内吗啡肽-1类似物及其合成和在制备镇痛药物中的应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，涉及一类新的内吗啡肽-1类似物及其合成；本 发明同时还涉及该内吗啡肽-1类似物在制备镇痛药物中的应用。

背景技术

现代医学所谓的疼痛，是一种复杂的生理心理活动，是临床上最常见的症状之 一。它包括伤害性刺激作用于机体所引起的痛感觉，以及机体对伤害性刺激的痛反 应。长期疼痛给患者带来痛苦和不安，剧痛还可以引起失眠或其他生物功能紊乱， 影响患者的生活质量。因此，疼痛药物的研发一直是全球性的热点和难点。阿片类 药物因其止痛作用强，在缓解重度疼痛具有无可取代的地位。然而它们在起到镇痛 作用的同时往往伴随很多副作用，很大程度上限制了其在镇痛方面的应用。临床上 镇痛最常应用的是阿片药物，除了众所周知的副作用外，不同的阿片药物治疗还可 产生急性耐受性。因此，发现新型的低副作用的阿片类镇痛药物是目前科学研究的 难点，尤其是能够产生强效的无耐受现象的镇痛作用的药物。

阿片类镇痛药物主要是通过μ阿片受体发挥镇痛作用，所以自从μ阿片受体的内 源性配体内吗啡肽被发现后，科学家们对其进行了广泛而深入的研究。研究表明： 内吗啡肽通过与G蛋白偶联的μ阿片受体结合，可参与对痛觉、呼吸、心血管、胃肠、 行为、运动、内分泌及免疫等诸多功能的调节，但其主要药用作用体现在镇痛功能 上。同时发现，在中枢给药情况下，内吗啡肽可产生强度与吗啡相当而副作用较少 的镇痛作用。其中内吗啡肽-1(Tyr-Pro-Trp-Phe-NH₂)具有优于内吗啡肽-2 (Tyr-Pro-Phe-Phe-NH₂)的治疗学特性，如奖赏行为与镇痛作用的分离，耐受的形 成较内吗啡肽-2发展更慢一些，镇痛剂量明显低于引起呼吸抑制及心血管作用的剂 量等，因此推测内吗啡肽-1比内吗啡肽-2更适于作为新的安全阿片类镇痛药物先导 化合物。

内吗啡肽-1(Endomorphin-1，EM-1)具有酶解稳定性差，血脑屏障通透能力差 的缺点，从而限制其在临床上的应用。因此，通过对内吗啡肽-1进行结构改造，在 尽量不降低或提高其亲和活力的前提下，提高酶解稳定性和血脑屏障通透能力；从 而得到外周给药产生高效镇痛活性的内吗啡肽-1类似物成为近年研究的方向。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中存在的问题，提供一类种具有高亲和力、 酶解稳定性好、镇痛作用强并且作用时间长、低副作用的内吗啡肽-1类似物。

本发明的另一目的是提供一种该内吗啡肽-1类似物的合成方法。

本发明还有一个目的，就是提供该内吗啡肽-1类似物在制备镇痛药物中的应 用。

(一)内吗啡肽-1类似物

本发明的内吗啡肽-1类似物，是以内吗啡肽-1为母体进行改造而成，其结构式 如下：

其中，第一个结构式的内吗啡肽-1类似物命名为[GAGS]-EM-1。

第二个结构式中，R＝Cl、F或H。

当R＝Cl，内吗啡肽-1类似物命名为[GAGP]-EM-1，其结构式如下：

当R＝F，内吗啡肽-1类似物命名为[GAGF]-EM-1，其结构式如下：

当R＝H，内吗啡肽-1类似物命名为[GAGD]-EM-1，其结构式如下：

从上述结构式可以看出，四种内吗啡肽-1类似物是将内吗啡肽-1的一位Tyr进 行N端胍基化；二位Pro被D-Ala替换；三位Trp被Gly替换；四位Phe分别被Trp 替换或是Phe的苯环对位氯化、氟化修饰或未修饰。

四个类似物都为白色固体粉末，其理化特征见表1。

表1.EM-1及其类似物的理化特征

a.HPLC测定的保留时间：分析柱：Waters Delta-Pak C18 column(3.9mm× 150mm)；流动相流速0.6ml/min，流动相＝含0.05％TFA的水(A)+0.05％TFA 的乙腈(B)。流动相A∶B＝90∶10→90∶10；洗脱梯度：0-30min；A∶B＝ 90∶10→90∶10，洗脱梯度：30-35min。

b.高效硅胶板上的Rf值；展开体系为：乙酸乙酯/甲醇/氨水＝20∶10∶1。

(二)内吗啡肽-1类似物的合成

本发明内吗啡肽-1类似物的合成方法如下：

(1)单苄氧羰酰脒基吡唑的合成

以二氯甲烷(DCM)与N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液为溶剂，在三 乙胺(Et₃N)或二异丙基乙胺(DIEA)的作用下，脒基吡唑盐酸盐与苄氧羰酰氯 以1∶1～1∶1.3的摩尔比于室温反应0.5～1.5小时，反应完全后减压浓缩除去溶剂，用 乙酸乙酯溶解，依次用质量浓度为3～8％的柠檬酸、饱和氯化钠洗涤，无水硫酸 钠干燥，浓缩；粗产物用乙酸乙酯/石油醚(1∶4，v/v)结晶得白色晶体——单 苄氧羰酰脒基吡唑。

所述二氯甲烷(DCM)与N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液中，二者 的体积比为1∶0.5～1∶1.5；三乙胺(Et₃N)或二异丙基乙胺(DIEA)的用量为脒 基吡唑盐酸盐的1.5～3倍。

(2)双苄氧羰酰脒基吡唑的合成

以四氢呋喃(THF)为溶剂，在氩气保护下，将单苄氧羰酰脒基吡唑与氢化 钠(NaH)以1∶3～1∶5的摩尔比于0～5℃反应20～40分钟，再加单苄氧羰酰脒基吡 唑摩尔量1.5～2.5倍的苄氧羰酰氯，于室温反6～10小时；反应完全后，用0～5℃冰 水淬灭反应，反应完全后减压浓缩除去四氢呋喃，用乙酸乙酯萃取，再依次用 质量浓度为3～8％的柠檬酸、饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，粗产物 依次用乙酸乙酯、乙醚、正己烷结晶，得白色晶体——双苄氧羰酰脒基吡唑。

