多发性硬化症继发的自身免疫疾病的诊断和治疗的方法和组合物

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背景技术

多发性硬化症(“MS”)是一种中枢神经系统的炎症性自身免疫疾病 (Compston和Coles，Lancet 372，1502-17(2008))。MS是造成年轻人神经 障碍的最常见原因，发生率大约是1/1000(Polman和Uitdehaag，BMJ321， 490-4(2000))。MS涉及免疫系统的参与、轴突和神经胶质细胞的急性炎 症损伤、功能的恢复和结构性修复、炎症后神经胶质增生以及神经退行 性病变(见，例如，Compston和Coles，2008)。这些连续的过程是临床 进程的基础，特征为痊愈期、持续缺陷遗留期和继发性疾病的发生。同 上。

MS治疗的目标是减少复发的频率和严重程度、防止疾病发展引起 的残疾以及促进组织修复(Compston和Coles，2008)。治疗MS最主要 的方法是对免疫系统的调节和抑制。目前可用的MS药物包括干扰素 β-1a(例如，AVONEX和REBIF)、干扰素β-1b(例如，BETASERON)、 醋酸格拉替雷(glatiramer acetate，例如，COPAXONE)、米托蒽醌(例 如，mitoxantrone，NOVANTRONE)和那他珠单抗(natalizumab，例如， TYSABRI)。另一有前景的MS新药是阿伦单抗(alemtuzumab， CAMPATH-1H)。

阿伦单抗是导向CD52——一种广泛分布于淋巴细胞和单核细胞表 面、但功能未知的蛋白的人源化单克隆抗体。阿伦单抗已经被用于治疗 B细胞慢性淋巴细胞性白血病。一次性的治疗导致快速的、完全的、持 续的淋巴细胞减少症。细胞数量恢复但是速度不一；CD4+T细胞恢复速 度尤其慢，持续消减至少五年(Coles等人，Journal of Neurology 253， 98-108(2006))。第2阶段试验(CAMMS-223研究组；Coles等人，N. Engl.J.Med.359，1786-1801(2008))已经表明阿伦单抗在治疗早期复发 缓解型多发性硬化症中高度有效。相对于干扰素β，该药物减少了超过 70％的早期复发缓解型患者疾病活跃和残疾积聚的风险。主要的不利作 用是自身免疫，其源自给药后数月到数年的T细胞淋巴细胞减少症的发 生。约20％到30％的患者患上了甲状腺自身免疫，主要是格雷夫斯病 (Coles等人，Lancet 354，1691-1695(1999))，3％具有免疫性血小板减少 性紫癜(ITP)(Coles等人，2008)。另外观察到古德帕斯彻病 (Goodpasture’s disease)、自身免疫性嗜中性白血球减少症(Coles等人， Journal of Neurology，253，98-108(2006))、自身免疫性溶血性贫血(未发 表的观察结果)的个别病例。此外，另外5.5％的患者生成了没有临床疾 病的持续的非甲状腺自身抗体(Coles等人，2006)。阿伦抗体治疗后的 自身免疫发生时间和范围和其他临床案例中的“重建自身免疫”的例子 相似；比如说，在造血干细胞移植或者对HIV的抗反转录病毒治疗后， 自身免疫性甲状腺病和自身免疫性血细胞减少症也居支配地位达数月 至数年(Chen等人，Medicine(Baltimore)84，98-106(2005)；Daikeler和 Tyndall，Best.Pract.Res.Clin.Haematol.20，349-360(2007)；Jubault等人， J.Clin.Endocrinol.Metab.85，4254-4257(2000)；Ting，Ziegler和Vowels， Bone Marrow Transplant.21，841-843(1998)；Zandman-Goddard和 Shoenfeld，Autoimmum.Rev.1，329-337(2002))。

尽管在淋巴细胞减少症中发生的自身免疫在动物模型中得以很好 的认知，但它很少在人身上遇到，因此很难进行研究。大多数淋巴细胞 减少的被试者不会发生自身免疫，这表明另外的因素被涉及其中 (Krupica等人，Clin Immunol 120，121-128(2006))。这些另外的因素是 什么尚不清楚。T调节细胞的缺失已被视作一个因素，就像在鼠科大肠 炎和胃炎模型中所见(Alderuccio等人，JExp.Med 178，419-426(1993)； McHuge等人，J Immunol 168，5979-5983(2002)；Powrie等人，Int. Immunol 5，1461-1471(1993)；Sakaguchi等人，J Immunol 155，1151-1164 (1995))。然而，已经观察到，人患者的T调节细胞在阿伦单抗治疗后增 加，其后回到正常水平(Cox等人，Eur J Immunol 35，3332-3342(2005))。 这种现象之后还得以重复(Bloom等人，Am J Transplant.8，793-802 (2008))，而且和其他实验性淋巴细胞减少模型一致(de Kleer，I.等人， Blood 107，1696-1702(2006)；Zhang，H.等人，Nat Med 11，1238-1243 (2005))。

发明内容

我们已经发明了新的、有用的用于改善MS治疗中风险控制(risk  management)的方法和组合物来。该方法和组合物减少MS治疗的副作 用，例如继发性自身免疫，并有助于医疗服务提供者和患者选择MS治 疗和治疗后监控的方案。本发明的方法和组合物以我们的如下发现为基 础：在多发性硬化症(MS)患者中，升高的IL-21，甚至在淋巴减少疗 法例如阿伦单抗疗法之前便可检测到的，与治疗后增加的继发性免疫发 生风险相关。我们已进一步发现，个体的IL-21水平可能是遗传决定的： 即SNP rs13151961的A/A、SNP rs6822844的G/G和SNP rs6840978的 C/C的单核苷酸多态性(SNP)基因型与IL-21升高相关。

因此，本发明提供用于识别与没有自身免疫疾病的被试者相比较白 细胞介素-21(IL-21)升高的MS患者的方法。在一些实施方式中，该 方法包括如下步骤：测定MS患者血样中的IL-21，从而识别出与所述 被试者相比较IL-21升高的MS患者。另外可选地，该方法包括如下步 骤：对患者进行基因分型，以检测患者中一种或多种例如选自SNP  rs13151961的A/A、SNP rs6822844的G/G和SNP rs6840978的C/C的 与IL-21升高相关的单核苷酸多态性(SNPs)基因型的存在或不存在， 其中一种或多种所述基因型的存在与IL-21升高相关。

本发明进一步提供用于识别在淋巴细胞减少(lymphocyte depletion) 后发生继发性自身免疫疾病的风险增加的MS患者的方法。在一些实施 方式中，该方法包括如下步骤：(例如通过测定)确定MS患者血样中 白细胞介素-21(IL-21)的水平，其中与没有自身免疫疾病的被试者相 比较IL-21的水平升高表明，该患者与IL-21没有升高的患者相比较， 发生继发性自身免疫疾病的风险增加。另外可选地，该方法包括如下步 骤：(例如通过基因分型)确定患者中一种或多种例如选自SNP  rs13151961的A/A、SNP rs6822844的G/G和SNP rs6840978的C/C的 与IL-21升高相关的单核苷酸多态性(SNPs)基因型的存在或不存在， 其中一种或多种(例如，两种或三种)所述基因型的存在与相对于没有 所述一种或多种基因型的MS患者来说发生继发性自身免疫疾病的风险 的增加相关。这些方法任选地包括告知患者和/或其医疗服务提供者所述 风险增加的步骤，和/或记录风险的增加的步骤。

本发明进一步提供用于筛选或识别在淋巴细胞减少治疗后需要加 强对于发生继发性自身免疫疾病的监控的MS患者的方法。这些方法可 以包括如下步骤：测定MS患者血样中的IL-21，其中与没有自身免疫 疾病的被试者相比较所述患者中IL-21的升高表明，该患者与IL-21没 有升高的患者相比较，需要加强对于发生继发性自身免疫疾病的监控。 另外可选地，该方法可以包括如下步骤：对患者进行基因分型，以检测 患者中一种或多种例如选自SNP rs13151961的A/A、SNP rs6822844的 G/G和SNP rs6840978的C/C的与IL-21升高相关的SNP基因型的存在 或不存在，其中一种或多种所述SNPs的存在表明，该患者与没有所述 一种或多种基因型的MS患者相比较，需要加强对于发生继发性自身免 疫疾病的监控。这些方法任选地包括告知患者和/或其医疗服务提供者对 于加强监控的需要的步骤，和/或记录该需要的步骤。

本发明还提供用于告知(inform)对MS患者的治疗的方法，包括 如下步骤：测定所述患者血样中的IL-21或对患者进行基因分型以确定 前述三种SNP基因型的存在或不存在，和选择适合于IL-21测定结果或 基因型的治疗方案。

