一种具有高生物功能性的肝素化界面材料制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程功能材料，尤其是具有生物功能性的肝素化界面材料制备技术领域。

背景技术

肝素是硫酸乙酰肝素的高度硫酸化的形式，是一种具有抗凝血性的生物分子，存在于细胞外基质中、它也是多种蛋白酶和生长因子的特异性识别体。因此，界面肝素化材料具有的抗凝活性和特异识别性，在生物芯片技术以及生物材料领域得到了广泛的研究和应用。目前制备肝素化界面材料的方法主要有物理吸附和共价固定。肝素分子物理吸附于材料表面的结合方式不稳定，体内情况下很短时间释放完。肝素在材料表面的共价固定是制备肝素化界面材料的最常用方法，尽管共价固定的肝素化界面材料对于肝素分子的保留具有较持久性，然而共价固定使肝素分子的生物活性被大大削弱，其潜在的蛋白特异性识别能力的大大降低，限制了其进一步拓展的应用价值。

发明内容

鉴于现有技术的以上不足，本发明的目的是提供一种可制备出具有高度肝素生物活性保持力的界面材料的方法，在保证其具有高度生物活性保持力的同时，使之具有制备操作简单方便，无需昂贵的专用设备，制备成本低的优点。

本发明的目的是通过如下手段来实现的。

一种具有高生物功能性的肝素化界面材料制备方法，采用如下步骤在生物材料表面获得肝素化界面材料：

A、采用脉冲等离子体聚合方法在经溅射清洗的基底材料表面上沉积一层烯丙胺等离子体聚合薄膜；

B、将A处理后的沉积有等离子体聚合薄膜的生物材料浸泡于pH值为2-7的PBS溶液中1-24小时，使其表面氨基质子化；

C、将肝素钠加入B步骤所述的PBS缓冲溶液中，浓度为1-10mg/ml，室温25℃下反应1-24小时，反应完毕后，分别用PBS和蒸馏水充分漂洗，干燥，得目标材料。

采用本发明方法制备的肝素化界面材料不仅具有优异的抗凝和抗平滑肌细胞粘附和增殖能力，并且对其特异性识别的酶(如蛋白酶ATIII)、细胞外基质蛋白(如Fn)、生长因子(如VEGF)、趋化因子(如SDF-1α)表现出优异的特异识别能力。结合特异性识别的蛋白酶(ATIII)、细胞外基质蛋白蛋白(纤连蛋白)、生长因子(FGF-1、FGF-2、VEGF)、趋化因子(SDF-1α)等的肝素功能化界面材料在抗凝、血管生成、免疫学、促进伤口愈合、组织再生医学等领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是本发明获得的316L不锈钢和肝素化界面材料Hep-PPAam的APTT结果图。

图2为316L不锈钢和肝素化界面材料Hep-PPAam结合ATIII和VEGF的定量结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的实施作进一步的描述，实施例所用试剂均为分析纯。为叙述方便，本申请中的“基底材料”是对采用本发明方法进行表面改性生物的材料和器件的统称。

实施例1

制备钴基合金为基底材料的肝素化界面材料：

A、等离子体聚烯丙胺薄膜的沉积

A1溅射清洗：将基底材料放入薄膜沉积反应室中，当反应室真空抽至为0.01时，通入流量为1sccm的氩气，在射频功率为50W，负偏压为50的条件下进行5分钟的溅射清洗；

A2等离子体聚合薄膜制备：溅射清洗后，重新使反应室的真空度为0.01Pa，通入流量为0.5sccm的氩气作为放电气体，并通入作为反应气体的烯丙胺，使工作压力为1Pa，在射频功率5W、负偏压为50V、脉冲占空比为5％的条件下进行为时60分钟的等离子体聚合薄膜沉积，即在基底材料表面上沉积富含氨基的等离子体聚合薄膜。

