伊氏锥虫与路氏锥虫二重PCR检测试剂盒及制备方法

具体实施方式

为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

实施例1

1、二重PCR鉴别检测试剂盒的引物设计

根据选取的特异基因利用生物软件设计二重PCR引物如下：

伊氏锥虫：

TE-a：5'CGGGTCGTCTGCTAAAGT3'

TE-s：5'GCCCGCAGTTGCCTAT3'

路氏锥虫：

TL-a：5'GAGCTCAAGCGGCAGGTTA3'

TL-s：5' TGCGCGAGAAGAGAGGACT 3'

以上两对引物在同一体系中（二重PCR反应体系）能同时扩增检测出伊氏锥虫和路氏锥虫特异基因片断，能够实现同时检测和鉴别伊氏锥虫与路氏锥虫的目的。

、样本裂解液与DNA提取试剂的配制

按照下列浓度配比NaCl 100mM、Tris-HCl(pH 7.5)20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2%（w/v）和蛋白酶K 0.1μg/μl进行混合，制备样本裂解液；DNA提取试剂：体积比为25:24: 1的酚:氯仿:异戊醇。

、PCR反应液的配制

含反应终浓度各100-300μM的4种dNTPs，反应终浓度各10-100pmol/μl的引物，1.5-4.5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌双蒸水；

4、对照

阳性对照为伊氏锥虫DNA和路氏锥虫DNA；阴性对照为灭菌双蒸水；

5、反应体系优化

二对引物各自浓度的优化：设置引物在体系的终浓度梯度为：0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM，用此区间的引物尝试都得到相应的扩增，其中当引物量为10pmol（引物的贮存浓度为20pmol/μL，取0.5μL）终浓度为0.5 pmol/μL时效果最佳。

二对引物各自退火温度的优化：设置引物的退火温度分别为：47℃、50℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃、63℃，在梯度PCR仪上进行扩增，结果在55℃时两引物都有最优化的扩增。

此外，本发明的试剂盒还可以含有琼脂糖（Agarose）、溴酚蓝点样缓冲液和Taq酶，其浓度优选为溴化乙锭10μg/μL；溴酚蓝点样缓冲液和Taq酶 5U/μL。还可以含有PCR反应管。

实验例1、二重PCR鉴别检测方法特异性实验

取1 ng日本血吸虫、杜氏利氏曼原虫与瑟氏泰勒虫作为阴性模板按照该PCR反应体系和扩增条件扩增，验证其特异性。

结果显示对照样本均无扩增，符合属特异检测标准，图1。

实验例2

二重PCR鉴别检测方法敏感性实验

取血样经计数后，将每mL血液含锥虫虫体数1×10⁵个、1×10⁴个、1×10³个、1×10²个、10个、1个、0.5个浓度以PBS缓冲液稀释，按照模板处理方法进行提取基因组，并进行PCR扩增检测，验证其灵敏度。结果显示路氏锥虫与伊氏锥虫二重PCR检测方法最低检测限可以达到1个虫体/反应，属高灵敏度检测方法，符合敏感性检测标准，见图2-3。

实验例3

试剂盒的稳定性和重复性实验

阳性模板，PCR反应液可在-20℃条件下长期贮存，溶解后4℃条件4℃保存即可，应避免反复冻融。当贮存时间为30天、60天、100天、150天、200天时取出各组分，按照检测体系检测试剂盒稳定性。取15份阳性样本用此试剂盒重复试验3次，15份PCR阴性样本同样重复3次。结果表明在以上各时段取出的组分在稳定性和重复性试验中无假阳性与假阴性结果出现，故此试剂盒稳定性和重复性良好。

实验例4

试剂盒的保质期试验

将分别在4℃和-20℃贮存1个月、3个月、5个月、7个月和10个月的试剂盒取出，按照检测体系对已知样本进行检测。结果表明在4℃和-20℃条件下保存达10月之久的试剂盒仍能对样本作出准确的检测。

检测例1

分别采集16份伊氏锥虫感染小鼠血样和19份路氏锥虫感染大鼠血样，用经典的瑞氏染色方法作对比结合二重PCR方法对样品进行检测。

（一）瑞氏染色法

将每个样本以PBS稀释3-5倍后滴片，滴加瑞氏染液使染液铺满血涂面，染色1min；以蒸馏水轻柔冲洗表面5min，晾干后置于显微镜下观察镜检。

（二）二重PCR检测

1、样本的预处理

取样本0.5mL，水平离心机3000g离心沉淀。

2、样本DNA的提取

（1）将上述沉淀转移到1.5mL离心管中，加入1mL裂解液，在液氮和65℃水浴中反复冻融三次。

（2）将冻融后的样品加入5-6μl（20mg/mL）蛋白酶K，使其终浓度为100μg/mL。混匀后在65℃水浴中浸泡1h。

（3）用酚:氯仿:异戊醇（24:25:1）进行抽提两次，12000g离心十分钟。

（4）将上面的水相小心的吸取到灭菌的EP管中，注意不要吸取中层变性的蛋白层。

（5）在水相中加入3M醋酸钠（PH5.2）60-70μl，再加入2倍体积的冷乙醇在-20℃冰箱中沉淀1h。

（6）将沉淀完全的样品在4℃冷冻离心机中12000g离心30min，弃上清后再用75%酒精洗涤一遍。

（7）弃酒精后在晾干，用TE缓冲液或是灭菌4蒸水溶解保存，待检。

3、PCR扩增：

（1）按待检样品数+2的PCR反应管取PCR反应液、Taq酶等，混于一管中，建立20μl体系，在涡旋器上混匀备用。

（2）取阴性和阳性对照各1μL分别加入标记好的管中，然后取样品各1μL依次加入并标记好，置于PCR仪中。

（3）PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸30s，扩增30个循环，72℃最终延伸10min。

4、PCR产物观察：

称取琼脂糖，配制0.8%的琼脂糖凝胶，按0.5μg/mL加入E.B.，用电泳液混匀后（0.8%-1.0%）在微波炉中加热2分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现482bp扩增条带证明是伊氏锥虫感染；如果出现261bp扩增条带证明是路氏锥虫感染。

（三）、瑞氏染色法和二重PCR检测结果

经瑞氏染色法和二重PCR检测比较，发现16份伊氏锥虫血样中瑞氏染色法检出14例伊氏锥虫，二重PCR法检出16例伊氏锥虫；19份路氏锥虫血样中瑞氏染色法检出18例路氏锥虫，二重PCR法检出19例路氏锥虫。同时瑞氏染色法未能对伊氏锥虫和路氏锥虫作出准确的鉴别，而二重PCR检测法可对二者进行区分。

序列表

<110>  吉林大学

<120>  伊氏锥虫与路氏锥虫二重PCR鉴别检测试剂盒及制备方法

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  引物（primer）

<222>  (1)..(18)

<223> 

<400>  1

cgggtcgtctgctaaagt  18

<210>  2

<211>  16

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  引物（primer）

<222>  (1)..(16)

<223> 

<400>  2

gcccgcagttgcctat  16

<210>  3

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  引物（primer）

<222>  (1)..(19)

<223> 

<400>  3

gagctcaagcggcaggtta  19

<210>  4

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  引物（primer）

<222>  (1)..(19)

<223> 

<400>  4

tgcgcgagaagagaggact  19