本发明提供对已知对其有需要的患者进行MS治疗的方法，包括如 下步骤：(a)获取或确定以下信息：(i)患者血样中的IL-21(例如，测 定样品中的IL-21)；或(ii)一种或多种例如选自SNP rs13151961的A/A、 SNP rs6822844的G/G和SNP rs6840978的C/C的与IL-21升高相关的 单核苷酸多态性(SNPs)基因型的存在或不存在(例如，通过对患者进 行基因分型)；(b)以多发性硬化症的治疗剂为所述患者给药，和(c) 任选地监控患者继发性自身免疫疾病的发生。在一些实施方式中，该治 疗方法被用于经发现IL-21水平正常和/或没有任一前述三种IL-21SNP 基因型的患者。本发明还包括这些治疗方法中使用的抗-CD52抗体(例 如，阿伦单抗或在生物学上类似的药剂)，或其抗原结合部位，以及这 些抗体或抗原结合部位在用于这些治疗方法的药物的制造中的用途。本 发明进一步包括使用这些治疗方法的治疗方案。

本发明提供用于减少在已经或将要以淋巴细胞减少疗法治疗的多 发性硬化症患者中继发性自身免疫疾病的发生或严重程度的方法，其中 继发性自身免疫疾病在以淋巴细胞减少疗法治疗之后发生，所述方法包 括如下步骤：例如，在以淋巴细胞减少疗法治疗之前、之中或之后，以 IL-21拮抗剂给药。本发明还包括这些方法中使用的IL-21拮抗剂(例如， 抗-IL-21或抗-IL-21受体抗体，或者其抗原结合部位；或可溶性IL-21 受体)，以及这些IL-21拮抗剂在用于这些治疗方法的药物的制造中的用 途。

本发明提供用于评价多发性硬化症患者中对以淋巴细胞减少疗法 治疗的T细胞应答的方法，包括测定在所述疗法之后获自所述患者的T 细胞中的胱天蛋白酶(caspase)-3，其中与没有接受所述疗法的MS患者 相比较所述T细胞中胱天蛋白酶-3的增加是对所述疗法的T细胞应答的 指示。上述测定可能需要确定胱天蛋白酶-3或者编码胱天蛋白酶-3的核 酸的量或浓度。

本发明提供用于告知MS患者在淋巴细胞减少后发生继发性自身免 疫疾病的风险增加的方法，包括如下步骤：从MS患者血样中获取或确 定关于白细胞介素-21(IL-21)的信息，其中与没有自身免疫疾病的被 试者相比较IL-21升高表明，该患者与IL-21没有升高的MS患者相比 较，发生继发性自身免疫疾病的风险增加；和告知患者风险增加或没有 增加。另外可选地，该方法包括获取或确定关于一种或多种前述IL-21 基因型的存在或不存在的信息，而不是关于血液IL-21水平的信息。因 此，本发明还提供用于告知MS患者在淋巴细胞减少治疗后需要或不需 要加强对于发生继发性自身免疫疾病的监控的方法，该方法基于患者的 IL-21水平或上述IL-21基因型的存在或不存在。

本发明提供用于获知对淋巴减少疗法后的MS患者进行监控的方案 的方法，包括如下步骤：获取或确定如下信息：(i)患者血样中的IL-21； 或者(ii)一种或多种例如选自SNP rs13151961的A/A、SNP rs6822844 的G/G和SNP rs6840978的C/C的与IL-21升高相关的单核苷酸多态性 (SNPs)基因型的存在或不存在；和基于上述信息选择适合于该患者的 监控方案。适合的监控方案可以包括，例如，测定患者的自身抗体。

本发明在MS治疗的风险管理上提供了有利条件。例如，本发明提 供用于为患者分配淋巴细胞减少药物以治疗多发性硬化症的方法，包括 如下步骤：为患者提供关于在以所述药物治疗后发生继发性自身免疫疾 病的风险增加的咨询，其中风险增加与如下因素相关：(1)IL-21升高； 或(2)一种或多种例如选自SNP rs13151961的A/A、SNP rs6822844 的G/G和SNP rs6840978的C/C的与IL-21升高相关的单核苷酸多态性 (SNPs)基因型的存在；和任选地在获得患者的知情同意书之后，在所 述咨询后为患者提供药物。

本发明进一步提供用于识别与没有任何已知炎症状况的被试者相 比较白细胞介素-21(IL-21)可能升高的患者的方法，包括如下步骤： 对个体进行基因分型，以检测一种或多种例如选自SNP rs13151961的 A/A、SNP rs6822844的G/G和SNP rs6840978的C/C的与IL-21升高相 关的单核苷酸多态性(SNPs)基因型的存在或不存在，其中一种或多种 所述基因型的存在与IL-21的升高相关。

在本发明中，淋巴细胞减少可以由靶向CD52的治疗导致，例如， 用抗-CD52抗体(例如单克隆抗体)或其抗原结合部位治疗。抗-CD52 抗体可以是阿伦单抗或在生物学上类似的药剂，例如与阿伦单抗竞争结 合CD52的抗体。

在本发明的方法中，IL-21测定可能需要测量(例如，检测/量化) 样品中IL-21或编码IL-21的核酸的量或浓度，或者样品中在生成IL-21 的细胞(例如，Th17细胞)中编码IL-21的mRNA的量或浓度。在一 些实施方式中，使用例如细胞因子染色和流式细胞术对细胞内IL-21进 行测量。在一些实施方式中，使用例如酶联免疫吸附测定(ELISA)对 血清IL-21进行测量。本发明还包括用于检测人被试者中IL-21水平的 ELISA试剂盒，其包括抗-IL-21抗体、或其抗原结合部位、或可溶性IL-21 受体。该试剂盒可以进一步包括指导使用者从人被试者取血样的说明 书。

在本发明的方法中，IL-21信息(包括测量结果或基因分型)可以 在MS疗法之前、之中或之后获取。本发明的方法可以用于任何MS形 式的情况中，包括但不仅限于复发-缓解型多发性硬化症、原发进展型多 发性硬化症和继发进展型多发性硬化症。

本发明还提供用于治疗多发性硬化症的试剂盒，其包括淋巴细胞减 少治疗剂(例如，抗-CD52抗体如阿伦单抗)；和告知患者或医疗服务 提供者在用所述药物治疗之后发生继发性自身免疫疾病的风险增加的 可能性的书面说明书，其中风险的增加由以下因素指示或与其相关：(i) IL-21升高，或者(ii)一种或多种例如选自SNP rs13151961的A/A、 SNP rs6822844的G/G和SNP rs6840978的C/C的与IL-21升高相关的 单核苷酸多态性(SNPs)基因型的存在。

本发明进一步提供用于识别在淋巴细胞减少之后发生继发性自身 免疫疾病的风险增加的MS患者的试剂盒，其包括抗-白细胞介素-21 (IL-21)抗体；和一种或多种用于检测所述抗体与MS患者血样中的 IL-21的结合的试剂。本发明还提供用于识别在淋巴细胞减少之后发生 继发性自身免疫疾病的风险增加的MS患者的试剂盒，其包括一种或多 种适合于识别个体样品中的一种或多种选自SNP rs13151961的A/A、 SNP rs6822844的G/G和SNP rs6840978的C/C的单核苷酸多态性 (SNPs)基因型的试剂。

本发明的其他特征和优点从以下附图和具体实施方式来看将是显 而易见的。

附图说明

图1A中的图表示未刺激的(Unstim)、或者用髓磷脂碱性蛋白 (MBP)或促甲状腺激素受体(TSHr)培养的来自健康对照(HC)、未 经治疗的患者(Pre)、阿伦单抗治疗后以3个月为间隔的患者的T细胞 的前体频率(PF)。(^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)

图1B中的图表示未刺激的(Unstim)、或者用髓磷脂碱性蛋白 (MBP)或促甲状腺激素受体(TSHr)培养的来自健康对照(HC)、未 经治疗的患者(Pre)、阿伦单抗治疗后以3个月为间隔的患者的T细胞 的增殖指数(PI)。(^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)

图1C中的图表示未刺激的(Unstim)、或者用髓磷脂碱性蛋白 (MBP)或促甲状腺激素受体(TSHr)培养的来自健康对照(HC)、未 经治疗的患者(Pre)、阿伦单抗治疗后以3个月为间隔的患者的培养10 天后的成活T细胞的总数。(^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)

图1D中的图表示来自健康对照(HC)、未经治疗的患者(Pre)、 阿伦单抗治疗后以3个月为间隔的患者的应答于未经刺激或者用MBP 或TSHr在培养基中培养后的T细胞凋亡百分比。(^*p＜0.05，^**p＜0.01， ^***p＜0.001)

图1E中的点图和柱状图表示健康对照、阿伦单抗治疗前的患者和 以3个月为间隔的阿伦单抗治疗后的患者的被动T细胞凋亡(^*p＜0.05， ^**p＜0.01，^***p＜0.001)

图1F中的点图和柱状图表示健康对照、阿伦单抗治疗前的患者和 以3个月为间隔的阿伦单抗治疗前后患者的Fas介导的T细胞凋亡 (^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)

图1G中的图表示健康对照、治疗前的患者和阿伦单抗治疗后9个 月的患者的被动CD4+和CD8+T细胞凋亡(^*p＜0.05，^**p＜0.01， ^***p＜0.001)

图1H中的图表示健康对照、治疗前的患者和阿伦单抗治疗后9个 月患者的Fas介导的CD4+和CD8+T细胞凋亡(^*p＜0.05，^**p＜0.01， ^***p＜0.001)