B、等离子体聚合薄膜表面质子功能化

将A步沉积有等离子体聚合薄膜的材料浸泡于pH值为2的PBS溶液中1小时，使其表面氨基质子化。

C、肝素单分子层自组装

将肝素钠加入B步的PBS缓冲溶液中，浓度为1mg/ml，室温25℃下反应1小时，反应完毕后，分别用PBS和蒸馏水充分漂洗，干燥，即得。

实施例2

制备铁基材料为基底材料的肝素化界面材料：

A、等离子体聚烯丙胺薄膜的沉积

A1溅射清洗：将基底材料放入薄膜沉积反应室中，当反应室真空抽至为2Pa时，通入流量10sccm的氩气，在射频功率为200W，负偏压为150V的条件下进行30分钟的溅射清洗；

A2等离子体聚合薄膜制备：溅射清洗后，重新使反应室的真空度为2Pa，通入流量为5sccm的氩气作为放电气体，并通入作为反应气体的烯丙胺，使工作压力10Pa，在射频功率50W、负偏压为150V、脉冲占空比为100％的条件下进行为时5分钟的等离子体聚合薄膜沉积，即在基底材料表面上沉积富含氨基的等离子体聚合薄膜。

B、等离子体聚合薄膜表面质子功能化

将A步沉积有等离子体聚合薄膜的基底材料浸泡于pH值为7的PBS溶液中24小时，使其表面氨基质子化。

C、肝素单分子层自组装

将肝素钠加入B步的PBS缓冲溶液中，浓度为10mg/ml，室温25℃下反24小时，反应完毕后，分别用PBS和蒸馏水充分漂洗，干燥，即得。

实施例3

制备NiTi合金为基底材料的肝素化界面材料：

A、等离子体聚烯丙胺薄膜的沉积

A1溅射清洗：将基底材料放入薄膜沉积反应室中，当反应室真空抽至为0.2Pa时，通入流量为5sccm的氩气，在射频功率为100W，负偏压为100V的条件下进行15分钟的溅射清洗；

A2等离子体聚合薄膜制备：溅射清洗后，重新使反应室的真空度为0.2Pa，通入流量为2sccm的氩气作为放电气体，并通入作为反应气体的烯丙胺使工作压力为5Pa，在射频功率30W、负偏压为100V、脉冲占空比为30％的条件下进行为时30分钟的等离子体聚合薄膜沉积，即在材料表面上沉积富含氨基的等离子体聚合薄膜。

B、等离子体聚合薄膜表面质子功能化

将A步沉积有等离子体聚合薄膜的材料浸泡于pH值为4的PBS溶液中12小时，使其表面氨基质子化。

C、肝素单分子层自组装

将肝素钠加入B步的PBS缓冲溶液中，浓度为5mg/ml，室温25℃下反应12小时，反应完毕后，分别用PBS和蒸馏水充分漂洗，干燥，即得。

实施例4

制备钛合金为基底材料的肝素化界面材料：

A、等离子体聚烯丙胺薄膜的沉积

A1溅射清洗：将材料放入薄膜沉积反应室中，当反应室真空抽至为1Pa时，通入流量为8sccm的氩气，在射频功率为150W，负偏压为75V的条件下进行25分钟的溅射清洗；

A2等离子体聚合薄膜制备：溅射清洗后，重新使反应室的真空度为1Pa，通入流量为4sccm的氩气作为放电气体，并通入作为反应气体的烯丙胺，使工作压力为8Pa，在射频功率40W、负偏压为120V、脉冲占空比为50％的条件下进行为时45分钟的等离子体聚合薄膜沉积，即在血管支架表面上沉积富含氨基的等离子体聚合薄膜。

B、等离子体聚合薄膜表面质子功能化

将A步沉积有等离子体聚合薄膜的材料浸泡于pH值为5.5的PBS溶液中1-24小时，使其表面氨基质子化。

C、肝素单分子层自组装

将肝素钠加入B步的PBS缓冲溶液中，浓度为8mg/ml，室温25℃下反应20小时，反应完毕后，分别用PBS和蒸馏水充分漂洗，干燥，即得。

D、ATIII固定

将C步表面肝素化的材料浸泡在含抗凝血酶原(ATIII)的PBS溶液中，室温25℃下反应24小时，反应完毕后，分别用PBS和蒸馏水充分漂洗，干燥，即得。其Hep-PPAam的APTT结果如图1。