(3)Cbz₂-Amidino-Tyr-D-Ala-OH的合成

以无水甲醇为溶剂，在钯碳催化剂和持续通氢气的作用下，将 Cbz-Tyr-D-Ala-OH于室温反2～4小时，抽滤，除去钯碳，减压抽去甲醇，得到 油状物，即为脱保护二肽——Tyr-D-Ala-OH。

将双苄氧羰酰脒基吡唑与脱保护二肽Tyr-D-Ala-OH以1∶1～1∶1.3的摩尔比溶 解于无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入双苄氧羰酰脒基吡唑摩尔量2～5 倍的三乙胺，室温反应48～72小时；反应完全后，用乙酸乙酯溶解，依次用质 量浓度3～8％柠檬酸、饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱 层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯∶冰乙酸＝50∶85∶2，v/v)，得无色油状化合物 ——Cbz₂-Amidino-Tyr-D-Ala-OH。

所述钯碳催化剂的含钯量为10～40％；钯碳的用量为Cbz-Tyr-D-Ala-OH质 量的20～40％。

所述Cbz-Tyr-D-Ala-OH的合成如下：

将Cbz-Tyr-OH与N-羟基琥珀酰亚胺(HOSU)以1∶1～1∶1.3的摩尔比溶于 无水四氢呋喃或二氯甲烷中，于0～5℃下搅拌15-20分钟后，加入摩尔量为 Cbz-Tyr-OH 1～1.2倍的N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，反应5～15分钟，室 温下搅拌反应6～10小时，过滤，除去反应生成的环二己基脲(DCU)，得到化 合物Cbz-Tyr-OSU活化酯的四氢呋喃(THF)溶液；将摩尔量为Cbz-Tyr-OH  1.1～1.3倍的D-丙氨酸(D-AIa)溶于2mol/L的NaOH水溶液，调节PH值至9～ 10，于0～5℃下加入到上述化合物Cbz-Tyr-OSU的四氢呋喃(THF)溶液中，先 在0～5℃下反应20～40分钟后，再于室温反应6～10小时；反应完全后，减压浓 缩、过滤除去THF，用乙酸乙酯溶解，再依次用质量浓度3～8％柠檬酸、饱和碳 酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析纯化 (乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1，(v/v))，既得Cbz-Tyr-D-Ala-OH。

(4)Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-R)-NH₂或

Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH₂的合成

将Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OH与N-羟基琥珀酰亚胺以1∶1～1∶1.3的摩尔比 溶于四氢呋喃(THF)或二氯甲烷(DCM)中，于0～5℃下反应10～20分钟； 再加入Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OH摩尔量1～1.2倍的N，N’-二环己基碳二亚 胺(DCC)，于0～5℃下反应20～40分钟，然后于室温搅拌反应6～10小时，得 Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH的活化酯溶液，即Cbz₂GUPy-Tyr-D-AIa-OSU溶液；

将Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OH摩尔量1.1～1.3倍的Boc-Gly-Phe(4-R)-NH₂或Boc-Gly-Trp-NH₂用乙酸乙酯溶解，在0～5℃下加入乙酸乙酯体积0.2～0.5倍 的浓盐酸，反应20～40分钟后，室温下反应1.5～2小时；然后用碱液调Ph至9～10， 得脱保护二肽溶液，即Gly-Phe(4-R)-NH₂或Gly-Trp-NH₂溶液；

将上述Cbz₂GUPy-Tyr-D-AIa-OSU溶液加入到Gly-Phe(4-R)-NH₂或 Gly-Trp-NH₂溶液中，于0～5℃下反应20～40分钟后，再于常温反应6～10小时； 反应完全后，减压浓缩除去四氢呋喃，用乙酸乙酯溶解，再依次用质量浓度3～8％ 柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩， 硅胶柱层析分离(乙酸乙酯∶石油醚∶甲醇＝2∶1∶0.2，v/v)，得 Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-R)-NH₂或Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa- GIy-Trp-NH₂。

所述Boc-GIy-Phe(4-R)-NH₂或者Boc-GIy-Trp-NH₂的合成如下：

在0～5℃下，将Boc-Gly-OH与HOSU以1∶1～1∶1.3的摩尔比溶于四氢呋喃 (THF)或二氯甲烷(DCM)中，加入Boc-Gly-OH摩尔量为1.1～1.3倍量的N，N’ -二环己基碳二亚胺(DCC)，先在0～5℃下反应20～40分钟后，再于室温搅拌反 应6～10小时，得化合物Boc-Gly-OH的活化酯溶液，即Boc-Gly-OSU溶液；

将Boc-Phe(4-R)-OH或Boc-Trp-OH与苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲-六氟 磷酸盐(HBTU)以1∶1～1∶1.3的摩尔比溶于N，N-二甲基甲酰胺中，加入 Boc-Phe(4-R)-OH或Boc-Trp-OH摩尔量1～1.2倍的1-羟基苯并三氮唑(HOBT)； 再加入Boc-Phe(4-R)-OH或Boc-Trp-OH摩尔量1.5～3倍的二异丙基乙胺 (DIEA)，于室温反应10～30分钟；然后加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)体积2～5 倍的浓氨水，搅拌反应6～10小时；反应完全后抽去氨水，再用乙酸乙酯溶解， 依次用质量浓度3～8％的柠檬酸、饱和NaHCO₃、饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠 干燥，得白色固体；用PE∶EA＝5∶1结晶得白色固体，即为Boc-Phe(4-R)-NH₂或 Boc-Trp-NH₂；

将Boc-Phe(4-R)-NH₂或Boc-Trp-NH₂溶解于乙酸乙酯中，在0～5℃下加入乙 酸乙酯体积0.2～0.5倍的浓盐酸，反应1～2小时；再用碱液调Ph至9-10，得脱 保护氨基酸Phe(4-R)-NH₂或者Trp-NH₂溶液；

在0～5℃，将Boc-Gly-OSU溶液加入到上述Phe(4-R)-NH₂或者Trp-NH₂溶 液，反应20～40分钟；再于室温反应6～10小时；反应完全后，减压浓缩除去四 氢呋喃(THF)，再加乙酸乙酯溶解残留物，依次用质量浓度3～8％柠檬酸、饱 和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离 (石油醚(PE)∶乙酸乙酯(EA)＝1∶2。)，得Boc-GIy-Phe(4-R)-NH₂或 Boc-GIy-Trp-NH₂。

