用于结核杆菌培养滤液蛋白10(CFP-10)定量检测的标准品研制

具体实施方式

下述实施例和实验所用的材料及设备如下：

细胞株、菌株与质粒：菌株Streptomyces avidinii(亲和素链霉菌，ATCC)，DH5α和Rosetta；原核表达质粒pET24a  (Kana^r，Novagen)。

主要生化试剂及材料：DNeasy组织试剂盒和质粒DNA的制备试剂盒(Qiagen)，寡核苷酸的合成(Sigma)，Trizol，SuperScript II逆转录酶，Platinum Pfx DNA聚合酶和T4 DNA连接酶(Invitrogen)，琼脂糖和SDS-PAGE(Biorad)，Ni-NTA(Qiagen)填料，CFP10标准品以及抗CFP10单克隆抗体(Biodesign)。

DNA片段的连接、转化及转化子筛选，限制性内切酶分析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶点泳等常规方法均参照文献(Sambrook J，et al.Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，2nd edition，1989)或厂家提供的产品说明书；DNA序列分析在大连宝生物工程公司的DNA测序服务中心完成。

例1.CFP10-L-SA-6His融合蛋白的制备

1、用DNeasy组织试剂盒从亲和素链霉菌抽提出细菌的基因组DNA，然后用其作为模板，通过Platinum pfx DNA聚合酶进行PCR制备成熟链亲和素cDNA。

引物：5’GGAATTCTCAAGCGGGGGCAGCGGGGGCGGAGGCAGCGGCGGGGGCGGATCCGCCGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCC 3’(78nt)和5’GTGGTGCTCGAGCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC 3’(39nt)。

反应条件：变性94℃，2min，循环(94℃，15s→60℃，15s→68℃，30s)，25轮，最后68℃，5min。

2、用DNeasy组织试剂盒从结核杆菌H37Rv培养物中抽提出细菌的基因组DNA，然后用其作为模板，通过Platinum pfx DNA聚合酶进行PCR制备CFP10 cDNA。

引物：5’-CGGATCCCATATGGCAGAGATGAAGACCGA-3’(31nt)和5’-CGGAATTCAAGCTTGAAGCCCATTTGCGAGGA-3’(32nt)。

反应条件：变性94℃，2min，循环(94℃，20s→55℃，30s→68℃，60s)30轮，最后68℃，5min。

3、构建CFP10-L-SA-6His-pET24重组质粒

制备的CFP10 cDNA(不含终止码，两端分别含Nde I和EcoR I限制性内切酶位点)和SA cDNA(不含终止码，两端分别含EcoR I和Xho I限制性内切酶位点)，将上述CFP10和SA基因片段克隆于pET-24a载体中，获得CFP10-L-SA-6His-pET24重组表达质粒(结构图如图1所示)。其中L为富含甘氨酸、丝氨酸的连接肽(15肽)。重组表达质粒经DNA序列分析鉴定，验证其正确无误。

4、构建CFP10-L-SA-6His-pET24/Rosetta工程菌

CFP10-L-SA-6His-pET24重组表达质粒转化后Rosetta感受态细胞后，用含卡那霉素的LB平皿筛选。挑取转化平皿上的单菌落接种于加有卡那霉素(20μg/ml)的LB培养基中。经37℃摇床培养扩增至吸光度A600为0.4～0.5时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，37℃诱导表达4h，离心(8000g×10min)收获菌体，将细胞破碎后用12％的SDS-PAGE检测分析融合蛋白的表达情况。

5、CFP10-L-SA-6His融合蛋白的表达

CFP10-L-SA-6His融合蛋白在菌体中主要以包涵体的形式存在，分子量为29.8KD，其表达量达20～30％。

6、从包涵体中获得CFP10-L-SA-6His融合蛋白

a.制备包涵体：5克菌体悬于100ml 1xPBS中，冰浴中超声(电流270mA)，30秒×10次(每次间隔30秒)；接着于4℃离心10分钟(8000g)，将沉淀悬浮于100ml 1xPBS(内含4mol/L尿素，0.5％Triton X-100，20mmol/L EDTA)中进行漂洗，随后离心(1000g×10分钟)收集沉淀；漂洗两次后，溶于50mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素(pH8.0)中，15000g×15分钟，取上清液。