实施例5

制备316L不锈钢为基底材料的肝素化界面材料：

A、等离子体聚烯丙胺薄膜的沉积

A1溅射清洗：将基底材料放入薄膜沉积反应室中，当反应室真空抽至为0.01Pa时，通入流量为10sccm的氩气，在射频功率为200W，负偏压为150V的条件下进行30分钟的溅射清洗；

A2等离子体聚合薄膜制备：溅射清洗后，重新使反应室的真空度为0.01Pa，通入流量为5sccm的氩气作为放电气体，并通入作为反应气体的烯丙胺，使工作压力为10Pa，在射频功率50W、负偏压为150V、脉冲占空比为5％的条件下进行为时60分钟的等离子体聚合薄膜沉积，即在材料表面上沉积富含氨基的等离子体聚合薄膜。

B、等离子体聚合薄膜表面质子功能化

将A步沉积有等离子体聚合薄膜的材料浸泡于pH值为2的PBS溶液中24小时，使其表面氨基质子化。

C、肝素单分子层自组装

将肝素钠加入B步的PBS缓冲溶液中，浓度为10mg/ml，室温25℃下反应24小时，反应完毕后，分别用PBS和蒸馏水充分漂洗，干燥，即得。

D、VEGF的固定

将C步表面肝素化的材料浸泡在含内皮细胞生长因子(VEGF)的PBS溶液中，室温25℃下反应24小时，反应完毕后，分别用PBS和蒸馏水充分漂洗，干燥，即得目标产物。其Hep-PPAam结合ATIII和VEGF的定量结果如图2所示。

图1为用本发明的方法制备的肝素化界面材料的部分凝血活酶时间结果表明肝素化界面材料表面显著地提高了内源性抗凝血性能，说明本专利制备的肝素化界面材料具有优异的抗凝血性。

图2为用本发明的方法制备的肝素化界面材料对AT-III和VEGF特异性结合的定量测试结果，表明该化界面材料能显著提升对AT-III和VEGF的结合量，说明本专利制备的肝素化界面材料具有优异的优异肝素-蛋白结合功能。

图1和图2的良好结果对本发明其它实施例亦不失一般性。

本发明制备方法在生物材料及其器械表面构建具有高度生物活性保持力的肝素单分子层。采用等离子体聚合技术在生物材料及其器械表面沉积上一层结合牢固且富含胺基官能团的等离子体聚合薄膜。经过在酸性PBS中浸泡后，表面氨基被质子化并带上丰富的正电荷，与肝素分子自身负电基团(羧酸根和磺酸根)发生强静电作用后，有效的把肝素结合上其表面。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

一、聚合涂层与生物材料及其器械表面采用等离子沉积方法，结合牢固，涂层含有丰富的氨基官能团。

二、依靠肝素的羧酸根和磺酸根和等离子体聚合薄膜表面质子化的氨基的强静电吸附作用在其表面固定的肝素具有很强的结合力。

三、由于肝素固定不采用任何偶联剂，使得肝素功能性得到有效的保持，表现出优异肝素-蛋白结合功能。通过进一步在该肝素功能化界面材料表面结合特异性识别的蛋白、生物分子和生长因子，能实现其在抗凝、血管生成、免疫学、促进伤口愈合、组织再生医学等领域的应用。

同时此种肝素功能化界面材料的制备，仅需以浸泡自组装的的方式在等离子体聚合薄膜表面构建肝素单分子层，其制备过程，操作简单方便，也无需昂贵的专用设备，制备成本低。

采用本发明的基本方法，在实际实施时还可有广泛的实际变例，例如本申请中的“基底材料”可包括生物医用金属基材料(Fe、镁基材料、316L SS、Ti、Ti合金Ni-Ti合金及Co-Cr合金等)、无机材料(Ti-O、TiN等)、不可降解聚合物(如：PET、PTFE、PDMS等)及可降解聚合物材料(如PLA、PLGA和PCL等)。