源自成人肾小球的分离的多潜能间充质干细胞(hGL-MSC)、其制备方法及其在肾脏再生医学中的用途

技术领域

本发明涉及多潜能的人类间充质干细胞，其源自成人肾脏的脱被膜的肾小 球并且显示出分化成多种细胞类型尤其是肾小球细胞类型的能力，同时，其特 征在于显著的自我更新和克隆生成能力。此外，本发明涉及制备本发明的多潜 能人类间充质干细胞的方法和此类干细胞在再生医学尤其是肾损伤和疾病的治 疗性处理中的用途。

背景技术

已知干细胞移植具有修复和再生受损的或损伤的组织和器官的潜力。因此， 近年来已经进行了深入的研究，以便从人类和动物来源鉴定并分离新的多潜能 干细胞，并研究干细胞在临床应用尤其是再生医学中的有效性。

例如，基于BrdU保留，Oliver等人[3]在成年啮齿类动物的肾乳头中鉴定 出缓慢循环的干细胞。使用相同的方法，Maeshima等人[4]在成年大鼠的肾小 管中鉴定出BrdU标记的细胞并显示出此类干细胞生成邻近的肾小管的潜力， 以及当被移植进入后肾时收集管细胞或纤维母细胞的潜力。Kitamura等人建立 并表征了来自成年大鼠肾脏的肾单位的S3部分的肾祖细胞的独特群体[37]。这 些细胞显示为具有自我更新能力并表达肾胚胎标志物，例如Pax2、Wtn4和 Wtn1。基于挤出Hoechst染料的能力，在小鼠胚胎和成人肾脏中鉴定出了具有 多潜能潜力的所谓的“边缘群体(side population”[38]。最近，Gupta等人证明： 在成年大鼠肾脏中存在多潜能肾祖细胞的常驻于肾脏中的群体，其表达胚胎干 细胞标志物，例如Oct-4和Pax-2[5]。然而，鉴于它们的来源是动物，这些多 潜能肾脏干细胞不能用于与人类组织或器官的再生相关的临床应用。

在参考文献[39]中已经公开了从胚胎性人类肾脏中鉴定出的多潜能的 CD133⁺CD24⁺干细胞群。然而，这些胚胎干细胞不是解决提供用于再生医学的 人类干细胞这一问题的最佳方案，尤其是考虑到与胚胎干细胞系以及从人类胚 胎来制备它们相关的伦理学问题。

本发明人之前公开：在成人肾脏中存在CD133⁺祖细胞/干细胞的常驻群体 [1]。发现这些CD133⁺细胞是在靠近近侧肾小管和肾小球的间质中或肾小管内 的稀少细胞，并且显示它们在体外和体内经历肾上皮和内皮分化。最近， Sagrinati等人从成年肾脏的鲍曼氏囊中分离并表征了多潜能CD133⁺CD24⁺细胞 群[2]。然而，在人类肾脏中鉴定的CD133⁺祖细胞/干细胞的特征在于自我更新 能力差。此外，没有证明此类干细胞具有分化成存在于肾小球中的多种细胞类 型即足细胞、内皮细胞和系膜细胞的能力。

Schwab等人，Human Reproduction(Oxford)，vol.22，no.11，2007年11月，第 2903-2911页公开了子宫内膜的CD146+PDGF-Rβ+CD34+间充质干细胞，其显 示出MSC的经典分化能力，即分化为成脂肪、成骨、成软骨和成肌谱系。该 论文没有提及进一步的分化能力。然而，这些细胞的子宫内膜来源强烈说明， 它们不具有产生肾小球细胞类型例如足细胞、系膜细胞和内皮细胞的能力。

WO 2008/045498公开了源自肾脏的CD34+CD133-CD105-细胞群，其能 够分化成脂肪细胞和成骨细胞。然而，没有公开其分化成肾小球细胞类型。

间充质干细胞(MSC)的特征在于它们分化成间充质来源的不同细胞系的能 力[7]。间充质干细胞的主要贮库是骨髓(BM)[8]。然而，最近在鼠模型中获得 的数据证明了MSC区室的更广泛的分布。事实上，已经在几乎所有的鼠成年 组织(脾、肌肉、肾、肺、肝、脑、胸腺)以及血管壁中检测到了MSC[6]。 在人类中，已经从循环的血液以及从数种组织例如滑膜、脂肪组织、骨小梁、 牙髓、真皮和肺中分离了MSC[9-16]。然而，目前为止尚未研究过人类肾小球 中MSC的存在。

发明内容

鉴于以上所述，需要源自成人肾脏的间充质干细胞，其能够分化为存在于 肾小球中的多种细胞类型并且能够自我更新，从而成功应用于肾的再生医学， 尤其是作为药物用于影响人类肾脏的损伤和/或疾病、更具体而言是影响肾小球 的损伤和/或疾病的治疗性处理。

通过分离的多潜能人类间充质干细胞实现了这些和其它目标，所述细胞是 由本发明人在成人肾脏的脱被膜的肾小球中鉴定并分离的。

因此，本发明的第一个方面是源自成人肾脏的分离的多潜能肾小球间充质 干细胞(hGL-MSC)，其特征在于其为CD133(阴性)、CD146(阳性)、CD34(阴性) 和CD105(阳性)。

有利地，源自成人肾脏的分离的多潜能肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)能 够分化成肾小球细胞类型，即足细胞、系膜细胞和内皮细胞。

在本发明的优选的实施方式中，hGL-MSC的特征还在于，其是CD24(阳性) 和Pax-2(阳性)。

在本发明的优选的实施方式中，hGL-MSC的特征还在于，其是α-SMA(阴 性)和Oct-4(阴性)。

本发明的另一个方面是制备本发明的hGL-MSC的方法，其包括以下步骤：

-在不存在特定生长因子的情况下，在包含含有血清的动物细胞培养基并 且在生理pH缓冲的增殖培养基中培养来自成人肾脏的脱被膜的肾小球，从而 获得从培养的脱被膜的肾小球中长出的细胞的混合群体，所述细胞的混合群体 包含纺锤形的CD133(阴性)、CD146(阳性)细胞和CD133(阳性)、CD146(阳性) 细胞；和

