基于微孔微电极阵列的高通量细胞电融合微流控芯片装置

技术领域

本发明涉及生物细胞电融合的装置。具体地，本发明涉及提供细胞电融合的芯片，提供并产生细胞排队、电穿孔、融合所需要的电场强度和电场梯度。

背景技术

细胞电融合技术自上世纪80年代起，因为其效率较高、操作简便、对细胞无毒害，便于观察，适于仪器应用和规范操作等优点，得到了快速发展和广泛应用（参见美国专利文献：4326934, April 27, 1982, Pohl; 441972, April 10, 1982, Pohl; 4578168, March 25, 1986, Hofman; 4695547, Sep 22, 1987, Hillard; 4699881, Oct 13, 1987, Matschke, et al.;）。

细胞电融合可以分为两个主要阶段：细胞排队和细胞融合。

细胞排队的原理在于：生物细胞处于非均匀电场中时，被电场极化形成偶极子，该偶极子在非均匀电场作用中会受到特定的力而发生运动，即介电电泳（dielectrophoresis）。利用介电电泳可以控制细胞的运动，在细胞电融合过程中，利用介电电泳现象使细胞排列成串，压紧相互接触的细胞，完成细胞电融合过程所需的排队和融合后压紧。

细胞融合的原理在于：强电场作用会导致细胞膜穿孔，这种效应称为细胞膜电致穿孔效应（electroporation）。在细胞电融合过程中利用电致穿孔效应，使两接触的细胞膜穿孔，从而使细胞间进行膜内物质交换，使细胞质、膜融合，在一定强度的电场作用下的电穿孔是一种可逆穿孔，细胞膜会在减小或撤销电场强度时回复原状，产生细胞电融合过程的膜融合。

传统的细胞电融合系统通常都采用大型融合槽，其优点在于：（1）操作较为简便，采用大型融合槽降低了包括样品进样与出样等步骤的难度；（2）加工简便，大型融合槽的尺寸一般都在厘米量级，利用传统的机械加工手段可以较为方便地加工出所需要的融合槽结构；（3）融合量大，传统的融合槽可以容纳数毫升样品，一次实验即可获得足够的细胞进行后期筛选、培养等工作。

但传统的细胞电融合设备也存在一些缺点：（1）由于融合槽中的电极间距较大，要达到够强度的细胞排队、融合及压紧信号，需要很高的外界驱动电压，往往高达几百上千伏，对系统的电气安全性要求高，系统的成本也因此大为提高；（2）电极间的较大间距不利于对细胞的精确控制等。

为解决这一问题，研究者将细胞电融合技术与MEMS加工技术相结合。MEMS技术的加工范围通常在1 ~ 50 μm，这与细胞的直径范围相当，所产生的微结构能有效控制细胞。有多家研究机构开始研究利用微流控芯片技术或者微电极阵列技术构建生物芯片来实现细胞电融合操作。

例如，美国MIT的研究人员提出了利用微流控芯片技术实现对细胞的精确控制，达到高效的细胞配对和融合（参见J. Voldman, A.M. Skelley, O. Kirak, H. Suh, R. Jaenisch, Microfluidic control of cell pairing and fusion, Nat Methods, 2009）；国内赵志强等研究人员（中国专利200610054121.x，2006年，重庆大学，赵志强等）也提出了利用MEMS技术构建微电极阵列，通过构建微米量级间距的微电极阵列，实现在低电压条件下的细胞电融合。日本研究者提出的利用一对微电极（参见Daniel T Chiu，A microfluidics platform for cell fusion，Current Opinion In Biotechnology，2001），通过流路控制细胞的流动，使细胞运动到微电极对位置区域后，利用电场作用使两个细胞形成配对，再借助于电脉冲实现电融合。

但上述芯片仍然存在一定的问题，如梁伟等人提出的金属丝微电极阵列，其间距依然较大，电压要求依然较高，同时，金属丝的直径较大不利于形成微电场细胞细胞配对与融合控制（中国专利文献CN86210174，辽宁肿瘤研究所，梁伟）；如美国MIT所研究的微流控芯片虽然较好的解决了细胞配对的问题，但该芯片两电极间的间距较大，仍然需要较高的外界电压才能够实现电融合。而赵志强提出的芯片所集成的微电极数量较少，不能实现高通量融合；微电极所产生的电场强度和电场梯度也比较弱，难以实现细胞的精确控制；所选择的加工材料的抗腐蚀、抗氧化能力也较差；同时，由于未集成进出样装置，操作也较为不便。日本研究者提出利用微孔的方式实现两个通道的分隔，进而实现不同细胞的独立进样完成细胞配对，但该方法对微孔的定位要求很高，无法进行大规模应用，同时，该方法依然采用距离较大的平板电极实现电融合，工作电压高（参见M. Gel, Y. Kimura, O. Kurosawa, H. Oana, H. Kotera, M. Washizu, Dielectrophoretic cell trapping and parallel one-to-one fusion based on field constriction created by a micro-orifice array, Biomicrofluidics, 2010）。

