采用水不溶性离子液体提取家禽羽毛角蛋白的方法及相关的家禽羽毛角蛋白溶液

技术领域

本发明涉及家禽羽毛角蛋白提取技术领域，特别是指一种采用水不溶性离子液体 提取家禽羽毛角蛋白的方法及相关的家禽羽毛角蛋白溶液。

背景技术

角蛋白是来源丰富、应用价值很高的生物蛋白，广泛存在于生物体的组织结构中。 羽毛的主要化学成分是角蛋白，作为一种绿色天然纤维，具有其他材料不可替代的优 势。全球每年的家禽羽毛产量可达数亿吨，中国的羽毛废弃物产量达70多万吨，而且 还在逐年增加。利用废弃羽毛制备可溶性羽毛蛋白不仅充分利用了蛋白资源，同时也 大大减少了由此造成的环境污染。中国从20世纪80年代左右开始重视羽毛废物的资源 化利用，例如，角蛋白水解产物作为动物饲料的添加剂，其改性产物对皮革、橡胶等 进行填充，可制备性能优良的皮革及橡胶产品。制成的角蛋白不仅可用于纺丝，也可 为后续在食品、化工、医药、农业、污水处理、包装、建筑、考古、纺织等领域应用 打下基础，产生良好的经济和社会效益。

角蛋白分子链由19种α-氨基酸构成，氨基酸通过肽键构成多肽长链，这些长链又 通过二硫键、氢键、盐键、范德华力等横向联系形成角蛋白的空间结构。一般情况下， 角蛋白分子内的二硫键使肽链内部和肽链之间发生交联，形成立体网状结构，使天然 角蛋白难以溶解，给羽毛中角蛋白的提取带来困难。目前提取角蛋白的方法大致有机 械法、化学法和生物法等，其中化学法又可分为酸碱水解法、还原法、氧化法等。中 国专利200810150653.2，公开了“从羽毛中提取角蛋白的方法”，该发明是用化学法 从羽毛中提取角蛋白，其主要工艺流程为：乙醇预处理→盐酸预处理→巯基乙醇还原 →角蛋白沉淀。已有报道的化学法等技术处理步骤多，并且利用大量的无机酸碱和还 原剂等环境不友好试剂，造成很大的环境污染。

离子液体是由有机阳离子和无机或有机阴离子构成的在室温或室温附近温度下 呈液体状态的盐类。与传统的有机溶剂相比，离子液体具有如下特点：(1)液体状态 温度范围宽(2)蒸汽压低，不易挥发(3)对大量的无机和有机物质都表现出良好的溶 解能力(4)具有较大的可设计性，密度大。由于离子液体展现出这些独特的物理化学 性质及特有功能，因此它是一类值得研究发展的新型“软”功能材料或介质。目前离 子液体的应用领域主要在：化学反应、催化反应、分离技术、电化学等。2004年Phillips 等首先研究了不同离子液体对蚕丝的溶解特性，结果发现亲水的咪唑氯盐提取蚕丝纤 维有较好的溶解效果(J.Am.Chem.Soc.，2004，126(44)：14350-14351)。谢海波等研究 了利用亲水的咪唑氯盐制备角蛋白溶液的方法，取得较好的溶解效果 (CN200410011389.6)。离子液体作为一种绿色溶剂被广泛的研究和利用，但其成本 相对较高，所以离子液体必须被循环利用。虽然，上述的亲水离子液体对蚕丝、羽毛 等有较好的溶解效果，但角蛋白的分离和离子液体的回收需要添加有机溶剂，导致了 成本的提高和环境的污染。

综观上述现有技术，传统法提取角蛋白的缺陷是：无机酸碱等试剂用量大，且不 能循环利用，对环境造成极大的污染；离子液体提取角蛋白的缺陷是：角蛋白很难从 离子液体中分离出来。因此，利用离子液体的可设计性，寻找一种合适的离子液体溶 解羽毛成为本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种采用水不溶性离子 液体提取家禽羽毛角蛋白的方法及相关的家禽羽毛角蛋白溶液，采用该提取方法，角 蛋白分离简单，离子液体回收方便，且环境友好，适于大规模推广应用。