-从所述混合群体中分离纺锤形的CD133(阴性)、CD146(阳性)细胞，所述 纺锤形的CD133(阴性)、CD146(阳性)细胞即代表本发明的hGL-MSC。

根据优选的实施方式，所述增殖培养基在6.8至7.4、更优选7.2至7.4的 pH范围内缓冲。可以使用能够将pH维持在生理范围内的任意缓冲剂，例如 Hepes、PBS等。

在另一个优选的实施方式中，所述代表本发明的hGL-MSC的纺锤形的 CD133(阴性)、CD146(阳性)细胞分离自细胞培养物的至少第3次传代，或分离 自细胞培养物的后续传代，例如，第4次传代、第5次传代、第6次传代等。 该实施方式是基于以下事实：纺锤形的CD133(阴性)、CD146(阳性)细胞是在上 述培养条件下，细胞培养物第3次传代后发现存活的混合群体中的唯一细胞类 型。

在本发明的实施方式中，所述纺锤形的CD133(阴性)、CD146(阳性)细胞是 通过例如FACS的细胞分选方法从混合群体中分离的。或者，可以基于它们的 纺锤形状的形态进行分离。

有利地，本发明的hGL-MSC的特征在于显著的自我更新和克隆生成能力， 以及分化成多种肾小球细胞类型的能力，所述肾小球细胞类型包括但不限于内 皮细胞、系膜细胞和足细胞。这些特征使本发明的hGL-MSC特别适合用于肾 再生。

因此，本发明的另一个方面是本发明的分离的人类肾小球间充质干细胞 (hGL-MSC)作为药物用于肾脏损伤或疾病、尤其是影响肾小球的损伤或疾病的 治疗性处理的用途。

本发明的另一个方面是包含本发明的分离的人类肾小球间充质干细胞 (hGL-MSC)和药学上可接受的载体、稀释剂和/或介质的药物组合物。包含本发 明的人类肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)的药物组合物特别适合用于治疗肾脏 损伤或疾病、尤其是影响肾小球的损伤或疾病。

附图说明

本发明的其它优点和特征将通过以下详细描述并参考附图而变得明显，其 中：

图1显示了从肾小球中长出的细胞的形态和生长速率。显示了培养24小时 (A)、7天(B)、2周(C)和3周(D)后以胶原酶I处理而除掉鲍曼氏囊，培养物中 的成人肾小球的代表性显微图像(放大200倍)。显示了5种不同制备物(称作 R136、R140、R141、R147和R148)的生长曲线。

图2涉及本发明的hGL-MSC的表征。A)代表性的FACS分析，其显示： hGL-MSC对于MSC的特征性表面标志物(CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、 CD166)是阳性的，对于CD133和特异性造血标志物(CD45和CD34)是阴性的， 并且对于内皮标志物(CD31)是阴性的。虚线是同种型对照。B)以针对波形蛋白、 巢蛋白、Nanog和Musashi的抗体染色的hGL-MSC的代表性的免疫荧光显微 图像(放大600倍)。产生的所有的hGL-MSC系都显示出相同的表型。

图3显示了hGL-MSC的免疫调节性质及其克隆效率。A)代表性的FACS 分析，其显示hGL-MSC对于II类抗原和粘附分子CD154以及共刺激分子 CD80、CD86和CD40(黑线)是阴性的。虚线是同种型对照。B)加入骨髓间充 质干细胞(BM-MSC)或本发明的人类肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)抑制了 PHA诱导的PBMC增殖。在存在2.5μg/m PHA的情况下，在含有或不含5x10³/ml BM-MSC或hGL-MSC的情况下，培养PBMC(5x10⁴/ml)48小时。数据表示为 平均值±一式三份的4次独立实验的SD。^*p＜0.05(Student t检验)。C)克隆生成 效率表示为在每次培养传代中获得的克隆的百分率(％)。

图4是代表性的共聚焦显微图像，其显示了：A)CD146和CD24在肾小球 中的共表达(箭头)；B)CD133在鲍曼氏囊的壁细胞中的表达(箭头)以及在近侧 肾小管的上皮细胞中的表达(星号)；(C)在肾小球CD146(阳性)和CD24(阳性) 细胞中不存在CD133的表达(箭头)。原始放大630倍。

具体实施方式

本发明人进行的研究旨在探究在成人脱被膜的肾小球中是否存在间充质干 细胞，以及此类干细胞是否是常驻群体。此外，本发明人评估了源自肾小球的 MSC的分化潜力，尤其是分化为肾小球细胞类型例如足细胞、内皮细胞和系膜 细胞的潜力。

如在说明书的实验部分更详细地公开的那样，本发明的间充质干细胞 (hGL-MSC)获自通过手术方式切除的人类肾脏的皮层的正常部分。分离皮层并 通过分级的连续网孔之后，收集肾小球悬浮液，洗涤并通过机械和酶处理除掉 鲍曼氏囊。将脱被膜的肾小球(图1A)在含有血清的缓冲的增殖培养基中在非 分化条件下培养，也就是说，在不存在能够引导干细胞分化的特定生长因子的 条件下培养。

在7天内，观察到肾小球中长出粘附细胞(图1B)。到第12-14天时达到 汇合时，通过胰蛋白酶-EDTA处理剥离细胞单层。通过低速离心除掉肾小球残 留物，将细胞在相同的增殖培养基中增殖。在最初的培养阶段，细胞培养物中 具有形态上的异质性(图1C)，但是在大约3周(即大约第4次传代)后，培 养物变成单一形态的具有纺锤形的细胞(图1D)。图1E显示了5种不同的细 胞制备物的生长曲线。在前5次传代过程中，生长速率低，但是随着连续的亚 培养而增加，直至第20次传代(培养大约100天)，此时细胞不能再增殖。传 代之间的间隔是大约3至7天，直至第4次传代，在第4次传代之后，传代之 间的间隔设定为大约7天。

从脱被膜的肾小球中长出的纺锤形的细胞是本发明的人类肾小球间充质干 细胞(hGL-MSC)。因此，可以基于它们的形态学特征从细胞培养物中分离这些 干细胞，优选从细胞培养物的至少第3次传代或细胞培养物的后续传代，例如， 第4次传代、第5次传代、第6次传代分离。

本发明人还观察到，从脱被膜的肾小球中长出的细胞是混合的群体，其在 早期细胞传代(1-3)时包含31±11％CD133(阳性)和74±26％CD133(阴性)细胞 (n＝15个制备物)，如通过流式细胞术所检测。两种细胞群体都表达CD146。