图2A-2C中的图分别表示在(A)CD3+T细胞、(B)CD14+单核 细胞和(C)CD19+B细胞中，来自体内便立刻测量或者在用MBP刺激 或进行多克隆刺激(抗-CD3/28抗体)之后的相对于β-肌动蛋白mRNA 表达的胱天蛋白酶3mRNA的表达(^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)

图3中的点图和柱状图表示阿伦单抗治疗后的自身免疫性与过度的 T细胞凋亡相关。在没有自身免疫者(Ge等人，Proceedings of the National  Academy of Sciences of the United States of America 101，3041-3046 (2004))或具有继发性自身免疫者(Ge等人，2004)中的被动的(Un)、 Fas介导的、或响应于MBP或TSHr刺激的T细胞凋亡百分比以独立的 点显示。(^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)

图4A和4B中的点图和柱状图表示rhIL-21在体外诱导T细胞凋亡， 其显示，分别为未经刺激或经多克隆刺激(抗-CD3/CD28)的(A)CD4+T 细胞和(B)CD8+T细胞以依赖于剂量的模式响应于rhIL-21而凋亡。 (^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)

图5A-5D中的图表示rhIL-21诱导T细胞体外增殖。图5A中的图 表示未经刺激的CD4+和CD8+T细胞响应于rhIL-21的增殖指数。图 5B中的图表示多克隆刺激(抗-CD3/CD28)的CD4+和CD8+T细胞响 应于rhIL-21的增殖指数。图5C中的图表示未经刺激的CD4+和CD8+T 细胞响应于rhIL-21的前体频率。图5D中的图表示多克隆刺激的CD4+ 和CD8+T细胞响应于rhIL-21的前体频率。(^*p＜0.05，^**p＜0.01， ^***p＜0.001)

图5E中的图显示在不存在rhIL-21或响应于rhIL-21的情况下，不 同通道中未经刺激的或多抗刺激(抗-CD3/CD28)的CD4+和CD8+细胞 的数量。

图6A中的图表示15名具有继发性自身免疫的患者和15名不具有 继发性自身免疫的患者在阿伦单抗治疗之前和之后的血清IL-21。 (^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)

图6B中的图表示非自身免疫患者(没有阿伦单抗治疗后的自身免 疫)和自身免疫患者(具有阿伦单抗治疗后的自身免疫)治疗前的血清 IL-21水平(pg/ml)。

具体实施方式

本发明以我们的如下发现为基础：在淋巴细胞减少疗法之后MS患 者继发性自身免疫的发生与患者的IL-21升高相关。我们已经发现，随 后发生治疗后继发性自身免疫的MS患者的IL-21甚至在治疗之前就比 标准高。我们还发现，在淋巴细胞减少疗法之后，相对于IL-21升高的 程度小得多的没有继发性自身免疫迹象的患者，前述患者的IL-21上升 得更加显著。因此，IL-21水平预示着MS患者在淋巴细胞减少疗法后 继发性自身免疫的发生。我们还发现，单核苷酸多态性(SNP)基因型 SNP rs13151961的A/A、SNP rs6822844的G/G和SNP rs6840978的C/C 与个体的IL-21升高相关；因此，对MS患者进行这些特定SNP基因型 的存在或不存在的基因分型也有助于预测该患者在淋巴细胞减少后发 生继发性自身免疫性的风险。

我们于1999年首次描述了在阿伦单抗(CAMPATH-1H)治疗中并 发的自身免疫性(Coles等人，1999)，并继续观察了日益被认为是治疗复 发缓解型多发性硬化症的高效疗法的这一并发症(Coles等人，J  Neurology 253，98-108(2006)；Coles等人，1999和2008)。将在后面描述 的本研究涉及一系列可得的患者群体，意在理解经阿伦单抗治疗的MS 患者的亚群中发生的这一无先例的人自身免疫“模型”。

在暴露于阿伦单抗后免疫状态从根本上得以改变。再生进入通过阿 伦单抗产生的淋巴细胞减少环境中的T细胞是高度增殖的，并且偏向于 自体反应。然而，这些细胞高度不稳定并且短命。尽管它们的结局事先 并没有被直接指定(King等人，Cell 117，265-277(2004))，我们表明这 些细胞正在通过凋亡而快速死亡。高度、持续的T细胞凋亡水平可能解 释了为什么尽管循环阿伦单抗的半衰期只有6天，而且血液学前体也没 有减少，但单一剂量的阿伦单抗却引发了持续数年的T细胞淋巴细胞减 少症(Gilleece等人，Blood82，807-812(1993))。

针对该背景，我们表明有继发性自身免疫的患者与没有自身免疫性 的患者相比较，T细胞凋亡的速率更高，但没有更严重的T细胞淋巴细 胞减少症，表明该群体中细胞循环加快。T细胞循环的干扰与血清IL-21 的表达显著升高相关，我们发现后者至少在一些病例中是遗传决定的。 而且，对与淋巴细胞减少症相关的自身免疫的易感性在淋巴细胞减少之 前便有所表现，其中治疗前的IL-21水平准确预测(大于70％的阳性预 测值，例如，83％，以及大于62％的阴性预测值，例如，72％)暴露于 阿伦单抗后数月至数年自身免疫的发生。无意拘泥于任何理论，我们相 信通过过度驱动T细胞扩增和死亡的周期，IL-21增加了T细胞遇到自 身抗原并破坏耐受性的随机机会，从而提高了自身免疫。

综上所述，我们的发现提供了人的淋巴细胞减少引发的自身免疫上 的首次探索，并提供了理解与淋巴细胞减少相关的自身免疫的概念框 架，其超出了以阿伦单抗治疗多发性硬化症的狭小范围。这一概念在于： 首先是治疗性淋巴细胞减少，其次是遗传限定的IL-21的超量产出，导 致了T细胞循环过度的状态及存活减少，这些促进了人的自身免疫。这 些发现为本发明提供了基础。

本发明提供当考虑例如阿伦单抗疗法的淋巴细胞减少疗法时管理 MS患者的方法。例如，我们的发明提供了用于识别与标准(例如，下 文所述的对照被试者的IL-21水平)相比较IL-21升高的MS患者的方 法，以及用于识别在淋巴细胞减少后发生继发性自身免疫的风险增加的 MS患者的方法。这些方法包括如下步骤：测定患者血样中的IL-21(例 如，细胞内或细胞外蛋白水平、RNA转录水平或IL-21活性水平；参见 下面的讨论)，和将该IL-21值与正常IL-21值进行比较。另外可选地， 替代或附加于血液测试，可以对患者进行一种或多种SNP rs13151961 的A/A、SNP rs6822844的G/G和SNP rs6840978的C/C单核苷酸多态 性(SNP)基因型的存在或不存在的基因分型，其中一种、两种或全部 三种基因型的存在与IL-21升高相关。如上所述，IL-21升高与在淋巴细 胞减少之后MS患者发生继发性自身免疫的风险相对于IL-21没有升高 的MS患者而增加相关。

通过本发明方法对患者进行识别可以后续有若干本发明预期的更 多步骤。例如，基于患者的IL-21水平或基因型，可以告知他/她在淋巴 细胞减少疗法后发生继发性自身免疫的风险增加，或者没有这种风险。 因而，本发明投入治疗之前将允许有针对治疗风险的个性化咨询。医疗 服务提供者可以就继发性自身免疫来考虑治疗的选择并提供建议，包 括，例如，在淋巴减少疗法之前、之中或之后，以IL-21拮抗剂给药， 或者选择不涉及淋巴细胞减少的治疗方案。

医疗服务提供者也可以为选择淋巴细胞减少疗法的患者考虑风险 管理计划。例如，考虑到患者发生继发性自身免疫风险的增加，医疗服 务提供者可以告知他/她需要在淋巴细胞减少疗法后加强对发生继发性 自身免疫的监控。医疗服务提供者也可以在淋巴细胞减少疗法后推荐合 适的监控方案。对处于风险中的患者合适的监控方案可以包括，但不限 于，在淋巴减少疗法后，以例如一周、两周、一个月、两个月、三个月、 六个月或一年的间隔，更加频繁地对继发性自身免疫进行监控。该监控 可能需要持续更长的时间，例如，超过一年、两年、三年、四年、五年 或更久，因为一些患者可能直至淋巴细胞减少疗法一年后才表现出继发 性自身免疫。加强监控也可能需要，例如，专家对继发性自身免疫的任 何征兆进行更彻底的医学检验(例如，更多的血液检测)。而且，在患 者IL-21水平升高并且/或者具有本文提到的与血清IL-21升高相关的特 定IL-21基因型的情况下，为患者分配淋巴细胞减少药物以治疗MS的 药剂师或者临床人员可能需要告知患者在用药后发生继发性自身免疫 的风险增加。药剂师和临床人员可能还需要在为患者分配药物之前从患 者处获得知情同意书。

多发性硬化症患者

本发明的方法和组合物可以用于任意形式的MS治疗，例如，缓解 -复发型MS、原发进展型MS和继发进展型MS。本发明针对的MS患 者是那些已经通过病史以及借助于例如核磁共振(MRI)、脊椎穿刺、 诱发电位测试和血样实验室分析的神经学检测而诊断出具有MS形式的 患者。