同时，重庆大学杨军等人提出了交错梳状电极阵列，集成间距为几十微米的齿状微电极结构于梳状电极阵列上，达到高通量融合的目地。但该专利的电极是连续电极，凹陷区的微通道侧壁也是电极结构，上面所加载的电信号同样会引起细胞排队，但该区域电场强度不足以实现融合，进而影响效率（中国专利文献200710092892.2）。同时，该课题组提出的基于微小室阵列结构的细胞电融合芯片装置的细胞配对是基于一个随机原理进行的细胞配对与融合，虽然能够达到两个细胞配对的目地，但仍然无法精确实现AB细胞的配对与融合（中国专利文献200910191052.0）。

本发明提出并构建了一种仅能容纳单个细胞的微孔阵列结构，并结合微电极阵列结构、微流控盖片/顶层电极较好地解决了细胞的两两配对问题；而借助于阵列化的结构，芯片具有较高的融合通量，可为后期研究提供足够的融合细胞。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出一种基于微孔微电极阵列的高通量细胞电融合微流控芯片装置，该芯片装置上集成了阵列化的微孔微电极，结合微电极与顶层电极间独特的电场分布，通过调节微孔尺寸结构使每个微孔中仅能容纳单个细胞，从而实现极高的细胞配对效率及后期的两两融合率。

本发明的技术方案如下：

一种基于微孔微电极阵列的高通量细胞电融合微流控芯片装置，其特征在于：它由微电极微孔阵列芯片和带顶层电极的微流控盖片组成。

所述微电极微孔阵列芯片是采用微加工技术在石英基底层上从下至上依次加工微电极阵列层和多聚物微孔阵列层而构成；所述微孔阵列层上的微孔与微电极阵列层上的微电极一一对应；所述多聚物微孔阵列层的厚度略小于目标细胞直径，以控制在微孔内部目标细胞的单层排布。

所述带顶层电极的微流控盖片上设有进样口和出样口，在微流控盖片的下表面设有与微电极阵列层上的电极区域面积一致的凹腔，进样口和出样口位于凹腔的两端，进行细胞悬浮液的进样、通过和出样；在微流控盖片下表面溅射有一层金属薄膜，形成顶层电极。

所述带顶层电极的微流控盖片盖在微电极微孔阵列芯片上，微电极微孔阵列芯片上的微电极和微孔阵列区域与微流控盖片的凹腔相吻合。

所述微电极阵列层和顶层电极均留出有与外界电信号连接的键合点，外界电信号分别加载于微电极阵列层与顶层电极上，在微孔及微孔顶部形成一电场分布，使微孔内部单个分布的目标细胞与上部凹腔中通过的目标细胞形成配对，实现高效的一对一电融合。

采用本装置，将细胞悬浮液通过进样口进入到凹腔中，通过加载正弦信号于微电极阵列及顶层电极，在微电极阵列和顶层电极之间形成一非均匀电场，由于微电极尺度小，微电极区域（微孔内部）电场强度高，在介电电泳效应及细胞自身重力作用下，细胞将流到每一个微孔中，利用微流吹出腔体内部多余的细胞，实现每个微孔内部单层单个细胞的排布；再注入第二种细胞缓冲液，并加载排队信号，进而实现微孔内的细胞与再次加载的细胞之间的配对；再次加载融合信号实现配对后细胞的融合，而非均匀的电场分布将保证仅仅微孔内的细胞与再次加载的细胞的一一融合，避免了多细胞融合。

本发明的优点如下：

本装置可实现每个微孔内仅容纳单个细胞，当其结合微流控控制与非均匀电场控制时，可实现同源/异源细胞间的高效配对，并能够利用独特的非均与电场分布避免多细胞融合的发生，提高两两融合率；微电极的顶层电极良好的电导率和相对电极间的较短间距使装置仅需要很低强度的外围电信号即可在微孔内产生足够强度的电场，实现细胞排队和电融合过程，降低装置对外围信号发生器的要求和系统的制作成本；低的工作电压也提高了系统的安全性；金属电极层选用金、铂等材料提高了芯片的生物相容性和抗氧化、抗腐蚀性能，也提高了芯片的可靠性；微孔阵列选用的聚酰亚胺生物相容性好，加工简便；大量的微电极微孔阵列可实现大量细胞的同时融合，融合效率高；自动进样和自动出样减小对融合后细胞的物理损伤，提高其存活能力。