因此，作为形态学方法的替代，可以通过细胞分选方法，例如荧光激活的 细胞分选(FACS)来分离本发明的人类肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)。优选 地，通过FACS从第2次、第3次或第4次传代分离CD133(阳性)、CD146(阳 性)细胞和CD133(阴性)、CD146(阳性)细胞；然而，也可以从任意细胞传代甚 至在亚传代之前分离它们。

表征并克隆FACS分选的群体。

发现CD133⁺CD146⁺细胞共表达标志物CD31和vWF，这表明其为内皮细 胞表型。这种CD133⁺群体不共表达巢蛋白(数据未显示)，也不共表达MSC 标志物，例如波形蛋白、CD73、CD29或CD166(数据未显示)。当从经消化 的脱被膜的肾小球的细胞悬浮液中通过免疫磁性分选CD133⁺细胞群体时，观察 到相同的表型(数据未显示)。当在存在增殖培养基的条件下在第4次传代后 表征从肾小球中长出的细胞时，无法再检测到CD133⁺细胞。

分选的CD133^-CD146⁺细胞对于MSC的特征性表面标志物(包括CD29、 CD44、CD73、CD90、CD105和CD166)[25]是阳性的，并且对于CD133和 特定的造血标志物(CD45和CD34)以及对于内皮标志物(CD31)是阴性的(图 2A)。通过免疫荧光发现，这些细胞表达MSC特异性标志物波形蛋白和神经及 肝脏常驻干细胞标志物巢蛋白[26，27，28]，显示出细胞质丝状模式(图2B)。该 细胞群体不表达上皮标志物细胞角蛋白和E-钙粘附蛋白。它也不表达通常由特 化的肾小球细胞表达的其它标志物，例如αSMA(但是系膜细胞表达αSMA)或 nephrin(但是足细胞表达nephrin)(数据未显示)。这些特征表明不存在污染性的 肾小球细胞。

还评估了标志物Nanog、Oct-4和Musashi的表达。这些分子是已知的参与 胚胎和成体干细胞的自我更新和多能性的转录因子[29-33]。本发明的干细胞群 显示出Nanog和Musashi二者的细胞核-细胞质表达(图2B)，而它不表达Oct-4 (未显示)。

还显示hGL-MSC组成型表达I类MHC抗原(图2A)，但是它们对于II类 抗原、对于粘附分子CD154以及对于共刺激分子CD80、CD86和CD40是阴性 的(图3A)，如对于BM-MSC所描述的那样[34]。此外，类似于BM-MSC(已 知其抑制PHA诱导的PBMC增殖)，hGL-MSC使PHA诱导的PBMC增殖显 著减少(图3B)。然而，不同于BM-MSC的是，hGL-MSC是CD24(阳性)和 Pax-2(阳性)的。此外发现，本发明的hGL-MSC对于α-SMA和Oct-4都是阴性 的，这不同于分离自小鼠肾脏的肾干细胞。

为了证明从肾小球获得的hGL-MSC群体的自我更新能力，本发明人在分 选的CD133⁺CD146⁺和CD133^-CD146⁺细胞上进行了克隆生成测定。将单细胞悬 浮液接种于96孔板中，分选在增殖培养基中的培养物的第3次传代时从肾小球 中长出的细胞。CD133^-CD146⁺细胞的克隆生成效率是25.3±5.1％，而 CD133⁺CD146⁺细胞不是克隆生成性的(图3C)。从CD133^-CD146⁺细胞的原代 克隆产生的单细胞悬浮液的接种提供了次级克隆，从次级克隆产生的单细胞的 接种产生三级克隆(图3C)。这些数据表明：肾小球的CD133^-CD146⁺细胞是 克隆生成性的并且在体外显示出自我更新能力，而CD133⁺CD146⁺细胞在这些 培养条件下不能产生克隆。通过流式细胞术和免疫组化方法分析了 CD133^-CD146⁺克隆，其显示出与源自未克隆的群体的hGL-MSC相同的间充质 表型(数据未显示)。当在存在增殖培养基的条件下在第4次传代后表征从肾 小球长出的未分选的细胞时，它们都显示出间充质表型，这表明所用的培养条 件对于hGL-MSC的增殖是选择性的。

本发明人还进行了旨在研究本发明的GL-MSC是否是常驻于肾的群体而非 定位于肾小球的源自BM的MSC群体的实验。为此目的，首先检测了由常驻 干细胞和源自BM的干细胞差别化表达的标志物的存在。hGL-MSC表达CD24， 但是CD24在源自BM的MSC中是阴性的并且被认为是常驻于肾的干细胞的标 志物[2，35]。器官特异性胚胎Pax-2蛋白和基因的表达也说明hGL-MSC的起源 是肾。BM-MSC不表达Pax-2。Pax-2是由后肾间充质的干细胞表达的转录因子 [36]，是由分离自成年大鼠和人类肾脏的干细胞表达的转录因子[1，5]。此外， 本发明人从由男性供体移植进入女性接受者的移植的肾脏的肾小球分离了 hGL-MSC。源自移植的肾脏的hGL-MSC显示出与源自正常肾脏的hGL-MSC 相同的表型(数据未显示)。为了测定hGL-MSC是源自接受者骨髓还是源自 移植的肾脏，在第2次和第6次传代时分析了hGL-MSC中的Y染色体的存在 情况。在第2次传代(478个细胞核；23个中期)和第6次传代(436个细胞核；25 个中期)时分析了总共914个细胞核和48个中期。双色X(绿色)/Y(红色)着丝 粒探针的杂交模式的FISH分析显示：90％的细胞核具有男性红色/绿色模式， 10％的细胞核仅具有1个绿色斑点。具有1个绿色斑点的细胞核可能源自丢失 了Y染色体的男性细胞核，Y染色体的丢失是培养中经常发生的事件。没有观 察到女性细胞核(2个绿色斑点)。hGL-MSC的所有48个中期中检测到的核 型都是男性的。以用于FISH负染的DAPI观察到的中期染色体显示为正常的。 这些数据说明：hGL-MSC不是来源于接受者的骨髓。相反，它们是供体肾脏的 肾小球中的常驻群体。

由于间充质干细胞的最主要的特征之一是它们的分化成多种间充质谱系的 能力，本发明人测评了本发明的hGL-MSC分化成特定的结缔组织细胞的能力。 在确定的培养条件下，显示了在第2个或第3个传代分选的CD133⁺CD146⁺群 体不能分化为成脂肪、成骨和成软骨谱系(数据未显示)。相反，显示了获自 15位患者的最初的CD133^-CD146⁺hGL-MSC系(在第4-10次传代)和随后获 得的4个克隆具有多谱系分化能力。