多发性硬化症(“MS”)也叫弥散性硬化症，是一种免疫系统攻击 中枢神经系统从而导致脱髓鞘的免疫环境(Compston和Coles，2008)。 MS破坏包裹并电隔离神经纤维的称作髓鞘的脂肪层。几乎任何神经性 症状都可以随此病出现，而且经常发展为生理和认知障碍(Compston 和Coles，2008)。MS有若干种形式。新的症状可以在不连续的发作中发 生(缓解型)，或者随时间慢慢积聚(进展型)(Lublin等人，Neurology 46 (4)，907-11(1996))。在病情发作之间，症状可能完全消失(缓解)，但 是永久性的神经问题经常发生，尤其随着疾病的发展(Lublin等人， 1996)。已经描述过若干亚型，或者进展的模式，它们对于预后和治疗 决定都很重要。1996年美国国家多发性硬化症协会(the United States  National Multiple Sclerosis Society)对四种亚型的定义进行了标准化：缓 解-复发、继发进展、原发进展和进展缓解(Lublin等人，1996)。

缓解-复发亚型的特征是称作恶化或复发的不可预期的急性发作， 之后数月到数年期间相对平静(缓解)，没有新的疾病活性迹象。这描 述了大多数MS个体的起始过程(Lublin.，1996)。

继发进展型MS开始于缓解-复发进程，但随后在急性发作之间发展 为进展型神经衰落，没有任何确切的缓解期，尽管可能会出现偶尔的复 发和小的缓解(Lublin等人，1996)。

原发进展亚型的特征是渐进且稳定的障碍进展，在他们最初的MS 症状出现后没有明显的缓解(Miller等人，Lancet Neurol 6(10)，903-12 (2007))。其特征为障碍的进展从发生开始就没有或只有偶尔或小的缓解 和改善(Lublin等人，1996)。原发进展亚型的发生年龄通常比其他亚型 的要晚(Miller等人，2007)。

进展缓解型MS的特征是伴随急性发作的稳定的神经衰落，可能或 可能没有伴随而来的一些恢复。这是以上这些亚型最不一致的地方 (Miller等人，1996)。

另外描述有不规范行为(non-standard behavior)的病例，有时将其 归为MS的临界形式(Fontaine，Rev.Neurol.(Paris)157(8-9Pt 2)： 929-34(2001))。这些形式包括视德维克病(Devic’s disease)，巴洛同心 圆性硬化症、希尔德弥散性硬化症和Marburg型多发性硬化症(Capello 等人，Neurol.Sci.25Suppl 4：S361-3(2004)；Hainfellner等人，J.Neurol. Neurosurg.Psychiatr.55(12)：1194-6(1992))。

多发性硬化症患者的淋巴细胞减少

如本文所用，“淋巴细胞减少”是一种由循环淋巴细胞例如T细胞 和/或B细胞减少引起的免疫抑制，从而造成淋巴细胞减少。例如，在 使用自体骨髓移植(BMT)或全淋巴照射治疗多发性硬化症时，可见长 期的淋巴消减。例如，参见Cox等人，Eur.J.Immunol.35，3332-3342 (2005)。例如，淋巴细胞减少可以通过胸腺细胞球蛋白(thymoglobulin)、 环磷酰胺和全身照射的结合使用而实现。MS患者的淋巴细胞减少也可 以通过许多的药物治疗来实现。例如，人源化抗-CD52的单克隆抗体 CAMPATH-1H(阿伦单抗)已经被用于淋巴细胞减少疗法以治疗MS患 者。已经显示CAMPATH-1H引起的淋巴细胞减少可以在临床上和放射 学上有效地减少中枢神经系统炎症(Coles等人，Ann.Neurol.46，296-304 (1999)；Coles等人，2008)。

其他药剂也可以用于淋巴细胞减少疗法以治疗MS患者。这些药剂 可以是那些引起淋巴细胞死亡或抑制淋巴细胞功能的药剂。它们包括， 但不限于，(1)靶向产生CD-52的细胞的药剂，例如在生物学上类似于 阿伦单抗的药剂，即像阿伦单抗一样与相同或不同的抗原决定基结合或 者与阿伦单抗竞争结合CD-52的其他抗-CD52抗体(例如，嵌合、人源 化或人抗体)，以及与细胞表面CD52竞争结合CD52配体的可溶性CD52 多肽；(2)靶向淋巴细胞表面分子的生物分子，例如肽、蛋白和抗体(例 如，嵌合、人源化或人抗体)，如抗-CD4抗体、抗-CD20抗体(例如， rituximab)、抗-TCR抗体和抗整联蛋白抗体(例如，natalizumab)；(3) 特异性或非特异性地释放到淋巴细胞的细胞毒素(例如，细胞凋亡诱导 剂、环磷酰胺、烷烃化剂和DNA嵌入剂)；和(4)前述抗体的抗原结 合部位。这些抗体可以包括，但不限于，单克隆抗体、双功能抗体、寡 克隆抗体和多克隆抗体。

本文所用的术语“抗原结合部位”是指抗体中的一个或多个片段， 所述片段保留有特异性地与该部位来源的整个抗体相同的抗原的能力。 “抗原结合部位”的例子包括，但不限于，Fab片段、F(ab’)2片段、Fd 片段、Fv片段、dAb片段、独立的互补决定区(CDR)、scFv和双抗体。 在本发明中有效的抗体及其抗原结合部位可以通过本领域公知的方法 制备。

上述任一中淋巴细胞减少疗法都可以造成淋巴细胞减少症，而且在 一些患者身上，淋巴细胞减少症会导致继发性自身免疫。

MS患者的继发性自身免疫

当自身免疫在首个(“原发性”)疾病如“原发性”自身免疫疾病之 后发生时，该自身免疫在此被称为“继发性自身免疫”。继发性自身免 疫有时在诸如淋巴细胞减少疗法之后具有或具有过淋巴细胞减少症的 MS患者身上发生。在一些个体中，继发性自身免疫发生在淋巴细胞减 少疗法(例如，阿伦单抗治疗)之后不久。在其他个体中，继发性自身 免疫可能直至淋巴细胞减少疗法后数月或数年后才发生；其中的一些个 体，到他们发生继发性自身免疫之时，实质性的淋巴细胞恢复(总淋巴 细胞总值)可能已经发生，因此他们可能不再是淋巴细胞减少性的。

淋巴细胞减少性MS患者发生的继发性自身免疫可以是MS之外的 任意类型的自身免疫病状，包括但不限于甲状腺自身免疫(例如，格雷 夫斯病)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、古德帕斯彻病、自身免疫 性溶血性贫血、自身免疫性嗜中性白血球减少症和自身免疫性淋巴细胞 减少症。诊断和监控这些自身免疫疾病的技术是本领域技术人员公知 的，其包括症状的评估和例如血样分析的医疗检验。本发明预计到任何 已知方法的使用。例如，患者体液(例如血液)中的自身抗体水平可以 确定是一种检测自身免疫迹象的手段。具体地，可以测量抗核抗体、抗 平滑肌抗体和抗线粒体抗体(anti-mitochrondrial antibodies)。在检测抗 核抗体的情况下，可以进行额外的化验以测定抗双链DNA抗体、抗核 糖核蛋白抗体和抗-La抗体。可以测量抗甲状腺过氧化酶(TPO)抗体 和抗促甲状腺激素(TSH)受体抗体，以检测自身免疫性甲状腺病；如 果检测抗-TPO或抗-TSH受体抗体，可以通过测定游离T3、T4和TSH 水平来测量甲状腺功能是否受到影响。可以测量抗血小板抗体，以检测 自体免疫溶血性贫血；并且血液血小板水平的测量结果可以用以确定抗 血小板抗体是否正在造成血小板数量的减少。

IL-21的测量

在本发明的方法中，可以通过多种技术测定IL-21。IL-21是与γ-c 相关的细胞因子家族中的一员，具有促进T细胞和B细胞增殖、以及天 然杀伤细胞(NK)细胞毒性的蛋白活性。IL-21主要在活化的CD4+T 细胞(例如，Th17)中表达，而且对T辅助细胞Th1的免疫应答非常 重要(Weiss等人，Expert Opin Biol.Ther.7，1705-1721(2007)； Sivakumar等人，Immunology 112，177-182(2004))。人IL-21基因编码一 种162个氨基酸残基的多肽前体和一种完全加工的133个氨基酸残基的 成熟蛋白(大约15kD)；该基因位于人染色体4q26-27上(Sivakumar 等人，2004)。已经在静息外周B细胞、活化的外周血液单核细胞上以及 在人淋巴结的生发中心发现了IL-21受体(IL-21R)(Marleau等人，J. Leukocyte Biol.78，575-584(2005))。