附图说明

图1 基于微孔微电极阵列的高通量细胞电融合微流控芯片装置的外形示意图。

图2基于微孔微电极阵列的高通量细胞电融合微流控芯片装置的结构分解示意图。

图3 微电极微孔阵列芯片的结构示意图。

图4 石英基底层的示意图。

图5 微电极阵列的示意图。

图6 微孔阵列层的示意图。

图7 微流控盖片的示意图。

图8 顶层电极的示意图。

具体实施方式

  以下结合附图进一步说明本发明的结构及工作过程：

参见图1和图2，本装置由微电极微孔阵列芯片1和带顶层电极3的微流控盖片2组成。

结合图3、图4、图5和图6可见，微电极微孔阵列芯片1的结构从下至上依次为石英基底层4、微电极阵列层5和多聚物微孔阵列层6。

其中，微电极阵列层5是利用微加工技术（蒸发、溅射及光刻等工艺）在石英基底层4上加工获得，微电极阵列层5可根据实验所需的通量设计M                                                N的微电极阵列，微电极8的直径为4-6微米的圆盘，微电极8间间距为40微米，各微电极之间采用宽度为2-4微米的引线9连接，微电极阵列的边缘有一2 4 mm的键合点10，微电极8、引线9和键合点10的材质一致，可选用金、铂等导电性优异，生物相容性良好，具有极强抗氧化、抗腐蚀能力的惰性金属，厚度在0.5-1微米间。

微孔阵列层6可选用光敏聚酰亚胺在微电极阵列层表面通过光刻形成微孔阵列图形，微孔阵列层6厚度根据目标细胞设定在8-15微米之间，微孔11的直径也相应为8-15微米，以便较好地控制在微孔11内部细胞的单层单个排布，微孔11之间水平及垂直方向上间距均为40微米，微孔阵列层6上的微孔11与微电极阵列层5上微电极8一一对应，为M N的微孔阵列。

微流控盖片2上设置有进样口14和出样口15，其下表面制作有与微电极阵列区域面积一致的凹腔13，可以控制细胞缓冲液的进样、出样，以及在上述结构中的流动。进样口14、出样口15直径为2mm，凹腔13的深度为40微米，以保证细胞的自由流动。微流控盖片2应选择石英玻璃、硅片等材料。同时，该微流控盖片2下表面（包括凹腔13）溅射一层金属薄膜，形成顶层电极3。金属薄膜同样选用金、铂等导电性优异，生物相容性良好，具有极强抗氧化、抗腐蚀能力的惰性金属，采用溅射、蒸发等工艺加工于微流控盖片2上，厚度在0.5-1微米。顶层电极3边缘即超出微电极微孔阵列芯片1的区域为顶层电极的键合点17。外界电信号分别加载于微电极阵列层5的键和点10与顶层电极3的键合点17上，由于微孔11区域的体积相对于凹腔13而言较小，同时，底部的微电极8面积也小于顶层电极3面积，这样将在微孔11及临近微孔11顶部区域形成细胞排队和融合所需的高强度电场分布。

以上芯片装置的组装方法是：将带顶层电极的微流控盖片2反扣与微电极微孔阵列芯片1后，使微电极8、微孔11阵列结构与凹腔13相吻合，通过石英基底层4、多聚物微孔阵列层6、微流控盖片2上的的定位或固定孔7、12、16使用螺栓进行定位与固定。

使用本装置的电融合过程如下：

通过微流控盖片2上的进样口14进样含有目标细胞A的细胞缓冲液，通过加载正弦排队信号（Vp-p：2-10V，频率：0.1-3MHz）于微电极阵列层5的键合点10与顶层电极3的键合点17上，在微电极阵列5和顶层电极3之间形成一非均匀电场，由于微电极8尺度小，微电极8区域（微孔11内部）电场强度高，在介电电泳效应及细胞自身重力作用下，细胞将流到每一个微孔11结构中，利用微流吹出凹腔13内部多余的细胞，实现每个微孔11内部单层单个细胞的排布；再注入含有目标细胞B的细胞缓冲液，并加载排队信号（Vp-p：2-10V，频率：0.1-3MHz），进而实现微孔11内的目标细胞A与再次加载的目标细胞B之间的配对；再次加载融合信号（电压：5-60V，脉宽：20-200ms，脉冲间隔：0.1-10s，脉冲个数：1-10）实现配对后目标细胞A与目标细胞B的融合，而非均与的电场分布将保证仅仅微孔内的目标细胞A与再次加载的目标细胞B的一对一融合，避免了多细胞融合。最后注入PBS缓冲液，经出样孔15收集融合后细胞（AB）悬浮液。

本文中述及的微流控控制、非均匀电场控制等控制技术均是现有技术。其中提到的加载正弦排队信号、排队信号、融合信号等也是采用的现有技术，如可参见以下文献：曹毅，基于微电极阵列的高通量细胞电融合方法研究，重庆大学博士学位论文，2009；胡宁，高通量细胞电融合芯片及实验研究，重庆大学博士学位论文，2010；等等。