为了解决上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种采用水不溶性离子液体提 取家禽羽毛角蛋白的方法，其特点是，所述的方法包括以下步骤：

1)将家禽羽毛洗涤、干燥、粉碎；

2)加入水不溶性离子液体，在70℃～100℃下搅拌3～6小时；

3)反应后加水、离心后形成水不溶性离子液体/未溶解家禽羽毛/水三相系统， 分离出水相，即得到粗角蛋白溶液。

所述水不溶性离子液体可以是任何不溶于水的离子液体。所谓“不溶于水”是指 该离子液体在水中的溶解度小于8g/100mL。较佳地，所述水不溶性离子液体是1-羟乙 基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐[HOEMIm]NTf₂。

所述家禽羽毛和所述水不溶性离子液体的质量比没有限制，可以是任何合适的比 例。较佳地，所述家禽羽毛和所述水不溶性离子液体的质量比为1∶20～1∶50。

虽然离子液体能够破坏二硫键，但是为了促进二硫键的破坏，较佳地，在所述步 骤2)中，还加入二硫键还原剂，以及少量水以溶解所述二硫键还原剂。二硫键还原 剂更能促进二硫键的破坏。

由于粉碎家禽羽毛是为了和离子液体及二硫键还原剂充分接触，因此其粉碎程度 没有限制，但是越小越好；另外，步骤2)中加入少量水是为了溶解所述二硫键还原 剂，量是越少越好。

所述二硫键还原剂可以是任何二硫键还原剂。较佳地，所述二硫键还原剂是亚硫 酸氢钠(NaHSO₃)。

所述家禽羽毛和所述二硫键还原剂的质量比没有限制，可以是任何合适的比例。 较佳地，所述家禽羽毛和所述二硫键还原剂的质量比为1∶0.3～1∶1.5。

为了充分利用水不溶性离子液体和未溶解家禽羽毛，较佳地，所述的方法还包括：

31)在分离出水相后剩余的水不溶性离子液体中，存在部分未溶解的家禽羽毛， 另外补加干燥粉碎的家禽羽毛，并补加水不溶性离子液体，在70℃～100℃下搅拌3～ 6小时；

32)进行步骤3)。

为了更加充分利用水不溶性离子液体和未溶解家禽羽毛，上述步骤31)和32)可 以不断重复，因此，较佳地，所述的方法还包括：

33)重复步骤31)和32)。

为了得到较纯的角蛋白溶液，较佳地，所述的方法还包括：

4)将所述粗角蛋白溶液经过透析脱盐纯化得到精制的角蛋白溶液。

在本发明的第二方面，提供了一种家禽羽毛角蛋白溶液，其特点是，由上述的采 用水不溶性离子液体提取家禽羽毛角蛋白的方法提取得到。

本发明的有益效果在于：本发明的采用水不溶性离子液体提取家禽羽毛角蛋白的 方法，通过将粉碎的家禽羽毛和水不溶性离子液体在70℃～100℃下搅拌3～6小时， 然后加水、离心后形成水不溶性离子液体/未溶解家禽羽毛/水三相系统，分离出水相， 即得到粗角蛋白溶液，同时回收了水不溶性离子液体，角蛋白分离简单，离子液体回 收方便，且环境友好，适于大规模推广应用。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明内容，特举以下实施例详细说明。下列实施例中均 采用红外光谱、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对提取的角蛋白的结构、分子量进行表征：

1、红外光谱分析

采用红外光谱扫描仪测定本发明提取的角蛋白的红外光谱，并进行数据分析，在 3080cm^-1附近有多肽(-CO-NH-)的特征吸收峰，在1651cm^-1、1542cm^-1、1236cm^-1处 的三个吸收峰，分别为角蛋白分子的酰胺I、II、III带的特征吸收峰。可以看出，角 蛋白中存在蛋白质的特征官能团肽键的吸收。