测量IL-21的方法是本领域技术人员公知的。根据本发明的一些实 施方式，从患者身上获得体液样品(例如，血液、血清、血浆、尿液、 唾液或脑脊髓液)，然后通过任何适合于蛋白检测的化验测定其中的 IL-21水平，包括但不限于，例如酶联免疫吸收测定(ELISA)之类的 免疫测定。测定人IL-21的商用ELISA试剂盒可以从，例如， KOMABIOTECH(首尔，韩国)、Bender MedSystems(伯灵格姆，加州) 和eBioscience(圣地亚哥，加州)得到。

另外可选地，可以通过RNA印迹(Northern blot)分析和定量聚合 酶链式反应(Q-PCR)对获自患者的生成IL-21的细胞(例如，Th17细 胞)的IL-21转录水平进行测量。分离Th17细胞的方法是本领域公知 的，而且该分离可以使用市售的试剂盒来进行，例如，Miltenyi Biotec (奥本，加州)、eBioscience(圣地亚哥，加州)的试剂盒。在一些实施 方式中，IL-21水平通过细胞因子染色和流式细胞术测定，其中使用与 可检测部分连接的抗-IL-21抗体来检测患者生成IL-21的细胞中的细胞 内IL-21水平。IL-21也可以通过生物化验测定活性，例如，通过用例如 CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)测定T细胞对IL-21和IL-15的组合 的增殖反应(Zeng等人，Curr.Protoc.Immunol.78：6.30.1-6.30.8(2007))。 另一种测定IL-21的方法以IL-21诱导的脾CD8(+)T细胞的Stat3酪氨 酸磷酸化为基础，使用基于流式细胞术的分析(Zeng等人，2007)。本领 域技术人员将会很容易地认识到其他适合于IL-21的测定手段。

在本发明的方法中，确定患者的IL-21是否升高(不正常地高)的 参考(或指标)值是指同时或在不同时间进行相同化验得到的对照被试 者的IL-21或一组对照被试者的IL-21平均值。对照被试者是正常或健 康的被试者，其没有任何正在发生的已知炎症，包括没有自身免疫疾病 (没有任何可检测的自身免疫疾病的症状)。在一些实施方式中，对照 被试者不是淋巴细胞减少的。IL-21水平升高大约10％、20％、30％、40％、 50％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50 倍、100倍或更多可以被视作显著升高。可以应用一些统计学分析来确 定检测样中的IL-21水平是否显著地区别于对照水平。这种统计学分析 是本领域技术人员公知的，可以包括，但不限于，参数(例如，双尾的 Student’s t-检验)或非参数(例如，Wilcoxon-Mann-Whitney U检验)检 验。

IL-21 SNP基因型的检测

在本发明的一些方法中，使用基因分型来预测患者在具有淋巴细胞 减少症的同时是否倾向于IL-21升高(即，处于该风险中或可能升高) 并因此处于发生继发性自身免疫的风险中。“基因分型”是指通过使用 生物化验来确定个体基因型的过程。基因分型的方法是本领域技术人员 公知的，包括但不限于，PCR、DNA测序、等位基因特异的寡核苷酸 (ASO)探针和基因芯片或珠的杂交。基因分型可以是不完全的，例如， 只有一小部分个体的基因型得以确定。在本发明中，只需要检测某些 SNP。SNP是在基因组的对应部位中单个核苷酸-A、T、C或G-在物种 的成员间或在个体中的成对染色体间不同时发生的DNA序列的变异。 已知的人SNP在位于美国国家生物技术中心(National Center for  Biotechnology Information，NCBI)的公开领域档案单核苷酸多态性数据 库(Sinele Nucleotide Polymorphism Database)中指定为reference SNP (refSNP或rs)识别号。

本发明已经发现，少数SNP基因型rs13151961A/A、rs6822844G/G 和rs6840978C/C与相对于没有这些基因型的个体来说血清IL-21水平显 著升高相关。因此，具有一种或多种这些SNP基因型的MS患者相对于 没有这些基因型的MS患者来说在淋巴细胞减少后对发生继发性自身免 疫的易感性增加。

获取IL-21信息的时机

获取MS患者的IL-21信息(IL-21水平或与IL-21相关的SNP基 因型)可用于为该患者选择治疗或治疗后监控的方案。在MS疗法之前 获得信息时，可以告知患者在淋巴细胞减少疗法后发生继发性自身免疫 的相对风险，并可以据此做出治疗的决定。若果患者被分类为“处于风 险中”的话，可可以告知患者需要加强治疗后的监控，例如，更加频繁 和更加彻底的专家检查。因此，IL-21信息改善了MS治疗的风险管理 (通过医师、药剂师和患者)。

在MS治疗之中或之后获取IL-21信息也将会有助于监控继发性自 身免疫的发生和治疗。如上所述及下文进一步讨论，我们已经发现，在 淋巴细胞减少疗法之后，继续发生继发性自身免疫的MS患者的血清 IL-21相对于不发生继发性自身免疫的患者来说要增加地多得多。后一 MS患者群体在淋巴减少后只产生略多的IL-21。因此，通过测定淋巴细 胞减少治疗后IL-21的生成，也可以预测可能在治疗之后数月或数年后 才发生的继发性自身免疫的风险。

治疗继发性自身免疫

多发性硬化症患者发生的继发性自身免疫疾病可以基于疾病的类 型进行治疗。在本发明的一些实施方式中，继发性自身免疫可以通过有 效剂量的IL-21拮抗剂来治疗。IL-21拮抗剂可以是抑制IL-21活性的治 疗剂，例如，抑制IL-21和IL-21R之间反应的药剂。“有效剂量”是指 足够抑制患者IL-21的活性使得继发性自身免疫疾病的症状得以减轻或 防止的抑制剂的量。IL-21拮抗剂可以是，例如，针对人IL-21或IL-21R 的嵌合、人源化或人单克隆抗体，或者可溶的IL-21R蛋白。另外参见， 例如，美国专利第7,410,780号和美国专利申请公开第20080241098号， 其全部教导内容在此并入作为参考。含有IL-21拮抗剂的药物组合物可 以根据本领域技术人员已知的方法制造。含有IL-21拮抗剂的药物组合 物可以用本领域已知的合适方法为患者给药，例如，静脉内给药、肌内 给药或皮下给药。

治疗和检测MS患者的试剂盒

本发明提供用于治疗MS的试剂盒。本发明的试剂盒可以包括，特 别是，淋巴细胞减少药物(例如，阿伦单抗)和用于告知患者或健康服 务提供者药物禁忌症的书面说明书，例如，药物治疗后发生继发性自身 免疫疾病的风险增加的可能性。风险增加可以与以下因素相关或通过其 指示：(i)IL-21升高，或(ii)一种或多种选自SNP rs13151961的A/A、 SNP rs6822844的G/G和SNP rs6840978的C/C的单核苷酸多态性基因 型(SNPs)的存在。

在其他的实施方式中，本发明提供用于检测MS患者的血清IL-21、 以及/或者用于识别在淋巴细胞减少后发生继发性自身免疫疾病的风险 增加的MS患者的试剂盒。这种试剂盒可以包括抗-IL-21抗体，或其抗 原结合部位，或可溶性IL-21受体，任选地包括指导使用者从患者身上 取血样的说明书，任选地包括一种或多种用于检测抗体、抗原结合部位 或可溶性IL-21受体与MS患者血样中的IL-21的结合的试剂。这种试 剂盒将会被相应监管机构批准生效以便为患者例如MS患者进行医疗诊 断。

在再其他的实施方式中，本发明提供用于识别在淋巴细胞减少后发 生继发性自身免疫疾病的风险增加的MS患者的试剂盒。该试剂盒可以 包括一种或多种适合于识别MS患者样品中一种或多种选自SNP rs13151961的A/A、SNP rs6822844的G/G和SNP rs6840978的C/C的 SNP基因型的存在或不存在的试剂，以及用于指导使用者从多发性硬化 症患者身上取样的说明书。

评价对MS治疗的T细胞应答

本发明提供用于评价MS患者中对以淋巴细胞减少疗法治疗的T细 胞应答的方法。该方法需要测定在治疗后获自患者的T细胞中的胱天蛋 白酶-3。与没有接受该治疗的MS患者的T细胞相比，T细胞中胱天蛋 白酶-3(胱天蛋白酶-3蛋白、RNA转录物，和/或活性水平)的增加指 示经治疗的患者的T细胞已经响应于该治疗。这些方法以我们的如下发 现为基础：未经治疗的具有MS人的T细胞是细胞凋亡耐受的，而这种 耐受性与胱天蛋白酶-3的表达不足(under-expression)相关。但是在淋 巴细胞减少疗法之后，胱天蛋白酶-3在T细胞中的表达显著增加，达到 健康人群中可见的水平。

测定T细胞中胱天蛋白酶-3的技术是本领域公知的。例如，可以使 用本领域公知的技术从T细胞中获得细胞提取物，并通过例如ELISA测 定胱天蛋白酶-3蛋白的水平。测量人胱天蛋白酶-3的商用ELISA试剂盒 可获自，例如，Bender MedSystems(伯灵格姆，加州)、EMD Chemicals， Inc.(圣地亚哥，加州)和R&D Systems，Inc.(明尼阿波利斯，明尼苏达 州)。另外可选地，可以通过例如RNA印迹(Northern blot)分析或定量 PCR的方法测量T细胞中的胱天蛋白酶-3转录水平。也可以通过，例如， 测量其蛋白酶活性在生物化验中测量胱天蛋白酶-3的活性。测量胱天蛋 白酶-3活性的商用试剂盒可以获自，例如RocheApplied Science(印第 安纳波利斯，印第安纳州)和Invitrogen(卡尔斯巴德，加州)得到。