(5)N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-R)-NH₂或N-Amidino-Tyr- D-AIa-GIy-Trp-NH₂的合成

将Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-R)-NH₂或Cbz₂-Amidino-Tyr- D-AIa-GIy-Trp-NH₂溶于无水甲醇中，加入钯碳催化剂，通氢气搅拌反应1～2小 时，真空抽滤除钯碳，减压浓缩滤液，柱层析分离(乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝45∶20∶8 (v/v))，得白色固体化合物，既为目标产物脱保护四肽 N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-R)-NH₂或N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy- Trp-NH₂。

其合成路线如下：

本发明采用HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)/DCC(环己基羰二亚胺)活化酯法 接肽，N端二肽和C端二肽可以同时合成，然后将两端合成好的片段对接，这样 合成类似物可以简化合成线路，节约时间，我们将这种方法简称“2+2法”。此外， 采用HOSu/DCC活化酯法具有成本低，不易消旋，产率高，易纯化等特点。

本发明制备的中间产物以及终产物都经过质谱检测，证明得到的产品的结 构与结构式一致。

内吗啡肽-1具有极高的μ阿片受体亲和力是其发展为阿片镇痛药物的基础； 而极低的酶解稳定性和不能通过血脑屏障(外周给药不能产生镇痛作用)则是 限制其成为镇痛药物的主要原因。在体内，降解内吗啡肽的主要酶是DPPⅣ， 此酶的识别位点为Pro²，所以提高内吗啡肽的酶解稳定性最有效的改造就是替 换或改造二位的Pro。同时，二位的Pro对内吗啡肽保持其活性构象起着非常重 要的作用。采用D-Ala替换Pro提高酶解稳定性，同时保持或提高其μ阿片受 体亲和力。由于提高药物的整体脂溶性可以提高药物的血脑屏障的通透能力， 所以应用C末端的氯化或氟化修饰来提高类似物的整体脂溶性，从而提高血脑 屏障的通透能力。此外，对类似物采用了N端胍基化修饰，脑毛细血管内壁带 有负电荷，因此使肽类物质带上正电荷可提高其血脑屏障通透性，胍基化修饰 可提高多肽的膜渗透性和酶解稳定性等药理活性。同时，我们还通过计算机辅 助模拟设计分析出未引入胍基时Trp³的吲哚基处于受体一个π-π相互作用区域 中，增加了配体亲和力。而引入胍基后，受主链变化影响，Trp³的吲哚基偏离了 原有π-π相互作用区域，这样不但没有形成π-π相互作用来增加亲和，反而使 吲哚基对配体受体的结合造成了空间位阻。因此，我们用Gly取代Trp³，消除 吲哚基对配体受体结合造成的空间位阻。

(三)吗啡肽-1类似物的药理学活性鉴定实验

本发明的类似物在镇痛方面的应用以生物活性鉴定实验说明。生物活性鉴 定实验包括放射配体受体结合实验，离体生物活性功能鉴定实验，离体代谢稳 定性实验，温浴甩尾镇痛实验和药物耐受实验。实验过程中类似物都被溶解于 生理盐水中。

1.放射配体受体结合试验

1.1大鼠脑膜蛋白的制备

成年Wistar大鼠(250-300g)断头取出大脑，用冰冷的50mM的Tris-HCl缓冲 液(pH＝7.4)冲洗大脑三次，除去溢血后，用滤纸擦干，称重。加20倍体积的 (v/w)Tris-HCl缓冲液，冰浴下，匀浆器匀浆。匀浆液在4℃下1000g离心10min 后，上清液在4℃下20000g离心25min，除去上清液，加入原体积的Tris-HCl缓冲 液，吹打使重新悬浮，再次在冰浴下匀浆。匀浆液先在37℃水浴孵育30min后， 在4℃下20000g离心25min后，除去上清液，再加入原体积的Tris-HCl缓冲液混匀。 使用考马斯亮蓝G-250法测定提取的脑膜蛋白含量。将匀浆液分批放在细胞冻存 管里，-80℃下保存待用。

1.2受体结合试验

取-80℃保存脑膜蛋白，37℃水浴1min快速解冻。实验分为总结合管，竞争 结合管和非特异性结合管。每个反应管中依次加入放射配体，纳洛酮(Naloxone， Nx)/非放射性药物，Tris-HCl(含PMSF和Captoril)和膜蛋白(300-500μg/ml)。 其中，在总结合管中，只加入[³H]DAMGO(0.5nM)和固定的膜蛋白 (300-500μg/ml)，在非特异性结合管和竞争结合管中，分别另加入10μM Nx和 不同浓度的类似物，最后补充Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)至总体积0.5ml。振荡 器混匀反应液。37℃摇床反应时间为1h，取出离心管，反应液经ZT-II型细胞收 集器收集，GF/C型玻璃纤维素膜过滤。80℃油浴下烘烤玻璃纤维素膜30min后， 取出滤膜，放入24孔板中，每孔加入0.7ml闪烁液，封盖膜封盖。隔夜用β液体 闪烁计数仪记录放射性强度(CPM)。计算类似物对特异性结合的抑制率，以 浓度的负对数为横坐标，抑制率为纵坐标，线性回归求得IC₅₀值，根据公式 K_i＝IC₅₀/(1+[L]/K_D)计算K_i值。每个实验数据为分别平行做3组实验求平均值。

1.3实验结果

EM-1及其类似物的μ阿片受体解离常数K_i值见表2。

表2.EM-1及其类似物的μ阿片受体解离常数K_i值

表2的结果表明，类似物[GAGS]-EM-1，[GAGP]-EM-1，[GAGF]-EM-1， [GAGD]-EM-1的μ阿片受体亲和解离常数为母体EM-1的12.7％，5.78％，6.78 ％和6.78％，可见其亲和活性都比母体EM-1提高了十倍以上。可见N端胍基化和 二位、三位的替换使类似物的结构更易于与μ阿片受体结合。

