是不相同的。相邻的抗原多肽和T辅助细胞表位之间、相邻的抗原多肽之间或者相邻的T辅助细胞表位之间可以通过其自身氨基酸形成的肽键连接，亦或通过本发明前述部分提到的其它任意方式相连接，例如通过连接链连接抗原多肽和T辅助细胞表位。

此类融合抗原多肽的非限定性实例例如是：

Ile Ser Ile Glu Ser Ile Gly Lys Val Ile Val Lys His Ile Glu Gly Ile Phe Leu Leu Lys Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys TyrAla Gly Gly Ser Leu ThrAsn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys(SEQ ID NO.11)，和

Ile Ser Ile Glu Ser Ile Gly Lys Val Ile Val Lys His Ile Glu Gly Ile Phe Leu Leu Lys Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys Ala Ile Lys(SEQ ID NO.12)。

此处述及的T辅助细胞表位是指一抗原上供T辅助细胞识别的氨基酸序列。T辅助细胞是指一类特定的T细胞，其作用是辅助T杀伤细胞从而使T杀伤细胞与目标抗原或细胞结合而消灭或杀死该目标抗原或细胞。现有技术披露了一些已知的T辅助细胞表位，本领域技术人员在了解此目的的基础上可以根据其掌握的技术常识选择合适的T辅助细胞表位并用在本发明的融合抗原多肽中。T辅助细胞表位的实例包括但不限于，乙肝病毒表面和核心抗原T辅助细胞表位、百日咳毒素T辅助细胞表位、破伤风毒素T辅助细胞表位、麻疹病毒F蛋白T辅助细胞表位、沙眼衣原体主要外膜蛋白T辅助细胞表位、白喉毒素T辅助细胞表位、镰状疟原虫环孢子体T辅助细胞表位、曼森氏吸虫三糖磷酸盐异构酶T辅助细胞表位，及大肠杆菌TraT T辅助细胞表位。

美国专利第U.S.7,744,898号(申请日为2005年9月8日，发明名称为“Peptides for Inducing Cytotoxic T Lymphocyte Responses to Hepatitis B Virus”)，以及美国专利第U.S.7,833,532号(其申请日为2003年8月12日，发明名称为“Immunogenic Lipopeptides Comprising T-helper and Cytotoxic T Lymphocyte(CTL)Epitopes)中介绍了多种T辅助细胞表位。例如，U.S.7,744,898说明书列出了其中SEQ ID NOs.6-9所示的T辅助细胞表位。又例如，U.S.7,833,532说明书中列出了其中SEQ ID NOs.1，14-52所述的T辅助细胞表位。U.S.7,744,898和U.S.7,833,532在此通过引用方式全文并入到本申请中用作参考。

在本发明的另一个方面，本发明提供了一类包含本发明的抗原多肽和免疫刺激序列的融合抗原多肽。融合抗原多肽所包含的抗原多肽和免疫刺激序列可以分别是一个或多个，例如融合抗原多肽分别包含1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个或更多个抗原多肽和免疫刺激序列。融合抗原多肽所包含的抗原多肽可以是相同的也可以是不相同的，所包含的免疫刺激序列可以是相同的也可以是不相同的。相邻的抗原多肽和免疫刺激序列之间、相邻的抗原多肽之间或者相邻的免疫刺激序列之间可以通过其自身氨基酸形成的肽键连接，亦或通过本发明前述部分提到的其它任意方式相连接，例如通过连接链连接抗原多肽和免疫刺激序列。

此处述及的免疫刺激序列是指可以增强抗原多肽免疫原性的物质，例如来自细菌耶尔森氏鼠疫杆菌属的侵染素蛋白(Inv)的结构域(Brett等人，欧洲免疫学杂志，1993，23：1608-1614)或来自其他耶尔森氏鼠疫杆菌侵染素蛋白中相应区域的免疫刺激类似物。常用的免疫刺激序列为本领域的已知技术，本领域技术人员可以根据其掌握的技术常识选择合适的免疫刺激序列并用在本发明的融合抗原多肽中。