除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语均与本发明所属领 域普通技术员通常理解的含义相同。下文描述了示范性的方法和材料， 但与本文所述者相似或等同的方法和材料也可以用于本发明的实施或试 验。本文提及的所有出版物和其他参考文献均全文并入作为参考。在有 抵触的情况下，以本说明书，包括定义为准。尽管本文引用了若干文件， 但该引用并不构成对这些文件形成本领域公知常识一部分的认可。在本 说明书和实施方式中，通篇中的“包括”或变形例如“包含”或含有“将 要理解成意味着包括所述的整体或一组整体，而并不排除任何其他的整 体或一组整体。材料、方法和实施例都只是说明性的，而无意进行限定。

以下的实施例意在说明本发明的方法和材料。在本发明的精神和范 围内对所述的条件和参数进行本领域常见的适当修正和修改对本领域技 术人员来说将会是显而易见的。

实施例

在以下实施例中，所有患者都患有缓解-复发型多发性硬化症，并且 是以下两个临床试验中一个的参与者：CAMMS-223和CAMMS-224 (REC 02/315和03/078)，其中通过12-24mg/天的静脉滴注给予阿伦单 抗5天，之后在12个月进行再治疗。患者和对照均同意以研究为目的的 静脉切放血术(LREC 02/263)，并且在取血样前至少一个月均不暴露于 包括类固醇在内的其他疾病调节剂。

淋巴细胞增殖和凋亡的数据通过对65名患者和21名健康对照(7 名男性，平均年龄34岁)的新鲜体外细胞的横断面研究生成。由此形 成了关于继发性自身免疫发病机制中T-细胞循环的假设，其在于阿伦单 抗治疗9个月后可得的样品中试验，选择上述时间点作为可以有力地分 析T细胞凋亡的最早时间点。在该时间点可得的29份样品当中，10份 符合我们对自身免疫的研究定义(1名男性，平均年龄36岁)，其与10 份没有自身免疫的(3名男性，平均年龄38岁)相比较。自身免疫被定 义为一种新的自身免疫疾病的发生(有或没有自身抗体)，或者没有临 床疾病的持续显著的自身抗体滴度(至少三个月间隔至少在两种情形下 存在)。“没有自身免疫”定义为在该研究中阿伦单抗治疗后至少18个 月没有自身免疫疾病和自身抗体。在10名具有自身免疫的患者中，仅 有三名具有自身抗体(抗核抗体)。接下来，对以下患者连续测定血清 IL-21：随机选择的15名具有自身免疫的患者-其中5名已经在上面被研 究过(3名男性，平均年龄34岁；12名有甲状腺自身免疫，1名有古德 帕斯彻病，1名有ITP，1名仅有抗核抗体)、随机选择的15名没有自身 免疫的患者-其中6名已经在上面被研究过(5名男性，平均年龄31岁) 和19名健康对照(7名男性，平均年龄33岁)。

对73位被试者加以研究以进行基因分析。其中，23名符合“没有 自身免疫”的定义，27名在阿伦单抗治疗后具有继发性自身免疫(6名 仅有自身抗体：4名有抗核抗体，2名有抗平滑肌抗体；8名有甲状腺自 身免疫，2名有ITP，1名有古德帕斯彻病)。其余23名被试者，基于暂 时的自身抗体生成和/或自阿伦单抗治疗以来时间不够长而不能加以归 类。

对于在以下实施例中描述的统计学分析，数据用Windows SPSS  12.0.1进行分析。在正态性评价之后，进行参数(Student t检验)或非 参数(Wilcoxon-Mann-Whitney)检验。P值在全文上下都被规定，其中 p＜0.05的值被认为在统计学上显著，在指出时通过Bonferroni校正来修 正。

实施例1：阿伦单抗诱导T细胞淋巴细胞减少症

单次剂量的阿伦单抗导致CD4+和CD8+T淋巴细胞在第一个月分 别减少至基线值的5.6％和6.8％，在第十二个月分别减少至30.3％和 40.8％(数据未示出)。

实施例2：未经治疗的多发性硬化症患者的T细胞耐受细胞死亡

对于本实施例中进行的各种化验，根据可用性使用不同的横截面和 纵向样品。作为测定阿伦单抗治疗后淋巴细胞循环的开端，我们考察了 未经治疗的多发性硬化症患者和正常对照之间、未经刺激的或用髓磷脂 碱性蛋白(MBP)或促甲状腺激素受体(TSHr)培养的T细胞的增殖 响应(图.1A和1B)。

A.外周单核细胞培养

通过Ficoll-Paque密度梯度(Amersham Pharmacia)离心被肝素化 的血液中分离出外周血液单核细胞(PBMCs)。立刻将全PBMCs悬浮于 含有1％青霉素、1％链霉素和10％胎牛血清(Sigma S5394)的培养基 (RPMI)中，并调整至10⁶/mL的活细胞浓度(通过锥虫蓝拒染实验 (trypan blue exclusion)确定)。为了诱导被动的细胞死亡，将PBMCs 在没有任何生长因子的情况下在培养基中单独孵育72小时。通过在预 涂抗-CD3mAb的板上(1μg/mL-BD Pharmingen)将PBMCs用可溶性 抗-CD28(1μg/mL：由牛沣大学M.Frewin友情捐赠)培养48小时，然 后与活化性抗人Fas(CH11克隆，1μg/mL，Upstate Biotechnology，Lake  Placid，NY)一起孵育18小时，诱导Fas介导的细胞凋亡。

B.细胞凋亡的检测

凋亡的T细胞通过用以下物质对细胞进行染色来检测：针对CD3 (Serotec MCA463APC)、CD4(Serotec MCA 1267APC)和CD8(Serotec  MCA1226APC)的结合别藻蓝素的鼠抗人单克隆抗体，以及结合FITC 的膜联蛋白V和碘化丙锭(BD Pharmingen)。通过流式细胞术来 (FACSCALIBUR：Becton Dickinson，芒廷维尤，加州)检测荧光。基于 前向角和侧向角散射光，打开宽的淋巴细胞门以包括活的和凋亡的淋巴 细胞(FSc减少，SSc增加)。收集至少有15,000个门内的细胞，并用 WinMDI 2.8软件进行分析。将早期凋亡的细胞定义为膜联蛋白V⁺PI^-， 后期凋亡或坏死的细胞定义为膜联蛋白V⁺PI⁺(Aubry等人，Cytometry 37， 197-204(1999))。凋亡细胞的死亡定义为以Q-VD-OPh(RnD Systems  OPH001)抑制pan-胱天蛋白酶阻滞的总细胞死亡(膜联蛋白V⁺PI^-加膜 联蛋白V⁺PI⁺)。

C.增殖检验

将PBMCs载有细胞分裂追踪染料CFSE(羟基荧光素二醋酸盐琥珀 酰亚胺酯)(Lyons等人，Methods Cell Biol.63，375-398(2001))，并用50 μg/mL髓磷脂碱蛋白(MBP：RDI-TRK8M79/LYO)或1μg/mL与基质结 合蛋白结合的促甲状腺激素受体胞外结构域(TSHr：Cardiff University 的M.Ludgate友情捐赠)培养。10天之后，通过流式细胞术分析用特 定表面标记物(CD4，CD8)识别的细胞CFSE染色。使用Modfit LT 3.0 (Verity Software)计算前体频率(定义为离开亲本群体经历至少两次细 胞分裂的淋巴细胞的比例)和增殖指数(定义为所有代细胞的总和除以 亲本细胞的计算数)。成活细胞的绝对数通过与包括在培养基内的固定 数量惰性珠(BD CALIBRITE，BD Biosciences)的比较来测定。

D.结果

在未经治疗的多发性硬化症患者和正常对照之间，在未经刺激的或 用髓磷脂碱性蛋白(MBP)或促甲状腺激素受体(TSHr)培养的情况下， 均不存在T细胞增殖响应的差异(图1A和1B)。相反地，未经治疗的 多发性硬化症患者的T细胞成活是对照组的4倍或更多(p＜0.005；图 1C)，这表明T细胞死亡减少是未经治疗的多发性硬化症的特征。我们 论证了与健康对照相比，未经治疗的患者的T细胞耐受于被动的和Fas 介导的细胞凋亡，从而确认了以上观点(被动的：0.3％对6.7％，p＝0.0016； Fas介导的：2.9％对15.5％，p＝0.0018；图1E和1F)。