b.Ni-NTA柱层析：将步骤a得到的上清液上样于Ni-NTA(2.6×5cm)，用平衡液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素，0.5mmol/LNaCl，pH8.0)进行冲洗至样品A₂₈₀恢复至基线；然后用洗脱液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素，0.5mmol/LNaCl，pH8.0，其中咪唑分别为30mmol/L，50mmol/L，100mmol/L，200mmol/L)进行洗脱，洗脱液经SDS-PAGE鉴定，收集CFP10-L-SA-6His融合蛋白峰。

c.透析复性：将Ni-NTA柱层析纯化获得的CFP10-L-SA-6His融合蛋白调至OD₂₈₀＝0.2，在大于20倍体积的透析液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，4.0mol/L尿素，0.2mmol/LNaCl，5％甘油，pH8.0)中4℃透析复性8小时；然后在50mmol/L磷酸钠缓冲液、2.0mol/L尿素、2.5％甘油，pH8.0)中4℃透析复性8小时；再在50mmol/L磷酸钠缓冲液、1.0mol/L尿素、1.25％甘油，pH8.0)中4℃透析复性8小时；最后在50mmol/L磷酸钠缓冲液中继续透析8小时；离心除去不溶物，收集上清。将收集的CFP10-L-SA-6His融合蛋白质液调至pH8.0，并过滤除菌分装，储存于-20℃。

所得CFP10-L-SA-6His融合蛋白用SDS-PAGE鉴定(29.8KD)，结果如图3、图4所示。

7、时间分辨荧光免疫分析对CFP10-L-SA-6His融合蛋白进行检测，灵敏度为0.15ng/ml。

例2.6His-SA-L-CFP10融合蛋白的制备

1、制备成熟链亲和素cDNA：方法与例1同。

引物：5’-GGAATTCCATATGCATCATCACCATCACC ATGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGG-3’(55nt)和5’-GGAATTCGGCGGATCCGCCCCC GCCGCTGCCTCCGCCCCCGCTGCCCCCGCTCGTCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC-3’(82nt)。

2、制备CFP10 cDNA：方法与例1同。

引物：5’-CGGATCCCATATGGCAGAGATGAAGACCGA-3’(31nt)和5’-CGGAATTCAAGCTTGAAGCCCATTTGCGAGGA-3’(32nt)。

3、构建6His-SA-L-CFP10-pET24重组质粒

制备的SA cDNA(不含终止码，两端分别含Nde I和BamH I限制性内切酶位点)和CFP10 cDNA(不含终止码，两端分别含BamH I和Xho I限制性内切酶位点)，将上述SA基因片段和CFP10克隆于pET-24a载体中，获得6His-SA-L-CFP10-pET24重组表达质粒(结构图如图2所示)。其中L为富含甘氨酸、丝氨酸的连接肽(15肽)。重组表达质粒经DNA序列分析鉴定，验证其正确无误。

4、构建6His-SA-L-CFP10-pET24/Rosetta工程菌：方法与例1同。

5、6His-SA-L-CFP10融合蛋白的表达

6His-SA-L-CFP10融合蛋白在菌体中主要以包涵体的形式存在，分子量为29.1KD，其表达量达20～30％。

6、从包涵体中获得6His-SA-L-CFP10融合蛋白：方法与例1同。

7、时间分辨荧光免疫分析对6His-SA-L-CFP10融合蛋白进行检测，灵敏度为0.78ng/ml。

例3.本发明融合蛋白灵敏度检测：将CFP10-L-SA-6His融合蛋白、6His-SA-L-CFP10融合蛋白和CFP10进行系列递比稀释，然后用时间分辨荧光免疫分析进行检测，三种蛋白的检测灵敏度如下：CFP10-L-SA-6His融合蛋白：0.15ng/ml；His-SA-L-CFP10融合蛋白：0.78ng/ml；CFP10：3.8ng/ml(图7)。

例4.本发明融合蛋白稳定性检测：分别取8ng/ml CFP10-L-SA-6His融合蛋白、40ng/ml 6His-SA-L-CFP10融合蛋白和200ng/ml CFP10取2ml置于室温下(20-25℃)一个月，每隔7天用时间分辨荧光免疫分析对三种蛋白进行检测，荧光信号变化如图8所示。

例5.将CFP10-L-SA-6His融合蛋白作为时间分辨荧光免疫分析检测CFP10的标准品(图9)，将CFP10-L-SA-6His蛋白进行系列稀释，浓度分别为0.2、1、5、25、125ng/ml，两个复孔取平均值，制做标准曲线，Y＝1.03X+4.03，R＝0.9994。