在成骨培养基中培养14天后，hGL-MSC有效地进行成骨分化，如钙沉淀 物的Alizarin Red染色所显示。

当在脂肪细胞培养基中培养21天时，hGL-MSC产生含有脂滴的细胞。在 未分化的对照中，未观察到矿化或脂滴的迹象。

使用软骨细胞选择性培养基[7]获得了hGL-MSC向软骨细胞的分化。在处 理的第28天收获的分化的沉淀物被Safranin O和Alcian蓝染色，这是软骨细胞 分化的典型特征[7]。

综上所述，这些结果证明了本发明的hGL-MSC的多谱系分化能力。值得 注意的是，以最初分离的15个hGL-MSC系和随后获自最初的细胞系的4个克 隆获得了非常相似的结果。

还评估了hGL-MSC在合适的培养条件下分化为特定的肾小球细胞群体例 如内皮细胞、足细胞和系膜细胞的能力。为了获得内皮的分化，将hGL-MSC 在EBM中在存在VEGF的情况下培养3周。流式细胞术分析显示出特定的内 皮标志物例如CD105、KDR、CD34和CD31的表达。此外，当在Matrigel中 培养时，内皮分化的hGL-MSC和非分化的细胞形成特征性的毛细管样结构(数 据未显示)。在存在PDGFbb和TGFβ1的情况下，hGL-MSC获得了系膜样表 型。特别地，它们获得了α-SMA和血管紧张素2受体1(AT1)的表达。当在存 在20μM/L ATRA的情况下培养3周时，hGL-MSC获得了特定的上皮标志物的 表达，所述上皮标志物是足细胞表达的标志物例如细胞角蛋白、podocin、nephrin 和突触极蛋白。通过实时PCR确认了nephrin的表达，其显示在分化成足细胞 后的hGL-MSC中存在nephrin转录物，但在维持在阻止分化的增殖培养基中的 hGL-MSC中不存在。测试的3个克隆的细胞系获得了相似的结果。

在所有的实验条件下，分化的细胞丧失了干细胞性质相关的标志物，例如 Nanog、Musashi、波形蛋白、巢蛋白、CD90、CD146、CD73，系膜和内皮分 化的细胞除外，它们保持了通常由成熟细胞表达的CD90和CD146(数据未显 示)。所有的hGL-MSC细胞系和克隆都显示出相同的分化能力。源自BM的 MSC在相同培养条件下能够分化成内皮细胞和肌肉样细胞，但是不分化成足细 胞样细胞(数据未显示)。

总之，本发明人研究了预先脱被膜的人类肾小球中干细胞的存在，脱被膜 是为了避免与鲍曼氏囊相关的干细胞的存在。发现在早期传代时从脱被膜的肾 小球长出的细胞由2个不同群体组成：CD133⁺CD146⁺群体和CD133^-CD146⁺群 体。CD133⁺细胞很可能是内皮定向的细胞群体，因为它们共表达内皮标志物。 此外，CD133⁺CD146⁺细胞在第3次传代后不存活。另外，当分选CD133⁺CD146⁺群体时，其不能够自我更新并且不是克隆生成性的。

相反，发现从脱被膜的人类肾小球分离和克隆的CD133^-CD146⁺群体是能 够产生长期培养物的间充质干细胞的多潜能群体。有趣的是，它们是从肾小球 中长出的在第4次细胞传代培养后唯一存活的细胞。这些细胞被称作 hGL-MSC。hGL-MSC与源自BM的MSC以及源自其它成体组织的MSC[9-16， 26-28]共有下列特征：表达CD29、CD44、CD166、CD73、CD90、CD105、CD146、 波形蛋白和巢蛋白；无CD34和CD45；进行中胚层分化的能力(骨细胞、软骨 细胞和脂肪细胞)。此外，hGL-MSC表达参与细胞维持的Nanog和Musashi 胚胎标志物。类似于源自BM的MSC，hGL-MSC能够抑制PHA诱导的PBMC 的增殖。来自成年小鼠的非肾小管Sca-1+lin-多潜能干细胞/祖细胞[40]和源自 心脏、脾和外周脂肪的人类MSC[41]显示出类似的免疫调节效应。

成体器官中的MSC的起源是有争议的。在本研究中，本发明人发现：分 离的hGL-MSC具有常驻于肾的干细胞的表型特征。事实上，与BM-MSC不同 的是，hGL-MSC表达CD24，CD24被认为是常驻于肾的祖细胞的标志物[2，35]， 还表达Pax-2胚胎器官特异性转录因子[1，5，36]。以前已经证明，Pax-2的表 达是常驻于肾的干细胞群体的标志物[1，5，36]。此外，具有供体的性别特征的 hGL-MSC在肾同种移植物中的存在提供了证据证明了局部常驻于成人肾小球 中的MSC群体的存在。该结果与之前来自于肺移植研究的关于在人类肺中提 供的常驻于组织的MSC的证据是一致的[16]。

hGL-MSC在合适的培养条件下分化成内皮细胞和分化成特定的肾小球谱 系例如足细胞和系膜样细胞的能力显示出它的肾定向。事实上，当在存在ATRA 和IV型胶原的情况下培养时，hGL-MSC能够分化成表达特异于足细胞的裂孔 隔膜的标志物例如nephrin、突触极蛋白和podocin的上皮细胞。这与BM-MSC 不同。

通过在存在TGFβ1和PDGF-bb(已经报道TGFβ1和PDGF-bb诱导源自 BM的多潜能成年祖细胞中的平滑肌细胞分化[20])的混合物的情况下培养细 胞，获得了hGL-MSC向肾小球系膜细胞的分化。此外，hGL-MSC显示出免疫 调节性质，因为它们抑制PHA刺激的PBMC的增殖，类似于BM-MSC[23-25]。 hGL-MSC的免疫调节活性与炎性肾小球疾病相关。

总之，本研究的结果证明在成人脱被膜的肾小球中存在常驻的多潜能干细 胞的群体，其表达间充质表型，具有促成不同的肾小球特异性细胞类型的转变 的潜力。

在以下的实验部分更详细地描述了从成人肾小球中分离本发明的人类肾小 球间充质干细胞以及它们的特征性特征，其仅是通过解释的方式提供，不是意 在限制如随附的权利要求定义的本发明的范围。