实施例3：阿伦单抗治疗后再生的T细胞高度增殖，倾向于自行反应性且对凋亡敏感

使用实施例2中描述的化验，我们发现，在阿伦单抗治疗后，对自 身抗原应答的T细胞的比例(前体频率)和增殖程度(增殖指数)与未 经治疗的患者和健康对照相比均显著增加。例如，在第三个月，未经刺 激的T细胞增殖是未经治疗患者的＞6.5倍，并且响应于MBP和TSHr 刺激的增殖分别增加了900％和700％(全部p＜0.01：图1A和1B)。T 细胞凋亡在阿伦单抗治疗后也显著增加。响应于抗原性刺激，在第六个 月经历凋亡的T细胞的比例比基线大10倍(图1D；所有抗原p＜0.001)， 从而导致在培养末期成活的T细胞更少(图1C)。被动的和Fas介导的 凋亡在阿伦单抗治疗后也以至少两倍于健康对照组的速率增加(被动： 在第6、9、12个月分别为24.5％、22.2％和17.9％，相对于对照的6.7％， 所有p＜0.001；Fas介导：在第6、9、12个月分别为37.8％、35.8％和 29.9％，相对于对照的15.5％，所有p＜0.01；图1E和1F)。在CD4+和 CD8+亚群中均可见阿伦单抗治疗后增加的淋巴细胞凋亡(图1G和1H)， 并且在阿伦单抗治疗后持续至少18个月(数据未示出)。

实施例4：未经治疗的多发性硬化症患者的T细胞胱天蛋白酶-3表达不足(under-express)

A.mRNA分析

使用装入MACSLS柱的磁珠(Miltenyi Biotec；CD19微珠、CD3 微珠、CD14微珠)20μL/1×10⁷细胞，将来自体内便立刻进行后续操作 或在用MBP培养或多克隆刺激之后的PBMCs完全分离。将磁保留的细 胞洗脱、冲洗并储存在-70℃的RNAlater^TM中(细胞纯度恒定在95-98％， 数据未示出)。

Fas、FasL、Bcl-2、Bcl-X1、Bad、Bax、Bid、Bim、Survivin、c-FLIP 和胱天蛋白酶3、8、9的表达用半定量RT-PCR来确定。使用RNEASY Mini试剂盒(QIAgen)从储存在RNAlater^TM中的细胞中提取mRNA， 并将其用PRO-STAR First Strand RT-PCR试剂盒(Stratagene)反转录成 cDNA。PCR引物和探针用PRIMER EXPRESS(PE Biosystems，福斯特 城，加州，美国)设计，并购自Oswel DNA service。mRNA序列信息从 Genebank中获知。定量实时PCR使用含ROX的PCR Mastermix (Eurogentec RT-QP2X-03)在ABI Prism 7900HT序列检测系统(Perkin  Elmer)上进行。引物和探针序列如下：Bcl-2正向：5’-CCT GTG GAT GAC  TGA GTA CCT GAA-3’(SEQ ID NO：1)，反向5’-CAC CTA CCC AGC  CTC CGT TA-3’(SEQ ID NO：2)，JOE标记的探针5’-CGG CAC CTG  CAC ACC TGG ATC-3’(SEQ ID NO：3)；Bcl-X1正向：5’-TTC AGT CGG  AAA TGA CCA GAC A-3’(SEQ ID NO：4)，反向5’-GAG GAT GTG GTG  GAG CAG AGA-3’(SEQ ID NO：5)，FAM标记的探针5’-TGA CCA TCC  ACT CTA CCC TCC CAC CC-3’(SEQ ID NO：6)；Fas正向：5’-AAA AGC  ATT TTG AGC AGG AGA GTA TT-3’(SEQ ID NO：7)，反向5’-GGC CAT  TAA GAT GAG CAC CAA-3’(SEQ ID NO：8)，JOE标记的探针5’-CTA  GAG CTC TGC CAC CTC TCC ATT-3’(SEQ ID NO：9)；FasL正向： 5’-AAG AAA GTG GCC CAT TTA ACA G-3’(SEQ ID NO：10)，反向 5’-AGA AAG CAG GAC AAT TCC ATA GGT-3’(SEQ ID NO：11)，FAM 标记的探针5’-CAA CTC AAG GTC CAT GCC TCT GG-3’(SEQ ID  NO：12)；Survivin正向5’-CTG CCT GGC AGC CCT TT-3’(SEQ ID  NO：13)，反向5’-CTC CAA GAA GGG CCA GTT CTT-3’(SEQ ID  NO：14)，FAM标记的探针5’-TCA AGG ACC ACC GCA TCT CTA CAT T-3’(SEQ ID NO：15)；c-FLIP正向5’-GTG GAG ACC CAC CTG CTC-3’ (SEQ ID NO：16)，反向5’-GGA CAC ATC AGA TTT ATC CAA ATC  C-3’(SEQ ID NO：17)，FAM标记的探针5’-CTG CCA TCA GCA CTC  TAT AGT CCG AAA CAA-3’(SEQ ID NO：18)；胱天蛋白酶8正向： 5’-AGG AGG AGA TGG AAA GGG AAC TT-3’(SEQ ID NO：19)，反向 5’-ACC TCAATT CTG ATC TGC TCA CTT CT-3’(SEQ ID NO：20)，JOE 标记的探针5’-CTC CCT ACA GGG TCA TGC TCT ATC AGA TTT  CAG-3’(SEQ ID NO：21)；胱天蛋白酶3正向5’-AAG ATC ATA CAT  GGA AGC GAA TCA-3’(SEQ ID NO：22)，反向5’-CGA GAT GTC ATT  CCA GTG CTT TTA-3’(SEQ ID NO：23)，FAM标记的探针5’-CTG GAA  TAT CCC TGG ACA ACA GTT ATA AA-3’(SEQ ID NO：24)；胱天蛋白 酶9正向5’-TGC GAA CTA ACA GGC AAG CA-3’(SEQ ID NO：25)， 反向5’-GAA CCT CTG GTT TGC GAA TCT C-3’(SEQ ID NO：26)，FAM 标记的探针5’-CAA AGT TGT CGA AGC CAA CCC TAG AAA ACC  TTA-3’(SEQ ID NO：27)；Bad正向5’-CAG TGA CCT TCG CTC CAC  ATC-3’(SEQ ID NO：28)，反向5’-ACG GAT CCT CTT TTT GCA TAG-3’ (SEQ ID NO：29)，JOE标记的探针5’-ACT CCA CCC GTT CCC ACT  GCC C-3’(SEQ ID NO：30)；Bax正向5’-TTT CTGACG GCAACT TCA  ACT-3’(SEQ ID NO：31)，反向5’-GGT GCA CAG GGC CTT GAG-3’ (SEQ ID NO：32)，JOE标记的探针5’-TGT CGC CCT TTT CTA CTT  TGC CAG CA-3’(SEQ ID NO：33)；Bid正向5’-GCT GTATAG CTG CTT  CCA GTG TAG-3’(SEQ ID NO：34)，反向5’-GCT ATC TTC CAG CCT  GTC TTC TCT-3’(SEQ ID NO：35)，JOE标记的探针5’-AGC CCT GGC  ATG TCA ACA GCG TTC-3’(SEQ ID NO：36)；Bim正向5’-ACC ACA  AGG ATT TCT CAT GAT ACC-3’(SEQ ID NO：37)，反向5’-CCA TAT  GAC AAAATG CTC AAG GAA-3’(SEQ ID NO：38)，FAM标记的探针 5’-TAG CCA CAG CCA CCT CTC TCC CT-3’(SEQ ID NO：39)。

B.结果

未经治疗的多发性硬化症患者的T细胞的胱天蛋白酶3——两种 凋亡途径中常见的效应物胱天蛋白酶——的mRNA表达，与对照相比 较减少；这对未经刺激的和MBP刺激的PBMCs是显著的(分别减少 78％和87％，在多重比较校正后二者p＜0.05)，但对多克隆刺激培养不 显著(图2A)。类似的趋势也可见于CD14+细胞(但CD19+细胞没有)， 尽管该差异在多重比较校正后不再存在(图2B)。在阿伦单抗治疗后， 胱天蛋白酶3表达在T细胞和单核细胞中显著增加，达到健康对照中 可见的水平(p＜0.05；图2A和2B)。其他所检测的基因(列在方法中) 的表达在阿伦单抗治疗后没有改变。

因此，我们的研究表明，未经治疗的多发性硬化症患者的T细胞耐 受于凋亡，并且这种耐受性与胱天蛋白酶3表达不足有关。与该效应物 胱天蛋白酶在外在和内在凋亡路径的会合点处的位置一致，我们已经证 明，我们患者体内的T细胞对Fas介导的及被动的凋亡均具有耐受性。 胱天蛋白酶3表达不足已经被在一些自身免疫疾病中得以描述，包括I 型糖尿病(Vendrame等人，Eur J Endocrinol152，119-125(2005))，桥本 氏甲状腺炎和II型自身免疫性多内分泌腺综合征(Vendrame等人，J Clin  Endocrinol Metabjc(2006))。但这在多发性硬化症中是新的发现。