2.离体生物活性功能鉴定

2.1 GPI试验

豚鼠250-300g，雌雄不限，实验前禁食12h，饮水不限。棒击枕部处死，剖 腹取出近盲肠端的回肠6cm两段，浸入持续通入95％O₂和5％CO₂混合气的 Krebs液(g/L：NaCl 6.9，CaCl₂ 0.28，KCl 0.35，KH₂PO₄ 0.16，MgSO₄·7H₂O 0.30， NaHCO₃ 2.1，苯海拉明50×10^-6，氯化胆碱2.8×10^-3，葡萄糖1.98)中，湿润后 套在一根玻璃棒上，沿回肠壁的一根纵形血管将纵行肌与环形肌分离，然后用 零号丝线将纵行肌的一端缚在玻璃电极的小钩上，另一端缚在JZ-1型肌肉张力 传感器上，制备好后立即放入盛有持续通入气体(95％O₂和5％CO₂)的Krebs 液、恒温37±0.2℃的玻璃浴管中，预负荷500mg。前30min每5min换一次营 养液，以后每15min换液一次，平衡2h后开始实验。给予电刺激，刺激参数： 波宽0.3-0.5ms，频率6次·min^-1，负载电压50V。记录基础收缩强度，再给予 适量吗啡鉴定其活性；然后分别给予不同剂量的待试药物，记录收缩强度，计 算抑制百分率。每次药物作用后，用营养液冲洗5次，平衡15min。每个实验数 据为分别平行做6-8组实验求平均值。

2.2实验结果

EM-1及其类似物GPI实验的IC₅₀值见表3。

表3.EM-1及其类似物GPI实验的IC₅₀值。

表3的实验数据显示，类似物[GAGP]-EM-1，[GAGF]-EM-1的IC₅₀值为母体 EM-1的80％，61％，可见类似物[GAGP]-EM-1，[GAGF]-EM-1的离体激动活性 高于母体；而类似物[GAGD]-EM-1的IC₅₀值要比母体的高，可见类似物 [GAGD]-EM-1的离体激动活性要低于母体。这说明C-末端苯丙氨酸的修饰有助 于提高类似物的激动活性。[GAGS]-EM-1的离体激动活性略低于母体。

3.离体酶解稳定性实验

3.1.血浆/脑质膜标本制备

3.1.1100％血浆标本制备

向离心管加入2mg/ml的浓度的肝素钠溶液，烘干待用；30-35g成年雄性小 白鼠，用乙醚麻醉，取眼球取血到处理的离心管中，轻微振荡，4℃2000g离心 20min。收集上清液，-80℃冻存待用。

3.1.215％小鼠脑质膜标本制备

取30-35g成年雄性小鼠，颈椎脱臼处死，取大脑(去除小脑及脑桥)，滤纸 吸干，称重。用冰冷的1mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)冲洗几次，除去溢血。 加入50倍体积(v/w)的冰冷1mM Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲液，0℃下，用匀浆 器使之成胞浆匀浆。匀浆液置于冰浴中放置30分钟以促进细胞溶解。然后按每 1ml匀浆液补加0.5ml 50mM冰冷的Tris-HCl，再次匀浆，吹打悬浮。49000g离心 45min，弃上清，沉淀重新悬浮于50倍体积的冰冷50mM Tris-HCl中，吹打悬浮。 49000g再次离心45min，弃上清，沉淀悬浮于适当体积的50mM Tris-HCl中，使 脑膜蛋白浓度约为2mg/ml。振荡器震荡涡旋混匀，分装，-80℃冻存。

3.2血浆/脑质膜孵育试验

取10μl多肽母液(10^-2M)，加入到190μl血浆或脑质膜中，立即振荡混匀， 然后迅速取出20μl混合液，加入离心管中计时为0min，余者于37℃下继续孵育， 并分别在5min，10min，15min，30min，60min，120min，240min，300min，360min， 420min取出20μl。酶解过程的终止：于取出的样品中加入90μl乙腈振荡混匀， 样品置于冰上放置5分钟，再用90μl 0.5％的冰冷乙酸稀释以确保酶解过程停止。 13000g离心15min，收集上清，-80℃冻存，直至RP-HPLC分析。

3.3反相-高效液相色谱(reversed-phase high performance liquid  chromatography，RP-HPLC)分析

运用RP-HPLC分析各个时间点的离体稳定性样品。RP-HPLC系统由Waters  Delta 600控制器，紫外监测器和Waters Delta Pak C18柱(3.9mm×150mm) 组成。血浆样品用波长280nm检测，流动相流速0.6ml/min，流动相＝乙腈含0.05％ TFA(A)+水含0.05％TFA(B)。流动相A∶B＝30∶70→70∶30，洗脱时间0-30min； A∶B＝70∶30→30∶70；洗脱时间30-35min。脑膜样品用波长280nm检测， 流动相流速0.6ml/min，流动相＝乙腈含0.05％TFA(A)+水含0.05％TFA(B)。流 动相A∶B＝5∶95→95∶5，洗脱时间：0-30min；A∶B＝95∶5→5∶95；洗脱 时间30-35min。分别测定每个时间点样品药物浓度，并根据药物代谢公式以各 个时间点的药物浓度和时间绘制药物变化曲线计算求得药物得半衰期。每个实 验数据为分别平行做3组实验求平均值。

3.4实验结果

EM-1及其类似物的生物半衰期的实验数据见表4。

表4.EM-1及其类似物的生物半衰期

表4的实验数据显示，所有EM-1类似物在小鼠脑质膜和血浆半衰期都显著 高于母体EM-1。其中，[GAGS]-EM-1在脑匀浆中的半衰期最长，约是母体的 21倍；[GAGP]-EM-1的稳定性也很高，在脑匀浆中约是母体的16倍，在血浆 中约是母体的38倍。可见，二位、三位用D-Ala-Gly替换和N端胍基化都显著 增强了类似物的抗酶解能力。C-末端苯丙氨酸的修饰有助于提高血浆半衰期。

4.镇痛实验

4.1实验方法

采用小鼠温浴甩尾法。昆明系雄性小鼠，18-20g，环境温度：20℃，水浴温 度：50±0.5℃。给药前先测定小鼠的基础痛阈(control latency，CL)，将小鼠 鼠尾的1/3浸入水浴，记录鼠尾从刚浸入水浴至发生收缩的时间。过于敏感 (＜2.5s)或迟钝的(＞5s)小鼠弃去不用，截止时间10s，以防止小鼠烫伤。侧 脑室(i.c.v.)分别注射类似物[GAGS]-EM-1，[GAGP]-EM-1，[GAGF]-EM-1， [GAGD]-EM-1，EM-1和吗啡，注射体积4μl，类似物[GAGS]-EM-1， [GAGP]-EM-1，[GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1，EM-1和吗啡分别用10只小鼠 测定数据。给药后第5，10，15，20，30，40，60，70，80，90，100，110，120min 各测一次甩尾潜伏期(test latency，TL)；药物浓度有10nmol/kg，20nmol/kg。 结果以最大可能效应百分比(maximum possible effect，％MPE)。皮下(s.c.)分 别注射类似物[GAGS]-EM-1，[GAGP]-EM-1，[GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1， EM-1和吗啡，注射浓度有10mg/kg，5mg/kg，注射体积为100μl，类似物 [GAGS]-EM-1，[GAGP]-EM-1，[GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1，EM-1和吗啡分 别用10只小鼠测定数据。给药后测定5，10，15，20，30，40，60，70，80，90， 100min的甩尾潜伏期。结果以最大镇痛效应百分率(maximum possible effect， ％MPE)表示：％MPE＝100×(TL-CL)/(10-CL)，分别注射等体积的生理盐水 都无镇痛活性产生。