在本发明的另一个方面，本发明提供了一类同时包含本发明的抗原多肽、T辅助细胞表位和免疫刺激序列的融合抗原多肽。抗原多肽、T辅助细胞表位和免疫刺激序列在融合抗原多肽中的数量可以分别是一个或多个，例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个或更多个。例如，融合抗原多肽包含一个抗原多肽，两个或更多个T辅助细胞表位，以及两个或更多个免疫刺激序列。又例如，融合抗原多肽包含两个或更多个抗原多肽，一个T辅助细胞表位，以及一个免疫刺激序列。又例如，融合抗原多肽包含两个或更多个抗原多肽，两个或更多个T辅助细胞表位，以及两个或更多个免疫刺激序列。相邻的抗原多肽、T辅助细胞表位和免疫刺激序列之间可以通过本发明前述部分提到的任意方式相连接，例如通过连接链连接，又例如通过其自身氨基酸之间形成的肽键连接。此处应当理解，融合抗原多肽中所包含的抗原多肽、T辅助细胞表位和免疫刺激序列可以以任意方式排列，例如抗原多肽分别与T辅助细胞表位和免疫刺激序列直接连接，又例如T辅助细胞表位分别与抗原多肽和免疫刺激序列直接连接，又例如免疫刺激序列分别与抗原多肽和T辅助细胞表位直接连接。

在本发明的另一个方面，本发明提供的抗原多肽或融合抗原多肽的肽链可以带有环状结构。所述环状结构可以通过在肽链的两个或多个氨基酸之间形成共价或非共价连接的方式来形成，例如在两个或多个氨基酸之间形成二硫键，肽键，碳键(例如C-C或C＝C)，酯键，醚键，偶氮键，C-S-C键，C-N-C键或C＝N-C键的方式来形成。在本发明的一个实施方式中，抗原多肽或者融合抗原多肽通过在其自身的两个半胱氨酸之间形成二硫键而形成环状结构。在本发明的一个实施方式中，包含SEQ ID NO：1-7所示序列的抗原多肽带有环状结构。在本发明的另一个实施方式中，包含SEQ ID NO：1-7所示序列的抗原多肽带有的环状结构由半胱氨酸间形成二硫键而形成。

多肽环化可以通过本领域的已知技术来实现，例如可以通过天然方法来对多肽进行环化处理，或者通过化学合成方法来对多肽进行环化处理从而获得环化结构。文献“Anwer等人，Int.J Pep.Protein Res.36：392-399(1990)”以及“Rivera-Baeza等人，Neuropeptides30：327-333(1996)”详细记载了多肽环化的方法，它们在此通过引用方式全文并入本申请用作参考。

在本发明的一个实施方式中，本发明提供了一种环化度大于85％的抗原多肽和融合抗原多肽。在本发明的一个实施方式中，本发明提供了一种环化度至少为85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或者100％的抗原多肽和融合抗原多肽。在本发明的另一个实施方式中，本发明提供了一种环化度大于87.5％的抗原多肽和融合抗原多肽。此处所用的“环化度”是指抗原多肽或融合抗原多肽中带有环状结构的肽链占总肽链数的百分比。本领域的技术人员可以根据形成环状结构的化学键的形式选择合适的方法测定环化度。例如，如果通过二硫键形成环状结构，其环化度可通过标准的Ellman方法进行测定，该环化度计算为通过二硫键成环的巯基(SH)数占初始的总的自由巯基(SH)数的百分比。Ellman方法属于本领域的已知技术，其已经详细记载于文献“Ellman等人，Anal.Biochem.94：75-81(1979)”中，该文献在此通过引用方式全文并入本申请以作参考。简单来讲，Ellman方法可以测定多肽中自由巯基(SH)的含量，使用Ellman方法测定多肽环化度可以概括为如下主要步骤：配制多个不同浓度的半胱氨酸溶液并分别加入Ellman试剂进行反应；测定反应后各种浓度的半胱氨酸溶液中自由巯基(SH)的吸光度，制作吸光度-浓度标准曲线并计算SH平均吸光值；测定样品溶液的吸光度，并根据之前计算获得的SH平均吸光值来推算样品溶液中自由SH的含量；根据样品溶液中自由SH的含量来推算成环的SH的量进而再计算样品溶液中多肽的环化度。