实验部分

材料和方法

源自人类肾小球和骨髓的间充质干细胞的分离和培养

来自肾小球的人类间充质干细胞(hGL-MSC)获自通过手术切除的肾脏(15 例不同的制备物)的皮质的正常部分。分离皮质并通过分级的连续网孔(60和 120孔)之后，收集肾小球悬浮液，以Hans Balanced Salt Solution(GIBCO，Grand  Island，NY)洗涤并通过机械方式和酶学方式除掉鲍曼氏囊，所述机械方式为使 用10ml的吸液管进行数轮的吸液/排液，所述酶学方式为以胶原酶I(Sigma，St. Louis，MO)消化2分钟。将脱被膜的肾小球转移至纤连蛋白包被的T25培养瓶 (Falcon，BD Bioscience，Two Oak Park，Bedford，MA)中。

比较了数种培养基。在存在1X ITS(Sigma)和Hepes(游离的酸，10mM) (Sigma)的情况下，含有10％FCS(Euroclone，Wetherby，UK)的RPMI(Sigma)(增 殖培养基)允许hGL-MSC的最佳扩增，因此其被用于以下的实验。

按照以前的描述从BM中分离人类MSC并进行培养[7]。

生长动力学

按照之前的描述生成描述培养物动力学的生长曲线[6]。为了简化起见，将 原代hGL-MSC培养物占据的生长面积(对应于25cm²)假设为1。当发生第2 次传代时，将第1次传代时的分传比(1∶3)乘以该数值，也就是说，在第1次传 代结束时，累积生长面积是3(即，原代培养物的占据的生长的3倍)。在第2 次传代结束时，第2次传代时的分传比(1∶3)乘以第1次传代时的累积生长面积 (3x3＝9)。对于每次传代都重复该程序，从而提供与细胞数目成正比的理论生长 曲线。在5例不同的肾小球制备物中评测生长情况。

源自肾小球的间充质干细胞的表征

按照之前的描述进行细胞荧光测定分析[1]，使用下列抗体，其全部是藻红 蛋白(PE)或荧光素异硫氰酸盐(FITC)缀合的：抗-CD105、抗-CD29、抗-CD31、 抗-CD146、抗-CD44、抗-CD24、抗-CD90(Dakocytomation，Copenhagen， Denmark)；抗-CD73、抗-CD34、抗-CD45、抗-CD80、抗-CD86、抗-CD166、 抗-HLA-I(Becton Dickinson Biosciences Pharmingen，San Jose，CA)；抗-CD133 (Miltenyi Biotec，Auburn)；KDR(R&D Systems，Abington，U.K.)；抗-HLA-II (Chemicon International Temecula，CA)，抗-CD40(Immunotech，Beckman  Coulter)，抗-CD154(Serotec，Raleigh，NC USA)单克隆抗体。小鼠IgG同种型对 照来自Dakocytomation。所有的温育在含有0.1％牛血清白蛋白和0.1％叠氮化 钠的100μl磷酸盐缓冲液(PBS)中在4℃进行。对于每个样品，在FACSCalibur 细胞仪(BD Biosciences Pharmingen)上分析10,000个细胞。基于阴性对照构建 闸门，在所进行的所有分析中都包括补偿对照。使用Cell Quest软件(BD  Biosciences Pharmingen)对来自每次实验的设闸门的群体产生群体百分率和数 目。

在未分化的或分化的hGL-MSC上进行间接免疫荧光分析，所述hGL-MS 培养于腔室玻片(Nalgen Nunc International，Rochester，NY，USA)上，以含有2％ 蔗糖的4％多聚甲醛固定，如果需要，以Hepes-Triton X 100缓冲液(Sigma)进 行通透化处理。使用下列单克隆抗体：抗-波形蛋白(Sigma)、抗-细胞角蛋白 (Biomeda，Foster City CA)、抗-E-钙粘附蛋白(Dakocytomation)，α-平滑肌肌动蛋 白(αSMA)(Dakocytomation)、抗-突触极蛋白(Progen Biotechnik，Heidelberg)。 使用了抗-von Willebrand因子(vWF)(Dakocytomation)、抗-巢蛋白(Chemicon  International)、抗-Pax-2(Covance，Princeton，NJ)、抗-Nanog、抗-Oct-4、抗-Musashi (AbCam，Cambridge，Science Park Cambridge UK)、抗-podocin、抗-血管紧张素 II受体1(AT1)(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)兔多克隆抗体和猪多 克隆抗-Nephrin(Progen Biotechnik)。视需要使用下列对照：不加初级抗体；或 将初级抗体替换为非免疫兔、大鼠或小鼠IgG。Alexa Fluor 488抗-兔子或抗- 猪IgG和Texas Red抗-小鼠IgG(Molecular Probes，Leiden，The Netherlands)用作 次级抗体。使用Zeiss LSM 5 Paseal Model Confocal Microscope(Carl Zeiss  International，Germany)进行共聚焦显微镜分析。加入Hoechst 33258染料(Sigma) 进行细胞核染色。

标志物表达特征谱的总结

下面的表1提供了本发明的人类肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)的标志物 表达特征谱的总结

表1

Fish研究

从由男性供体移植到女性接受者的移植的肾脏的肾小球中分离hGL-MSC。 该患者是45岁的女性，接受男性移植物的移植。移植物是在通过活组织检查诊 断局灶性肾小球硬化症后9个月由于对治疗有抗性的严重的肾症状的复发而移 植的。

亚汇合时的培养物(70％)与终浓度为0.01μg/ml的Velbe一起过夜温育 (16-18h)。使细胞沉淀下来并将沉淀物重悬于低渗溶液(0.2g KCl+0.2g柠檬酸 钠/100ml)。在37℃温育20分钟后，将细胞在3∶1的甲醇-乙酸中固定并在-20℃ 贮存18小时。通过将大约50μl悬浮液滴至洁净的载玻片上来制备中期染色体， 使其在空气中干燥，然后使用相差显微镜观察。