4.2实验结果

图1显示了侧脑室注射类似物[GAGS]-EM-1，及母体EM-1产生的镇痛时效曲 线图。[GAGS]-EM-1的镇痛效果强于母体EM-1。

图2显示了侧脑室注射类似物[GAGP]-EM-1，[GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1 及母体EM-1和吗啡产生的镇痛时效曲线图。图2的结果显示，类似物 [GAGP]-EM-1，[GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1均产生强效的镇痛作用，镇痛效 力和镇痛持续时间都明显高于母体EM-1和吗啡。

图3～图6显示了皮下注射类似物[GAGS]-EM-1，[GAGP]-EM-1， [GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1及母体EM-1和吗啡产生的镇痛时效曲线图。图2 的结果显示：其中10mg/kg EM-1最大镇痛活性仅有11.4％(见表5)，基本无镇 痛活性。而类似物[GAGP]-EM-1，[GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1都表现出了明 显强于吗啡的镇痛作用，而且作用时间都比吗啡强。[GAGS]-EM-1的最大镇痛 效应略低于吗啡，但是作用时间比吗啡长。

EM-1及其类似物分别在侧脑室注射和皮下注射后最大的镇痛效应的实验 数据见表5。

表5.EM-1及其类似物分别在侧脑室注射和皮下注射后最大的镇痛活性

表5显示侧脑室注射10nmol/kg类似物[GAGP]-EM-1，[GAGF]-EM-1， [GAGD]-EM-1最大镇痛活力就能达到100％，[GAGS]-EM-1最大镇痛活力能达到 82％，20nmol/kg母体EM-1是51.1％，20nmol/kg吗啡是44.3％。可见类似物 [GAGP]-EM-1，[GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1，[GAGS]-EM-1最大镇痛活力明 显高于母体EM-1和吗啡。同时，表5也显示皮下注射5mg/kg类似物 [GAGP]-EM-1，[GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1最大镇痛效应也都明显高于母体 EM-1(10mg/kg)和吗啡(5mg/kg)。

5.药物耐受实验

5.1实验方法

选取18-20g的雄性昆明系小鼠30只，分3组，每组10只，分别注射类似物 5mg/Kg[GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1和吗啡，连续7天每天皮下注射一次，分 别在给药后的1，3，5，7天测定镇痛活性，对比判断其镇痛活性降低情况。

5.2实验结果

图6为皮下注射[GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1与吗啡1-7天的耐受性柱图。 从图6可以看出类似物[GAGF]-EM-1和[GAGD]-EM-1的镇痛活性降低程度明显 小于吗啡。

表6表示1-7天皮下注射吗啡，[GAGF]-EM-1和[GAGD]-EM-1的镇痛时效曲 线下面积值，数据如下：

表6.1-7天皮下注射吗啡，[GAGF]-EM-1和[GAGD]-EM-1的镇痛时效曲线下面积值

表6显示出了第一天注射吗啡的镇痛时效曲线下面积值为2460.1，而第3天， 第5天，第7天的时效曲线下面积值分别为1296.2，1219.7，992.3，分别是第1天 的52.6％，49.5％，40.3％。与第1天相比，从第三天开始就有显著性差异了。

第一天注射[GAGF]-EM-1的镇痛时效曲线下面积值为3509.4，而第3天，第5 天，第7天的值分别为2596.2，2716.9，2542.9，分别是第1天的73.9％，77.4％， 72.4％。与第1天相比，数值没有明显的差异。

第一天注射[GAGD]-EM-1的镇痛时效曲线下面积值为2828.2，而第3天，第5 天，第7天的值分别为3100.5，2941.5，2262.3，分别是第1天的109.6％，104％， 80％。与第1天相比，数值没有明显的差异。

可见皮下注射相同剂量的吗啡，[GAGF]-EM-1和[GAGD]-EM-1能产生基本 相同的镇痛效果，[GAGF]-EM-1的略高一点。但是吗啡第三天就产生了明显的 耐受。而[GAGF]-EM-1和[GAGD]-EM-1在连续给药7天的情况下几乎没有产生耐 受。在第7天给药后依然能产生较强的镇痛效果，与第1天相比没有明显的降低。

上述实验结果表明：本发明的四个内吗啡肽-1类似物[GAGP]-EM-1， [GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1的亲和活性明显高于母体；在离体酶解稳定性上 也都明显高于母体EM-1；四个类似物在侧脑室和皮下给药的情况下，镇痛效果 都高于吗啡；特别是在皮下给药的情况下，四个类似物表现出了明显高于吗啡 的镇痛活性，并且作用时间明显比吗啡长。与吗啡相比，四个类似物无耐受现 象的发生。总之，[GAGS]-EM-1的镇痛作用时间比吗啡更长；其它三个内吗啡 肽-1类似物[GAGP]-EM-1，[GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1与吗啡相比好处在于： 镇痛效果更强，作用时间更长，其中[GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1与吗啡相比 不易引起耐受性，主要体现在长期外周给药能够产生强效的无耐受现象的镇痛 作用。因此，这四个类似物可以作为临床镇痛药物来开发。

附图说明

图1是侧脑室注射母体EM-1及内吗啡肽-1类似物[GAGS]-EM-1的镇痛效应- 时间曲线。

图2是侧脑室注射吗啡，母体EM-1及内吗啡肽-1类似物[GAGP]-EM-1， [GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1的镇痛效应-时间曲线。

图3～图6是皮下注射吗啡及内吗啡肽-1类似物[GAGS]-EM-1，[GAGP]-EM-1， [GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1的镇痛效应-时间曲线。