在本发明的另一方面，本发明提供了一种编码本发明的抗原多肽和融合抗原多肽的核酸序列。在本发明的一个实施方式中，本发明提供了编码如SEQ ID NOs：1-7所示抗原多肽，和SEQ ID NOs：11-12所示融合抗原多肽的核酸序列。

多肽的制备可以通过本领域的已知技术来实现，其可以通过化学合成方法制备，也可以通过基因工程方法制备。化学合成方法主要包括固相合成和液相合成两种方法。固相多肽合成方法包括，例如Merrifield固相合成法，该方法已详细记载在文献“Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154”和“M.Bodanszky等人，″Peptide Synthesis″，John Wiley &Sons，Second Edition，1976”以及“J.Meienhofer，″Hormonal Proteins and Peptides″，Vo1.2，p.46，Academic Press(New York)，1983”中。在此通过引用方式将这些文献全文并入到本申请中用作参考。Merrifield固相合成法主要包括以下步骤，根据目标多肽的氨基酸序列，先使被保护的C末端氨基酸与树脂连接；连接后洗涤树脂；脱去C末端氨基酸α氨基上的保护基(例如，叔丁氧羰基)，脱去这个保护基的时候必须要确保不断裂该氨基酸和树脂间的连接键；然后在所得的树脂上偶联倒数第二个C末端被保护的氨基酸，进行这一偶联时，在第二个氨基酸的游离羧基和连在树脂上的第一个氨基酸的氨基之间形成一个酰胺键；根据目标多肽的氨基酸连接顺序，依次重复前述反应过程，直到所有氨基酸都连接到树脂上；最后，从树脂上切落被保护的肽，脱去保护基即可得到目标多肽。

本发明的多肽也可以通过液相合成方法制备，例如可以用标准的溶液肽合成法制备，该方法已详细记载在文献“E.Schroder and K.Kubke，″The Peptides″，Vol.1，Academic Press (New York)，1965”中。在此通过引用方式将该文献全文并入到本申请中用作参考。液相合成法主要包括，利用形成酰胺键的化学或酶方法分步偶联氨基酸或肽片段。基因工程方法为利用编码相应抗原多肽或融合抗原多肽的核酸序列在适合的宿主细胞中表达生成相应抗原多肽或融合抗原多肽的方法。有关该方法的详细描述可参考“Sambrook，Fritsch &Maniatis，Molecular Cloning：A laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)”。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种疫苗，其包含本发明的口蹄疫病毒抗原多肽和/或融合抗原多肽，以及药学上可接受的媒介物。在一个实施方式中，本发明的疫苗包含多种本发明的口蹄疫病毒抗原多肽和/或融合抗原多肽。在另一个实施方式中，本发明的疫苗包含2种、4种、8种、16种、32种或64种本发明的口蹄疫病毒抗原多肽和/或融合抗原多肽。在另一个实施方式中，本发明的疫苗包含至少2种、4种、8种、16种、32种或64种本发明的口蹄疫病毒抗原多肽和/或融合抗原多肽。在另一个实施方式中，本发明的疫苗包含至少2种、4种、8种、16种、32种或64种包含如SEQ ID NO：1-7所示序列的口蹄疫病毒抗原多肽。