2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对提取的角蛋白的分子量分布进行考察，发现 角蛋白分子量主要分布在14kDa～29kDa。

实施例1  离子液体[HOEMIm]NTf₂在水中溶解度的测定

1)离子液体的全波长扫描

准确称取50mg离子液体[HOEMIm]NTf₂(中科院兰州物化所，纯度＞99％)置于 容量瓶中，加入去离子水定容，配成1.0mg/mL标准溶液。用去离子水为空白参比在 190-300nm波长范围内进行全波长扫描，可得到该离子液体的最大吸收峰为217.5nm。

2)离子液体标准曲线的测定

分别取7支试管，加已配好的1.0mg/mL离子液体[HOEMIm]NTf₂溶液0、0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5及0.6mL，各管用去离子水补加至总体积为5mL，得到待测液。以去离 子水为参比，在最大吸收波长217.5nm下，依次测定标准离子液体样品的吸光度，并 绘制标准曲线。

3)离子液体在水中溶解度的测定

准确称取1.0g离子液体[HOEMIm]NTf₂置于15mL的离心套管中，然后加入2.5mL 去离子水，在涡旋混合器上搅动混合30分钟，最后离心(4000r/min)15分钟。用移液 枪取10μL的上相溶液稀释至25mL，测样品的吸光度与标准曲线相比较，计算得到离 子液体在水中的溶解度为7.941g/100mL。

实施例2～11采用离子液体提取鸡毛角蛋白

实施例2～11采用的基本流程如下：

1)称取1g粉碎的鸡毛置于圆底烧瓶中，向其中加入一定质量的水不溶性离子液体 [HOEMIM][NTf₂]、亚硫酸氢钠和500μL去离子水，在70℃～100℃下机械搅拌反应 3～6h；

2)反应结束后，首先向反应混合物中加入适量的去离子水，离心后形成水不溶性离 子液体/未溶解鸡毛/水三相系统，分离出水相；然后用去离子水洗涤容器三次，得 到的洗涤液和离心后分离的水相一起过滤，得到粗角蛋白溶液；最后水不溶性离 子液体(含有少量的未溶解鸡毛)的回收率可用烘干至恒重而得；

3)粗蛋白质溶液经透析(Mw6000～8000)得到较纯的角蛋白溶液，利用考马斯亮 蓝法测蛋白质溶液浓度，计算蛋白质产率；

4)向步骤2)中剩余的反应体系，加入1G粉碎的鸡毛、亚硫酸氢钠和500μL去离子水， 再补加少量的水不溶性离子液体，在70℃～90℃下机械搅拌反应3～6h；

5)重复步骤2)、3)、4)五次。

本发明中，蛋白质产率＝w(提取的蛋白质)/w(加入的鸡毛)×100％。

实施例2～11的不同之处在于：

实施例2：加20g水不溶性离子液体、0.3g亚硫酸氢钠，补加约1.0g水不溶性离子 液体，80℃下反应4h，加10mL去离子水分离提取的角蛋白。经计算，本实施例提取 的角蛋白产率分别为12.65％、12.56％、12.60％、12.57％、12.48％，离子液体的回收 率每次可达约95％。

实施例3：加20g水不溶性离子液体、1.0g亚硫酸氢钠，补加约1.0g水不溶性离子 液体，80℃下反应4h，加10mL去离子水分离提取的角蛋白。经计算，本实施例提取 的角蛋白产率分别为16.23％、16.43％、16.35％、16.28％、16.37％，离子液体的回收 率每次可达约95％。

实施例4：加20g水不溶性离子液体、1.5g亚硫酸氢钠，补加约1.0g水不溶性离子 液体，80℃下反应4h，加10mL去离子水分离提取的角蛋白。经计算，本实施例提取 的角蛋白产率分别为17.01％、17.08％、17.04％、17.09％、17.00％，离子液体的回收 率每次可达约95％。