使用商售的X(绿色)和Y(红色)染色体着丝粒探针和Y经典卫星III不同颜 色的探针(Aquarius Cytocell，Cambridge，UK)进行FISH研究。根据生产商的说 明书制备探针并将其变性。将制备的探针施加至含有变性的中期和细胞核的载 玻片上(在70℃在70％甲酰胺/2x SSC中持续1.45分钟)，并盖上盖玻片。在37℃ 进行过夜杂交。然后在72℃在0.4x SSC中洗涤载玻片1次，洗涤2分钟，然 后在室温在4x SSC+Tween 20(Sigma)中第二次洗涤，洗涤5-10分钟。以DAPI 负染染色体和细胞核，并在抗-褪色溶液中封片。通过直接的显微镜观察(Nikon  epifluorescent microscope)来分析样品，以鉴定男性(XY)/女性(XX)细胞核和中 期。使用Cytovision Cytogenetics Image Analysis System获得数码图像。

免疫磁性分离、细胞分选和细胞克隆

从新鲜的脱被膜的肾小球或从第2次或第3次传代时的细胞培养物中通过 免疫磁性方式分离细胞。分离并通过分级的连续网孔后，以胶原酶I(Sigma)消 化脱被膜的肾小球的悬浮液8分钟，使用MACS系统(Miltenyi Biotech)，通过 磁性细胞分选法分离CD133⁺细胞。

通过细胞分选法(MoFlo^TM，Dakocytomation)分离来自于在增殖培养基中培 养的第二次和第三次传代的从肾小球中长出的群体的CD133⁺CD146⁺和 CD133^-CD146⁺细胞，通过细胞分选，通过将单细胞悬浮液接种于96孔板中来 表征、培养和克隆这两个群体。分析了得到的克隆的数目、形态和动力学，选 择其中一些进行亚克隆和分化测定。

体外分化

按照之前的描述[7]测定hGL-MSC的成脂肪、成骨和成软骨分化能力。

简而言之，将hGL-MSC在成脂肪培养基(Lonza，Basel Switzerland)中培养3 周。为了评估分化情况，在室温以4％的多聚甲醛将细胞固定20分钟，并在室 温以甲醇(Sigma)中的0.5％的油红O(Sigma)染色20分钟。

通过在成骨培养基(Lonza)中培养hGL-MSC来测定成骨分化情况。每周更 换2次培养基，持续3周。为了评估分化情况，在室温以4％的多聚甲醛将细 胞固定20分钟，并以pH 4.1的Alizarin Red(Lonza)染色20分钟。

对于成软骨分化，将2.5x10⁵个hGL-MSC在15-ml锥形聚丙烯管(Falcon  BD Bioscience)中以150g离心5分钟，以DMEM洗涤2次。将细胞沉淀物在补 充了10ng/ml转化生长因子β3(Lonza)的成软骨培养基(Lonza)中培养。每3天 更换培养基，持续28天。将细胞沉淀物固定于4％的多聚甲醛中过夜，以0.1％ 的番红O(Sigma)就葡萄糖胺聚糖对石蜡包埋的切片进行染色，以1％的阿尔新 蓝就硫酸化蛋白聚糖进行染色。

按照之前的描述[17]，通过在含有血管内皮生长因子(VEGF，10ng/ml， Sigma)的内皮基础培养基(EBM)(Lonza)中培养hGL-MSC 3周来获得内皮细胞 分化。

通过在含有全反式维甲酸(ATRA，Sigma，20μmol/L)的增殖培养基中培养 hGL-MSC 3周来获得足细胞分化[18]。在包被了IV型胶原(Sigma)的腔室玻片 中进行分化[19]。

通过在含有10％FCS、TGF-β1(2.5ng/ml，Sigma)[20]和PDGFbb(5ng/ml  Sigma)[21]的高葡萄糖的DMEM中培养hGL-MSC 6天来获得系膜分化。在包 被了纤连蛋白的腔室玻片中进行分化。

实时PCR

按照之前的描述[22]进行定量逆转录PCR。使用High Capacity cDNA逆转 录试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA 94404，USA)，从总RNA中产生 cDNA的第一条链。简而言之，在每个cDNA合成中，使用1或2μg mRNA，2 μl RT缓冲液，0.8μl dNTP混合物，2μl RT随机引物，1μl MultiScribe逆转录酶和 4.2μl无核酸酶的水。逆转录之后，将cDNA储存于-20℃。使用48-孔的 StepOne^TM实时系统(Applied Biosystems)，使用SYBR-green实时检测PCR产 物，以此通过实时PCR来进行相对定量。为了进行实时PCR，使用下列序列特 异性寡核苷酸引物，它们均购自MWG-Biotech AG，Ebersberg，Germany：(i)在 参考文献[22]中公开的人类nephrin正向和反向引物；(ii)在参考文献[1]中公开 的人类PAX2正向和反向引物；和(iii)在参考文献[1]中公开的人类β-肌动蛋白 正向和反向引物。Power SYBRGreen PCR Master Mix购自Applied  Biosystems。热循环条件如下：在95℃将AmpliTaq GoldDNA聚合酶LD活 化10分钟，然后是“95℃，15秒”和“60℃(对于nephrin、pax2和对于β-肌动蛋 白)，1分钟”的45个扩增循环。为了检测扩增的对数期，在每个循环中检测荧 光水平(产物的定量)。记录荧光达到阈值时的循环数，在一式三份中取平均 值，并就β-肌动蛋白的阈值的平均循环数进行标准化。计算所有的样品的相对 于对照的表达倍数的变化。

同种外周血单核细胞-MSC共培养物

在改良的混合的细胞培养物中，在Histopaque-1077(Sigma)上进行来自健 康志愿者的外周血单核细胞(BPMC)的分离，并将其用作响应细胞，同种MSC 用作刺激细胞，如参考文献[23，24]中所描述。简而言之，将hGL-MSC一式三 份以5x10³个细胞/ml在96孔板上铺板于100μl完全培养基中，并使其向塑料 粘附1至2小时。将PBMC以5x10⁴个细胞/ml重悬并加入到含有或不含GL-MSC 的孔中(体积为100μl)，其中含有或不含终浓度为2.5μg/ml的有丝分裂原植物 血凝素(PHA，Sigma)。GL-MSC与PBMC的比例是1∶10。来自BM的人类MSC 用作对照。将培养物维持16-48小时，在该培养阶段后，评估淋巴细胞的增殖。