图7是皮下注射吗啡及内吗啡肽-1类似物[GAGF]-EM-1，[GAGD]-EM-1的 1-7天的耐受性柱图。^*表示与第一天的数值相比差异显著(T检验，^*P＜0.01； ^**P＜0.001)。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明内吗啡肽-1类似物的合成方法作详细说明。

其合成路线如下：

实施例1：类似物[GAGS]-EM-1的合成

(1)单苄氧羰酰脒基吡唑的合成

0.73g(5mmol)化合物脒基吡唑盐酸盐加入到等体积二氯甲烷(DCM)和 二甲基甲酰氨(DMF)的混合液中，加入三乙胺(10mmol)，冰浴下缓慢滴加 845ul(6mmol)苄氧羰酰氯，冰浴反应30分钟，室温反应1.5小时。反应完全 后，减压浓缩DCM，加大量乙酸乙酯溶解残留物，依次用5％的柠檬酸水溶液 和饱和NaCl水溶液萃取三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。粗产物用乙酸乙酯/石油 醚(1∶4，v/v)结晶得到白色晶体单苄氧羰酰脒基吡唑1.127g。产率为92％。 ESI-MS m/z＝245[M+H]⁺。

(2)双苄氧羰酰脒基吡唑的合成

0.61g(2.5mmol)化合物单苄氧羰酰脒基吡唑和0.24g(10mmol)NaH溶解 于THF中，氩气保护，冰浴搅拌下，反应30min后，缓慢滴加5mmol苄氧羰酰 氯(Cbz-Cl)，冰浴下反应30min，室温反应6h。反应完全后，冰浴下冰水萃灭 反应，减压浓缩THF，乙酸乙酯萃取水相三次，合并乙酸乙酯层，饱和NaCl 洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。粗产物用乙酸乙酯/乙醚/正己烷结晶，得白 色晶体Cbz₂GUPy 0.616g。产率为65％。ESI-MS m/z＝379[M+H]⁺。

(3)Cbz₂-Amidino-Tyr-D-Ala-OH的合成

1.39g(3.6mmol)化合物Cbz-Tyr-D-Ala-OH(苄氧羰酰保护的酪氨酸D-丙 氨酸二肽)和0.28g的10％Pd/C在40ml无水甲醇中反应，持续通氢气搅拌反应 2小时，抽滤，除去钯碳，减压抽去甲醇，得到脱保护二肽Tyr-D-Ala-OH，再 加入1.134g(3mmol)化合物双苄氧羰酰脒基吡唑(Cbz₂GUPy)，并使二者溶解 于3ml无水DMF中，加入5mmol三乙胺，室温反应48小时；反应完全后，用 乙酸乙酯溶解，依次用质量浓度5％柠檬酸和饱和NaCl水溶液萃取，无水硫酸 钠干燥，浓缩，柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯∶冰乙酸＝50∶85∶2(v/v))，得无 色油状化合物Cbz₂-Amidino-Tyr-D-Ala-OH。ESI-MS m/z＝563[M+H]⁺。

其中，Cbz-Tyr-D-Ala-OH的合成如下：

将1.575g(5mmol)Cbz-Tyr-OH与0.633g(5.5mmol)HOSU溶于无水四氢 呋喃或二氯甲烷中，于0～5℃下搅拌15分钟后，加入1.133g(5.5mmol)的DCC， 反应30分钟，室温下搅拌反应8小时，过滤，除去反应生成的DCU(环二己 基脲)，得到化合物Cbz-Tyr-OH的活化酯溶液，即Cbz-Tyr-OSU溶液；将0.534g (6mmol)D-AIa(D型丙氨酸)溶于饱和碳酸氢钠水溶液，于0～5℃下搅拌10 分钟后，加入到上述化合物Cbz-Tyr-OSU溶液中，先在0～5℃下反应30分钟后， 再于室温反应9小时；反应完全后，减压浓缩除去溶剂、溶于乙酸乙酯，依次 用5％的柠檬酸，饱和氯化钠萃取三次，并用无水硫酸钠(Na₂SO₄)干燥。过 滤，减压蒸发掉溶剂，硅胶柱层析分纯(乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1，v/v)，油 泵减压得无色油状产物Cbz-Tyr-D-Ala-OH。ESI-Ms m/z＝387[M+H]⁺。

(4)Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH₂的合成

将0.562g(1mmol)的Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OH与0.126g(1.1mmol) 的HOSU溶于THF中，于0～5℃下搅拌10分钟；再加入0.227g(1.1mmol) 的DCC，0～5℃下搅拌20分钟，然后于室温搅拌反应6小时，得 Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OH的活化酯溶液即Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶 液。

将0.374g(1.1mmol)的Boc-Gly-Trp-NH₂溶于2ml乙酸乙酯中，在0～5℃ 下加入0.5ml浓盐酸，反应30分钟；然后于室温下反应2小时，减压浓缩乙酸 乙酯，2N氢氧化钠调节残留物pH至8～9，得Gly-Trp-NH₂；

搅拌下，将上述Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶液加入到Gly-Trp-NH₂溶 液中，于0～5℃下反应30分钟，再于常温反应6小时；反应完全后，减压浓缩 除去THF，用乙酸乙酯萃取，再依次用质量浓度5％柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、 饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离(PE∶EA＝1∶2(v/v))， 得Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH₂。ESI-Ms m/z＝805[M+H]⁺。

上述Boc-GIy-Trp-NH₂的合成如下：

将0.283g(1mmol)的Boc-Trp-OH与0.417g(1.1mmol)HBTU溶解于5mlDMF 中，之后加入0.179g(1.1mmol)的HOBT；再缓慢滴加329ul(2mmol)DIEA(二异 丙基乙胺)，反应溶液的颜色从无色变为淡黄色，最后变为红色；然后加入15ml 的浓氨水，搅拌反应6小时；反应完全后抽去氨水，再用乙酸乙酯萃取，依次 用质量浓度5％的柠檬酸、饱和NaHCO₃，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥， 得白色固体；用PE∶EA＝5∶1结晶得到白色固体Boc-Trp-NH₂；在0～5℃下，将 Boc-Trp-NH₂溶于1ml乙酸乙酯中，在0～5℃下加入0.2ml的浓盐酸，反应0.5 小时；再于室温下反应1.5小时，减压浓缩乙酸乙酯，2N氢氧化钠调节残留物 pH至8～9，得到脱Boc保护Trp-NH₂溶液；