就本发明而言，术语“药学上可接受的媒介物”是指，任何合适的用于药物制剂中的药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂、防腐剂等。术语“药学上可接受的”是指相应的媒介物与药物制剂中的其它成分在化学性能和物理性能等方面相匹配，并且在生理上与给药个体相匹配，是给药个体可以耐受的。仅作为示例性的目的，已知的佐剂包括但不限于，例如完全弗氏佐剂，不完全弗氏佐剂，矿物质凝胶比如氢氧化铝，表面活性物质比如溶血软磷脂，复合多元醇，多聚阴离子，肽，油乳剂，烃乳状剂，钥孔血蓝蛋白等。在本发明的一个实施方式中，使用的佐剂是法国SEPPIC公司提供的Montanide ISA系列佐剂，例如Montanide ISA 28，Montanide ISA 035，Montanide ISA 025，Montanide ISA 206，Montanide ISA 575，Montanide ISA 563，Montanide ISA 50V(比如Montanide ISA 50V2)，Montanide ISA 775，Montanide ISA 763A，Montanide ISA 70。已知的载体包括但不限于，无菌液体，例如水，油，或者水和油的混合物，所述油可以是例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。已知的稀释剂包括但不限于，水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油及其类似物。已知的防腐剂包括但不限于，硫柳汞和EDTA等。

药学上可接受的媒介物的选择可以通过本领域的已知技术来实现，本领域技术人员可以根据需要制备的疫苗剂型基于现有技术选择合适的药学上可接受的媒介物。例如，对于制备口服液体制剂(例如，悬浮液、酊剂或溶液剂)，所选用的媒介物可以包括例如水、油、醇类、调味剂、防腐剂、着色剂等。又例如，对于制备口服固体制剂(例如，粉剂、胶囊剂或片剂)，所选用的媒介物可以包括例如淀粉、糖类、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。此外，如果需要，本发明的疫苗还可以制备成糖包衣或肠包衣，亦或者控释制剂。

还可以将本发明的口蹄疫病毒抗原多肽和/或融合抗原多肽和/或疫苗，与其它的口蹄疫病毒抗原和/或疫苗一起配制成多价疫苗。其它的口蹄疫病毒抗原和/或疫苗包括但不限于，其它抗原多肽或融合抗原多肽、灭活病毒株、病毒抗原、核酸疫苗、免疫刺激物等。获得的多价疫苗具有广谱的免疫原性，其可以对多种血清型的或多种亚型的口蹄疫病毒株及其变体具有免疫活性，经多价疫苗免疫后的牲畜可以获得对多种口蹄疫病毒株的免疫力。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种控制和/或预防动物口蹄疫的方法，该方法包括给予有此需要的动物免疫有效量的本发明抗原多肽，和/或融合抗原多肽，和/或疫苗。术语“免疫有效量”是指在给药动物体内引起针对口蹄疫病毒的免疫反应的量。免疫有效量与给药动物的物种、品种、年龄、体重和健康状况等因素有关。在一个实施方式中，本发明的疫苗用于控制和/或预防猪、牛或羊口蹄疫。在另一个实施方式中，本发明的疫苗用于控制和/或预防猪口蹄疫。在另一个实施方式中，本发明的疫苗用于控制和/或预防猪口蹄疫的O血清型。因此，本发明在另一个方面提供了一种将本发明的抗原多肽和/或融合抗原多肽用于制备控制和/或预防动物口蹄疫的药物中的应用。

本发明的疫苗可以通过本领域常规的药物配制技术进行制备，例如，作为有效成分的本发明的抗原多肽和/或融合抗原多肽与药学上可接受的媒介物混合成为均匀的混合物。本发明的疫苗可以通过任何已知给药途径给药，例如皮下、口服、肌内、或其他非肠道或肠道途径给药。在本发明的一个实施方式中，本发明的疫苗经皮下或肌内注射给药。如本领域技术人员所知，疫苗的用量依活性成分的活性、给药动物个体的年龄、体重等因素的不同而变化。本领域技术人员可以根据前述影响用量的因素容易地确定最合适的疫苗用量。