通过DNA的合成来研究细胞增殖情况，根据生产商的说明书，使用酶联 免疫吸附测定试剂盒(Chemicon International)，测定掺入到细胞DNA中的5-溴 -2′-脱氧尿苷(BrdU)，以此来检测DNA的合成。数据表示为刺激指数(SI)值，其 按照参考文献[23]中的描述来计算。对于描述的每个点，至少进行3次实验。

统计学分析

数据表示为平均值±来自3次或更多次实验的标准偏差。通过双侧Student t 检验测定统计上的显著性。

体内定位研究

本发明人还进行了实验以确定本发明的干细胞群在人类肾脏中的体内定 位。结果显示于图4。通过免疫荧光研究共表达CD24(阳性)的CD146(阳性)和 CD133(阴性)细胞在肾小球中的存在。如图4所示，在肾小球中检测到共表达 CD24(阳性)的CD146(阳性)细胞(平均值2.22±0.2/肾小球，n＝60)，并且这些 细胞是CD133阴性的。此外，肾小球簇中的内皮细胞表达CD146；观察到CD133 (阳性)细胞主要是在鲍曼氏囊中。

参考文献

1.Bussolati B，Bruno S，Grange C，Buttiglieri S，Deregibus MC，Cantino D， Camussi G.源自成人肾脏的肾祖细胞的分离(Isolation of renal progenitor cells  from adult human kidney).Am J Pathol.2005；166：545-5.

2.Sagrinati C，Netti GS，Mazzinghi B，Lazzeri E，Liotta F，Frosali F，Ronconi  E，Meini C，Gacci M，Squecco R，Carini M，Gesualdo L，Francini F，Maggi E， Annunziato F，Lasagni L，Serio M，Romagnani S，Romagnani P.源自成人肾脏鲍 曼氏囊的多潜能祖细胞的分离和表征(Isolation and characterization of  multipotent progenitor cells from the Bowman′s capsule of adult human kidneys).J  Am Soc Nephrol.2006；17：2443-56.

3.Oliver JA，Maarouf O，Cheema FH，Martens TP，Al-Awqati Q.肾乳头是 成体肾干细胞的生态位(The renal papilla is a niche for adult kidney stem cells).J  Clin Invest.2004；114：795-804.

4.Maeshima A，Yamashita S，Nojima Y.参与肾脏再生过程的肾祖细胞样肾 小管细胞的鉴定(Identification of renal progenitor-like tubular cells that participate  in the regeneration processes of the kidney).J Am Soc Nephrol.2003；14：3138-46.

5.Gupta S，Verfaillie C，Chmielewski D，Kren S，Eidman K，Connaire J， Heremans Y，Lund T，Blackstad M，Jiang Y，Luttun A，Rosenberg ME.源自肾的 干细胞的分离和表征(Isolation and characterization of kidney-derived stem cells). J Am Soc Nephrol.2006；17：3028-40.

6.da Silva Meirelles L，Chagastelles PC，Nardi NB.间充质干细胞实际上停 留在所有出生后器官和组织(Mesenchymal stem cells reside in virtually all  post-natal organs and tissues).J Cell Sci.2006；119：2204-13.

7.Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，Jaiswal RK，Douglas R，Mosca JD， Moorman MA，Simonetti DW，Craig S，Marshak DR.成人间充质干细胞的多谱系 潜能(Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells).Science 1999； 284：143-7.

8.Prockop DJ.髓性基质细胞作为干细胞用于非造血组织(Marrow stromal  cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.Science.1997；276：71-4.

9.Zvaifler NJ，Marinova-Mutafchieva L，Adams G，Edwards CJ，Moss J， Burger JA，Maini RN.在正常个体血液中的间充质前体细胞(Mesenchymal  precursor cells in the blood of normal individuals).Arthritis Res.2000；2：477-88.

10.De Bari C，Dell’Accio F，Tylzanowski P，Luyten FP.源自成人滑膜的 多潜能间充质干细胞(Multipotent mesenchymal stem cells from adult human  synovial membrane).Arthritis Rheum.2001；44：1928-42.

11.Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，Huang J，Futrell JW，Katz AJ，Benhaim P， Lorenz HP，Hedrick MH.源自人类脂肪组织的多谱系细胞：基于细胞的治疗的 应用(Multilineage cells from human adipose tissue：implications for cell-based  therapies).Tissue Eng.2001；7：211-28.

12.U，Osyczka AM，Tuli R，Hickok NJ，Danielson KG，Tuan RS.源 自骨小梁的细胞的多谱系间充质分化潜能(Multilineage mesenchymal  differentiation potential of human trabecular bone-derived cells).J.Orthop.Res. 2002；20：1060-9.

13.Gronthos S，Mankani M，Brahim J，Robey PG，Shi S.体外和体内的出 生后人牙髓干细胞(Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and in  vivo).Proc Natl Acad Sci U S A.2000；97：13625-30.

14.Young HE，Steele TA，Bray RA，Hudson J，Floyd JA，Hawkins K， Thomas K，Austin T，Edwards C，Cuzzourt J，Duenzl M，Lucas PA，Black AC Jr. 人类贮备多潜能间充质干细胞存在于源自胚胎、成人和老年人供体的骨骼肌和 真皮的结缔组织(Human reserve pluripotent mesenchymal stem cells are present in  the connective tissues of skeletal muscle and dermis derived from fetal，adult，and  geriatric donors).Anat Rec.2001；264：51-62.

15.Sabatini F，Petecchia L，Tavian M，Jodon de VillerochéV，Rossi GA， Brouty-BoyéD.人支气管纤维原细胞显示间充质干细胞表型和多谱系分化潜能 (Human bronchial fibroblasts exhibit a mesenchymal stem cell phenotype and  multilineage differentiating potentialities).Lab Invest.2005；85：962-71.

16.Lama VN，Smith L，Badri L，Flint A，Andrei AC，Murray S，Wang Z， Liao H，Toews GB，Krebsbach PH，Peters-Golden M，Pinsky DJ，Martinez FJ， Thannickal VJ.来自移植的同种异体移植物的研究的在成人肺内的常驻于组织 的间充质干细胞的证据(Evidence for tissue-resident mesenchymal stem cells in  human adult lung from studies of transplanted allografts).J Clin Invest.2007；117： 989-96.

Rafii S，Lyden D，Benezra R.血管和造血干细胞：抗血管发生治疗的新靶 标？(Vascular and haematopoietic stem cells：novel targets for anti-angiogenesis  therapy？)Nat Rev Cancer 2002；2：826-35.