实施例5：阿伦单抗治疗后的继发性自身免疫与过度T细胞凋亡相关

已经阐明淋巴细胞的增殖和凋亡增加是对治疗的普通相应，我们检 测了T细胞凋亡与阿伦单抗治疗后发生自身免疫之间的关系，后者被定 义为在阿伦单抗治疗后持续至少三个月的新的自身免疫疾病的发生和/ 或自身抗体高于正常范围。使用该定义，当与在相同时间点研究的非自 身免疫患者(n＝10)的T细胞相比较时，来自具有自身免疫的患者(n＝10) 的T细胞在治疗后9个月在所有培养情况下均显示出显著更高的凋亡细 胞死亡水平(未经刺激的4.7％对14.4％，Fas介导的18.2％对32.1％， MBP 7.6％对17.6％，TSHr 9.5％对25.5％，所有比较的p＜0.01；图3)。 如果应用更严格的自身免疫定义，即自身免疫疾病的发生但不包括非致 病抗体的产生，差异仍然存在，但自身免疫组的数量减少到7(没有刺 激的4.7％对15.4％，Fas介导的18.2％对31.7％，MBP 7.6％对20.2％， TSHr 9.5％对13.4％，所有比较的p＜0.02)。

在两组之间不存在T细胞重组速率的差异(例如，6个月时，具有 或不具有自身免疫的患者，CD4计数分别是0.15×10⁹/L对0.19×10⁹/L； CD8计数分别是0.11×10⁹/L对0.11×10⁹/L)，这表明自身免疫组的T细 胞循环增加(数据未示出)。

实施例6：IL-21诱导T细胞增殖和凋亡

A.IL-21化验和掺加(spiking)

血清IL-21使用EBIOSCIENCE试剂盒(88-7216-86)根据说明书 测定。微孔板用酶标仪(860型，BioRad)读数，波长450nm。未经刺 激的和多克隆刺激的(1μg/mL结合在板上的抗-CD3和1μg/mL可溶性 抗-CD28)PBMCs掺加有5pg/mL和20pg/mL的rhIL-21(EBIOSCIENCE  14-8219)。CD4+和CD8+的凋亡和增殖如上所述进行评价。

B：结果

我们考察了外源性IL-21对人T细胞的体外凋亡和增殖的作用。在 健康对照的PBMCs中掺加rhIL-21导致未经刺激的和多克隆刺激的 CD4+(图4A)和CD8+(图4B)T细胞的凋亡性死亡以依赖于剂量的 方式增加(所有条件下p＜0.05)。在未经刺激的细胞中掺加rhIL-21导致 CD4+和CD8+T细胞的增殖少量但显著地增加；增殖指数(CD4+和 CD8+：分别为1.07对1.25，p＝0.017；1.09对1.32，p＝0.017；图5A) 和前体频率(CD4+0.007对0.014，p＝0.016；CD8+0.007对0.015， p＝0.026；图5C)均有增加。IL-21对响应于多克隆刺激增殖的CD4+和 CD8+T细胞的比例没有影响(图5D)，这表明它们已经得以最大程度 的刺激。但是，IL-21确实导致了CD8+细胞增殖程度的显著增加(增殖 指数11.59对19.39，p＝0.012；图5B)。

实施例7：IL-21预测阿伦单抗治疗后继发性自身免疫的发生

在实施例6中的所有时间点，与非自身免疫组相比，发生继发性自 身免疫的患者的IL-21浓度显著要高(所有比较p＜0.05；图6A)。我们 考察了所有随后继续进行阿伦单抗治疗的84名患者的治疗前血清样品。 在对这些患者至少两年的追踪之后，我们把他们分类为“自身免疫”组 (n＝35：32名患者具有甲状腺疾病，1名ITP，1名古德帕斯彻病，1 名秃头症)或“非自身免疫”组(n＝49：患者没有或仅有短暂(没有持 续6个月以上)自身抗体)。这些治疗前血清的IL-21平均浓度在统计学 上显著高于对照；然而，这完全是因为发生继发性自身免疫患者的IL-21 水平高。治疗前的平均IL-21水平在发生自身免疫的患者(464pg/ml) 和不发生自身免疫的患者(229pg/ml；p＝0.0002)之间存在高度显著的 差异(图6B)。

诱发的淋巴细胞减少症和自身免疫之间的联系已经在动物模型上 进行了观察。在淋巴细胞减少的情况下，剩余的T细胞经历广泛的补偿 性扩增，以重组免疫系统。该过程被称为内稳态增殖，其依赖于通过 TCR-自我-肽-MHC复合物的刺激(Ge等人，P.N.A.S.101，3041-3046 (2004)；Ge等人，P.N.A.S.98，1728-1733(2001)；Kassiotis等人，J Exp. Med.197，1007-1016(2003))，并造成群体倾向于自身抗原的识别增加， 如我们的研究中所见。另外，快速扩增的T细胞获得记忆细胞的基因型 和功能特征，其包括：对共刺激的依赖减少，与原初细胞相比能够相应 更低剂量的抗原，以及对再刺激快速分泌炎症细胞因子，从而进一步促 进自身耐受力的崩溃(Cho等人，J Exp.Med.192，549-556(2000)； Goldrath等人，J Exp.Med.192，557-564(2000)；Murali-Krishna等人，J  Immunol 165，1733-1737(2000)；Wu等人，Nat Med.10，87-92(2004))。 然而，尽管有这些变化，自身免疫并不是淋巴细胞减少的必然结果。确 实，与我们的患者的情况一样，多数淋巴细胞减少的被试者没有发生自 身免疫，这表明需要其他的“辅因子”。

我们首次在人身上证实，IL-21的过度生成是继发性自身免疫所需 的“第2影响因素(hit)”，上述继发性自身免疫在用例如阿伦单抗的淋 巴细胞减少剂否则便成功地治疗多发性硬化症之后发生。我们的研究显 示，自身免疫在淋巴细胞减少的患者身上发生，甚至在治疗前便可检测 到的遗传影响的高水平IL-21驱使的T细胞的凋亡和细胞循环更甚。即 使在治疗之前，将要发生继发性自身免疫的患者的血清IL-21水平比非 自身免疫组高出2倍多，这表明血清IL-21可以作为阿伦单抗治疗后数 月至数年发生自身免疫的风险的生物标记物。无意拘泥于任何理论，我 们相信，通过过度驱动T细胞扩增和死亡的循环，IL-21增加了生成自 反应性T细胞、并因此造成自身免疫的可能性。

实施例8：IL-21基因型影响IL-21的表达并自身免疫相关

A：IL-21基因分型

总共检测了4个位于4q27染色体上的SNP：rs13151961、rs6822844、 rs4833837和rs6840978，其位于含有KIAA1109-ADAD1-IL2-IL21四个基 因的强连锁不平衡区。所有四个SNP可作为Applied Biosystems  Assay-On-Demand(AoD)的产品而获得。SNP基因分型使用Applied  Biosystems TaqMan方法学根据制造商的推荐条件进行。聚合酶链式反 应(PCR)在Applied Biosystems 384孔9700 Viper PCR仪上进行，之后 基因型在7900高通量序列检测系统(SDS)中用2.1版本的SDS软件 标出。每名个体被基因分型两次。所有个体额外地进行与多发性硬化症 相关的遗传因子的基因分型，即HLA-DRB1*1501、rs2104286(IL2RA) 和rs6897932(IL7R)。

B：结果

为了确定遗传变异和IL-21生成之间是否存在联系，我们对73名被 试者进行了位于编码IL-21基因的4q27染色体上连锁不平衡(LD)区 的4个单核苷酸多态性(SNPs)的基因分型，上述被试者在阿伦单抗治 疗前的血清IL-21浓度已经得以确定。所有4个SNP的次要等位基因频 率符合公开数据：rs13151961G(14.5％)、rs6822844T(14.6％)、 rs4833837G(38.0％)和rs6840978T(18.1％)(Glas等人，Am.J. Gastroenterol.104，1737-1744(2009))。我们发现，4个SNP中的3个基 因型(rs13151961A/A、rs6822844G/G和rs6840978C/C)与显著更高的 IL-21水平相关(p值：分别是0.0076、0.0098和0.0067)。rs4833837 的基因型不影响IL-21的生成。rs4833837和其他三个SNP间的LD很 低(r²＜0.15)，因此，位于单倍型rs13151961(A)-rs6822844(G)- rs6840978(C)的SNP很可能与IL-21的生成增加相关。HLA-DRB1*1501、 rs2104286(IL2RA)和rs6897932(IL7R)的基因型频率与已发表的关于其 他未经选择的多发性硬化症患者的数据没有差别(International Multiple  Sclerosis Genetics Consortium(IMSGC)，Lancet Neurol.7，567-569 (2008)；Yeo等人，Ann Neurol 61，228-236(2007))。

最后，为了确认基因型是否影响阿伦单抗治疗后对自身免疫的易感 性，我们把尽可能多的患者归类成在阿伦单抗治疗后确实发生自身免疫 的(27名被试者)和确定没有发生的(23名被试者)。有23名被试者 由于暂时性的自身抗体生成和/或自阿伦单抗暴露以来时间不足而无法 归类。基因型(rs13151961A/A、rs6822844G/G和rs6840978C/C)已显 示与血清IL-21浓度较高相关，另外也发现与阿伦单抗治疗后的自身免 疫相关。