在0～5℃下，将0.175g(1mmol)的Boc-Gly-OH与0.126g(1.1mmol)的HOSU溶于 THF，加入0.227g(1.1mmol)的DCC，搅拌10分钟；再于室温搅拌反应6小时，得 化合物Boc-Gly-OH的活化酯溶液，即Boc-Gly-OSU溶液；

在0～5℃，将Boc-Gly-OSU溶液加入到上述Trp-NH₂溶液中，反应0.5小时； 再与室温反应6小时；反应完全后，减压浓缩除去THF，用乙酸乙酯萃取，依次 用5％柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓 缩，柱层析分离，得Boc-GIy-Trp-NH₂。柱层析的展开剂为PE∶EA＝1∶2。

步骤(5)N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH₂的合成

将0.10g Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH₂溶于20ml无水甲醇中，加入 0.02g  10％钯碳，通氢气搅拌反应2小时，抽滤除去钯碳，减压除去甲醇，得 到脱保护四肽；柱层析分离(开剂体系为EA∶PE＝4∶1(v/v))，取Rf＝1/4处的荧 光带展，用甲醇溶解，抽滤，浓缩，即得目标产品 N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH₂。ESI-Ms m/z＝537[M+H]⁺。

实施例2：类似物[GAGP]-EM-1的合成

(1)单苄氧羰酰脒基吡唑的合成

同实施例1步骤(1)

(2)双苄氧羰酰脒基吡唑的合成

同实施例1步骤(2)

(3)Cbz₂-Amidino-Tyr-D-Ala-OH的合成

同实施例1步骤(3)

(4)Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-Cl)-NH₂的合成

将0.562g(1mmol)的Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OH与0.126g(1.1mmol)的 HOSU溶于THF中，于0～5℃下搅拌10分钟；再加入0.227g(1.1mmol)的DCC， 0～5℃下搅拌20分钟，然后于室温搅拌反应6小时，得 Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OH的活化酯溶液即Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶 液。

将0.374g(1.1mmol)的Boc-Gly-Phe(4-Cl)-NH₂溶于2ml乙酸乙酯中，在0～5℃ 下加入0.5ml浓盐酸，反应30分钟；然后于室温下反应2小时，减压浓缩乙酸 乙酯，2N氢氧化钠调节残留物pH至8～9，得Gly-Phe(4-Cl)-NH₂；

搅拌下，将上述Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶液加入到Gly- Phe(4-Cl)-NH₂溶液中，于0～5℃下反应30分钟，再于常温反应6小时；反应完 全后，减压浓缩除去THF，用乙酸乙酯萃取，再依次用质量浓度5％柠檬酸、饱 和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离 (PE∶EA＝1∶2v/v)，得Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-Cl)-NH₂。ESI-Ms m/z ＝800[M+H]⁺。

上述Boc-GIy-Phe(4-Cl)-NH₂的合成如下：

将0.283g(1mmol)的Boc-Phe(4-Cl)-OH与0.417g(1.1mmol)HBTU溶解于 5mlDMF中，之后加入0.179g(1.1mmol)的HOBT；再缓慢滴加329ul(2mmol)DIEA (二异丙基乙胺)，反应溶液的颜色从无色变为淡黄色，最后变为红色；然后加 入15ml的浓氨水，搅拌反应6小时；反应完全后抽去氨水，再用乙酸乙酯萃取， 依次用质量浓度5％的柠檬酸、饱和NaHCO₃，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干 燥，得白色固体；用PE∶EA＝5∶1结晶得到白色固体Boc-Phe(4-Cl)-NH₂；在0～5 ℃下，将Boc-Phe(4-Cl)-NH₂溶于1ml乙酸乙酯中，在0～5℃下加入0.2ml的浓 盐酸，反应0.5小时；再于室温下反应1.5小时，减压浓缩乙酸乙酯，2N氢氧 化钠调节残留物pH至8～9，得到脱Boc保护Phe(4-Cl)-NH₂溶液；

在0～5℃下，将0.175g(1mmol)的Boc-Gly-OH与0.126g(1.1mmol)的HOSU溶于 THF，加入0.227g(1.1mmol)的DCC，搅拌10分钟；再于室温搅拌反应6小时，得 化合物Boc-Gly-OH的活化酯溶液，即Boc-Gly-OSU溶液；

在0～5℃，将Boc-Gly-OSU溶液加入到上述Phe(4-Cl)-NH₂溶液中，反应0.5小 时；再与室温反应6小时；反应完全后，减压浓缩除去THF，用乙酸乙酯萃取， 依次用5％柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥， 浓缩，柱层析分离(PE∶EA＝1∶2)，得Boc-GIy-Phe(4-Cl)-NH₂。

(5)N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-Cl)-NH₂的合成

将0.10g Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-Cl)-NH₂溶于20ml无水甲醇中， 加入0.02g 10％钯碳，通氢气搅拌反应2小时，抽滤除去钯碳，减压除去甲醇， 得到脱保护四肽；柱层析分离(开剂体系为EA∶PE＝4∶1)，取Rf＝1/4处的荧光带 展，用甲醇溶解，抽滤，浓缩，即得目标产品N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe Phe(4-Cl)-NH₂。ESI-Ms m/z＝532[M+H]⁺。

实施例3：类似物[GAGF]-EM-1的合成

(1)单苄氧羰酰脒基吡唑的合成

同实施例1步骤(1)

(2)双苄氧羰酰脒基吡唑的合成

同实施例1步骤(2)

(3)Cbz₂-Amidino-Tyr-D-Ala-OH的合成

同实施例1步骤(3)

(4)Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-F)-NH₂的合成

将0.562g(1mmol)的Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OH与0.126g(1.1mmol)的 HOSU溶于THF中，于0～5℃下搅拌10分钟；再加入0.227g(1.1mmol)的DCC， 0～5℃下搅拌20分钟，然后于室温搅拌反应6小时，得 Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OH的活化酯溶液即Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶 液。

将0.374g(1.1mmol)的Boc-Gly-Phe(4-F)-NH₂溶于2ml乙酸乙酯中，在0～5℃ 下加入0.5ml浓盐酸，反应30分钟；然后于室温下反应2小时，减压浓缩乙酸 乙酯，2N氢氧化钠调节残留物pH至8～9，得Gly-Phe(4-F)-NH₂；