实施例5：加40g水不溶性离子液体、1.0g亚硫酸氢钠，补加约2.0g水不溶性离子 液体，80℃下反应4h，加20mL去离子水分离提取的角蛋白。经计算，本实施例提取 的角蛋白产率分别为21.58％、21.14％、22.19％、20.91％、21.51％，离子液体的回收 率每次可达约95％。

实施例6：加50g水不溶性离子液体、1.0g亚硫酸氢钠，补加约2.5g水不溶性离子 液体，80℃下反应4h，加25mL去离子水分离提取的角蛋白。经计算，本实施例提取 的角蛋白产率分别为21.23％、21.53％、21.37％、21.24％、21.29％，离子液体的回收 率每次可达约95％。

实施例7：加40g水不溶性离子液体、1.0g亚硫酸氢钠，补加约2.0g水不溶性离子 液体，70℃下反应4h，加20mL去离子水分离提取的角蛋白。经计算，本实施例提取 的角蛋白产率分别为14.65％、14.83％、14.77％、14.68％、14.73％，离子液体的回收 率每次可达约95％。

实施例8：加40g水不溶性离子液体、1.0g亚硫酸氢钠，补加约2.0g水不溶性离子 液体，100℃下反应4h，加20mL去离子水分离提取的角蛋白。经计算，本实施例提取 的角蛋白产率分别为19.07％、19.31％、19.20％、19.14％、19.16％，离子液体的回收 率每次可达约95％。

实施例9：加40g水不溶性离子液体、1.0g亚硫酸氢钠，补加约2.0g水不溶性离子 液体，80℃下反应3h，加20mL去离子水分离提取的角蛋白。经计算，本实施例提取 的角蛋白产率分别为17.07％、17.21％、17.15％、17.22％、17.18％，离子液体的回收 率每次可达约95％。

实施例10：加40g水不溶性离子液体、1.0g亚硫酸氢钠，补加约2.0g水不溶性离 子液体，80℃下反应6h，加20mL去离子水分离提取的角蛋白。经计算，本实施例提 取的角蛋白产率分别为16.70％、16.77％、16.74％、16.82％、16.59％，离子液体的回 收率每次可达约95％。

实施例11：加20g水不溶性离子液体，不加亚硫酸氢钠，补加约1.0g水不溶性离 子液体，80℃下反应4h，加10mL去离子水分离提取的角蛋白。经计算，本实施例提 取的角蛋白产率分别为7.86％、7.92％、7.88％、7.83％、7.80％，离子液体的回收率每 次可达约95％。

可见，在不加入二硫键还原剂时，同样可以提取角蛋白，且离子液体的回收率 每次可达约95％，但是和实施例2加入二硫键还原剂相比，蛋白质的提取率较低，说 明二硫键还原剂能明显促进二硫键的破坏。

因此，本发明通过采用一种与水互不相溶的离子液体从家禽羽毛中提取角蛋白， 提取角蛋白的化学机理是通过离子液体的超极性破坏羽毛角蛋白中的相互作用力，如 氢键、盐键、二硫键等，再用二硫键还原剂促进二硫键的断裂，最终使羽毛充分溶胀 至溶解，由于提取的角蛋白易溶于水而离子液体不溶于水，因此，溶解后加入水就可 以达到角蛋白的分离和离子液体的回收利用，得到角蛋白水溶液。需要说明的是，由 于禽类羽毛的相似性，本发明的采用水不溶性离子液体提取家禽羽毛角蛋白的方法不 局限于提取家禽羽毛角蛋白，显然还适于提取其它禽类羽毛角蛋白。

综上所述，采用本发明的采用水不溶性离子液体提取家禽羽毛角蛋白的方法，角 蛋白分离简单，离子液体回收方便，且环境友好，适于大规模推广应用。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作 出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的 而非限制性的。