本发明的抗原多肽、融合抗原多肽和疫苗可以通过已知的多种方法来检测其免疫效力。现有技术提供了多种评估疫苗免疫效力的试验方法，例如，攻毒保护试验、血清学试验等。攻毒保护试验直接采用强病毒原对疫苗接种后的试验动物进行人工感染，然后根据动物的发病情况来判断疫苗的免疫效力。攻毒保护试验是检验疫苗免疫效力的最直接的方法，因此包括中国在内的多个国家都要求采用攻毒保护试验来评价兽用疫苗的免疫效力。有关攻毒保护试验的具体操作方法可参见，2010版《中国兽药典》中有关半数保护量(PD₅₀)测定的章节。也可以采用血清学试验方法来评估疫苗的免疫效力，例如通过测定免疫动物血清中产生的抗体含量进而判断疫苗的免疫效力。血清中的抗体含量可以通过现有技术已知的方法测定，例如蛋白印迹分析(Werstern Blot)或者酶联免疫吸附试验(ELISA)。这些血清学指标与疫苗效力之间存在关联性，其可以用来对疫苗免疫效力进行初步评估。本领域技术人员可以根据具体的试验条件以及试验目的等因素来选择合适的试验方法。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种检测口蹄疫病毒抗体的方法，该方法包括：提供一种或多种本发明的抗原多肽或者融合抗原多肽；将该抗原多肽或者融合抗原多肽与测试样品接触，使得抗原多肽或者融合抗原多肽与口蹄疫病毒抗体结合形成抗原-抗体复合物；检测口蹄疫病毒抗体。所述测试样品可以是来自宿主动物的任何适宜的生物样品，例如全血、血清、血浆，亦或者体液。测试样品可以是经过预处理的，亦或者未经过处理的。

本发明的口蹄疫病毒抗体检测方法中对于抗体的检测可以通过各种已知的技术来实现，例如蛋白印迹分析，或者酶联免疫吸附试验等。美国专利U.S.Nos.4,016,043，4,424,279，4,018,653中公开了许多检测抗体的免疫分析技术，这些美国专利在此通过引用方式全文并入本申请用作参考。例如，本发明可以使用双抗体夹心ELISA法来检测口蹄疫病毒抗体，该方法通常包括以下步骤：将捕获试剂(例如本发明的抗原多肽或者融合抗原多肽)固定到固体基质上，然后将含有目标蛋白(例如口蹄疫病毒抗体)的测试样品(例如宿主动物的血清)与捕获试剂接触以形成抗原-抗体复合物；加入标记了可检测报告分子的检测抗体，反应形成捕获试剂-目标蛋白-检测抗体复合物；除去未反应的物质，然后检测报告分子产生的信号进而用作定性或者定量分析。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种检测口蹄疫病毒抗体的试剂盒，该试剂盒包含：a)本发明的抗原多肽或者融合抗原多肽，以及，b)可以将所述抗原多肽或者融合抗原多肽固定其上的固定相。固定相通常是固体基质。本发明的试剂盒还可以包含标记了可检测报告分子的检测抗体或其他可与目标蛋白结合的检测试剂，和/或者可与检测报告分子反应的底物。此外，本发明的试剂盒还可以进一步包含试剂盒的使用说明。

本发明提供了一类新颖的人工合成的口蹄疫病毒抗原多肽、融合抗原多肽和疫苗，其可用于免疫宿主动物使其产生广泛的针对口蹄疫病毒的免疫力。与现有的口蹄疫病毒疫苗相比，本发明的抗原多肽、融合抗原多肽和疫苗具有更强的免疫原性和免疫持久性。农业部规定口蹄疫病毒疫苗的半数保护剂量大于3即为合格，现有的口蹄疫病毒疫苗的半数保护剂量均在6左右或更低，而本发明疫苗的半数保护剂量可高达12以上，远高于农业部的规定和现有口蹄疫病毒疫苗。本发明的抗原多肽、融合抗原多肽和疫苗具有广谱的免疫性，例如针对O型口蹄疫病毒的不同亚型有广泛的适用性。此外，因为本发明的抗原多肽、融合抗原多肽和疫苗使用多肽序列作为免疫原而并未使用灭活病毒或弱毒病毒，所以其不存在使免疫动物感染病毒的副作用，因此本发明的抗原多肽、融合抗原多肽和疫苗还具有更高的安全性。