搅拌下，将上述Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶液加入到Gly-Phe(4-F)-NH₂溶液中，于0～5℃下反应30分钟，再于常温反应6小时；反应完全后，减压浓 缩除去THF，用乙酸乙酯萃取，再依次用质量浓度5％柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶 液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离(PE∶EA＝1∶2)， 得Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-F)-NH₂。ESI-Ms m/z＝784[M+H]⁺。

上述Boc-GIy-Phe(4-F)-NH₂的合成如下：

将0.283g(1mmol)的Boc-Phe(4-F)-OH与0.417g(1.1mmol)HBTU溶解于 5mlDMF中，之后加入0.179g(1.1mmol)的HOBT；再缓慢滴加329ul(2mmol)DIEA (二异丙基乙胺)，反应溶液的颜色从无色变为淡黄色，最后变为红色；然后加 入15ml的浓氨水，搅拌反应6小时；反应完全后抽去氨水，再用乙酸乙酯萃取， 依次用质量浓度5％的柠檬酸、饱和NaHCO₃，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干 燥，得白色固体；用PE∶EA＝5∶1结晶得到白色固体Boc-Phe(4-F)-NH₂；在0～5 ℃下，将Boc-Phe(4-F)-NH₂溶于1ml乙酸乙酯中，在0～5℃下加入0.2ml的浓盐 酸，反应0.5小时；再于室温下反应1.5小时，减压浓缩乙酸乙酯，2N氢氧化 钠调节残留物pH至8～9，得到脱Boc保护Phe(4-F)-NH₂溶液；

在0～5℃下，将0.175g(1mmol)的Boc-Gly-OH与0.126g(1.1mmol)的HOSU溶于 THF，加入0.227g(1.1mmol)的DCC，搅拌10分钟；再于室温搅拌反应6小时，得 化合物Boc-Gly-OH的活化酯溶液，即Boc-Gly-OSU溶液；

在0～5℃，将Boc-Gly-OSU溶液加入到上述Phe(4-F)-NH₂溶液中，反应0.5小 时；再与室温反应6小时；反应完全后，减压浓缩除去THF，用乙酸乙酯萃取， 依次用5％柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥， 浓缩，柱层析分离，得Boc-GIy-Phe(4-F)-NH₂。柱层析的展开剂为PE∶EA＝1∶2。

(5)N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-F)-NH₂的合成

将0.10g Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-F)-NH₂溶于20ml无水甲醇中， 加入0.02g 10％钯碳，通氢气搅拌反应2小时，抽滤除去钯碳，减压除去甲醇， 得到脱保护四肽；柱层析分离(EA∶PE＝4∶1)，取Rf＝1/4处的荧光带展，用甲醇 溶解，抽滤，浓缩，即得目标产品N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-F)-NH₂。ESI-Ms m/z＝516[M+H]⁺。

实施例4：类似物[GAGD]-EM-1的合成

(1)单苄氧羰酰脒基吡唑的合成

同实施例1步骤(1)

(2)双苄氧羰酰脒基吡唑的合成

同实施例1步骤(2)

(3)Cbz₂-Amidino-Tyr-D-Ala-OH的合成

同实施例1步骤(3)

(4)Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe-NH₂的合成

将0.562g(1mmol)的Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OH与0.126g(1.1mmol)的 HOSU溶于THF中，于0～5℃下搅拌10分钟；再加入0.227g(1.1mmol)的DCC， 0～5℃下搅拌20分钟，然后于室温搅拌反应6小时，得 Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OH的活化酯溶液即Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶 液。

将0.374g(1.1mmol)的Boc-Gly-Phe-NH₂溶于2ml乙酸乙酯中，在0～5℃下加 入0.5ml浓盐酸，反应30分钟；然后于室温下反应2小时，减压浓缩乙酸乙酯， 2N氢氧化钠调节残留物pH至8～9，得Gly-Phe-NH₂；

搅拌下，将上述Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶液加入到Gly-Phe-NH₂溶 液中，于0～5℃下反应30分钟，再于常温反应6小时；反应完全后，减压浓缩 除去THF，用乙酸乙酯萃取，再依次用质量浓度5％柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、 饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离(PE∶EA＝1∶2)，得 Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe-NH₂。ESI-Ms m/z＝766[M+H]⁺。

上述Boc-GIy-Phe-NH₂的合成如下：

将0.283g(1mmol)的Boc-Phe-OH与0.417g(1.1mmol)HBTU溶解于5mlDMF 中，之后加入0.179g(1.1mmol)的HOBT；再缓慢滴加329ul(2mmol)DIEA(二异 丙基乙胺)，反应溶液的颜色从无色变为淡黄色，最后变为红色；然后加入15ml 的浓氨水，搅拌反应6小时；反应完全后抽去氨水，再用乙酸乙酯萃取，依次 用质量浓度5％的柠檬酸、饱和NaHCO₃，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥， 得白色固体；用PE∶EA＝5∶1结晶得到白色固体Boc-Phe-NH₂；在0～5℃下，将 Boc-Phe-NH₂溶于1ml乙酸乙酯中，在0～5℃下加入0.2ml的浓盐酸，反应0.5 小时；再于室温下反应1.5小时，减压浓缩乙酸乙酯，2N氢氧化钠调节残留物 pH至8～9，得到脱Boc保护Phe-NH₂溶液；

在0～5℃下，将0.175g(1mmol)的Boc-Gly-OH与0.126g(1.1mmol)的HOSU溶于 THF，加入0.227g(1.1mmol)的DCC，搅拌10分钟；再于室温搅拌反应6小时，得 化合物Boc-Gly-OH的活化酯溶液，即Boc-Gly-OSU溶液；

在0～5℃，将Boc-Gly-OSU溶液加入到上述Phe-NH₂溶液中，反应0.5小时； 再与室温反应6小时；反应完全后，减压浓缩除去THF，用乙酸乙酯萃取，依次 用5％柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓 缩，柱层析分离(PE∶EA＝1∶2)，得Boc-GIy-Phe-NH₂。

(5)N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe-NH₂的合成

将0.10g Cbz₂-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-F)-NH₂溶于20ml无水甲醇中， 加入0.02g 10％钯碳，通氢气搅拌反应2小时，抽滤除去钯碳，减压除去甲醇， 得到脱保护四肽；柱层析分离(开剂体系为EA∶PE＝4∶1)，取Rf＝1/4处的荧光带 展，用甲醇溶解，抽滤，浓缩，即得目标产品N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe-NH₂。 ESI-Ms m/z＝498[M+H]⁺。