17.Vaughan MR，Pippin JW，Griffin SV，Krofft R，Fleet M，Haseley L， Shankland SJ.ATRA在体外和体内诱导足细胞分化并改变nephrin和podocin表 达(ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin  expression in vitro and in vivo).Kidney Int.2005；68：133-44.

18.Perry J，Tam S，Zheng K，Sado Y，Dobson H，Jefferson B，Jacobs R， Thorner PS.IV型胶原体外诱导骨髓基质干细胞的足细胞特征(Type IV collagen  induces podocytic features in bone marrow stromal stem cells in vitro).J Am Soc  Nephrol.2006；17：66-76.

19.Ross JJ，Hong Z，Willenbring B，Zeng L，Isenberg B，Lee EH，Reyes M， Keirstead SA，Weir EK，Tranquillo RT，Verfaillie CM.多潜能成体祖细胞向功能 性平滑肌细胞的细胞因子诱导的分化(Cytokine-induced differentiation of  multipotent adult progenitor cells into functional smooth muscle cells).J Clin Invest. 2006；16：3139-49.

20.Suzuki A，Iwatani H，Ito T，Imai E，Okabe M，Nakamura H，Isaka Y， Yamato M，Hori M.M.源自血小板的生长因子对于将骨髓细胞转变为肾小球系 膜样细胞起关键作用(Platelet-derived growth factor plays a critical role to convert  bone marrow cells into glomerular mesangial-like cells).Kidney Int.2004；65： 15-24.

21.Collino F，Bussolati B，Gerbaudo E，Marozio L，Pelissetto S，Benedetto  C，Camussi G.惊厥前血清诱导nephrin通过内皮肾小球细胞释放内皮素-1从足 细胞脱落(Pre-eclamptic sera induce nephrin shedding from podocytes through  endothelin-1 release by endothelial glomerular cells).Am J Physiol Renal Physiol. 2008 Feb 20；[Epub ahead of print]

22.Di Nicola M，Carlo-Stella C，Magni M，Milanesi M，Longoni PD， Matteucci P，Grisanti S，Gianni AM.人骨髓基质细胞抑制由细胞或非特异性促 有丝分裂刺激诱导的T淋巴细胞增殖(Human bone marrow stromal cells suppress  T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli). Blood.2002；99：3838-43.

23.Aggarwal S，Pittenger MF.人类间充质干细胞调节异源免疫细胞应答 (Human mesenchymal stem cells modulate allogenic immune cell response). Blood 2005；105：1815-22.

24.Chamberlain G，Fox J，Ashton B，Middleton J.Concise review：间充质 干细胞：它们的表型、分化能力、免疫学特征和归巢潜能(mesenchymal stem cells： their phenotype，differentiation capacity，immunological features，and potential for  homing).Stem Cells.2007；25：2739-49.

25.El-Helou V，Dupuis J，Proulx C，Drapeau J，Clement R，Gosselin H， Villeneuve L，Manganas L，Calderone A.在正常和损伤大鼠心肌中检测到常驻巢 蛋白+神经样细胞和纤维(Resident nestin+neural-like cells and fibers are detected  in normal and damaged rat myocardium).Hypertension.2005；46：1219-25.

26.Mayer EJ，Carter DA，Ren Y，Hughes EH，Rice CM，Halfpenny CA， Scolding NJ，Dick AD.源自成人尸检视网膜的神经祖细胞(Neural progenitor  cells from postmortem adult human retina).Br J Ophthalmol.2005；89：102-6.

27.Herrera MB，Bruno S，Buttiglieri S，Tetta C，Gatti S，Deregibus MC， Bussolati B，Camussi G.源自成人肝脏的干细胞群的分离与表征(Isolation and  characterization of a stem cell population from adult human liver).Stem Cells.2006； 24：2840-50.

28.Hatano SY，Tada M，Kimura H，Yamaguchi S，Kono T，Nakano T， Suemori H，Nakatsuji N，Tada T.与Nanog活性相关的细胞的多潜能 (Pluripotential competence of cells associated with Nanog activity).Mech Dev. 2005；122：67-79.

29.Cavaleri F，Scholer HR.Nanog：胚胎干细胞团队中的新成员(Nanog：a  new recruit to the embryonic stem cell orchestra).Cell 2003；113：551-2.

30.Tai MH，Chang CC，Kiupel M，Webster JD，Olson LK，Trosko JE.在成 人干细胞中的Oct4表达：支持致癌作用的干细胞理论的证据(Oct4 expression  in adult human stem cells：evidence in support of the stem cell theory of  carcinogenesis).Carcinogenesis.2005；26：495-502.

31.Potten CS，Booth C，Tudor GL，Booth D，Brady G，Hurley P，Ashton G， Clarke R，Sakakibara S，Okano H.推断的肠干细胞和早期谱系标志物musashi-1 的鉴定(Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage  marker；musashi-1).Differentiation.2003；71：28-41.

32.Sugiyama-Nakagiri Y，Akiyama M，Shibata S，Okano H，Shimizu H. RNA-结合蛋白Musashi在毛囊发育和毛发周期进展中的表达(Expression of  RNA-binding protein Musashi in hair follicle development and hair cycle  progression).Am J Pathol.2006；68：80-92.

33.Le Blanc K，Tammik C，Rosendahl K，Zetterberg E，Ringdén O.分化和 未分化的间充质干细胞的HLA表达和免疫学特征(HLA expression and  immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem  cells).Exp Hematol.2003；31：890-96.

34.Challen GA，Martinez G，Davis MJ，Taylor DF，Crowe M，Teasdale RD， Grimmond SM，Little MH.肾祖细胞分子表型的鉴定(Identifying the molecular  phenotype of renal progenitor cells).J Am Soc Nephrol.2004；15：2344-57.

35.Oliver JA，Barasch J，Yang J，Herzlinger D，Al-Awqati Q.后肾间充质 包含胚胎肾干细胞(Metanephric mesenchyme contains embryonic renal stem  cells).Am J Physiol.2002；283：F799-F809.

36.Kitamura S，Yamasaki Y，Kinomura M，Sugaya T，Sugiyama H， Maeshima Y，Makino H.源自成熟大鼠肾脏的肾单位S3部分的肾祖细胞样细胞 的建立和表征(Establishment and characterization of renal progenitor like cells  from S3 segment of nephron in rat adult kidney).FASEB J.2005；19：1789-97.

37.Challen GA，Bertoncello I，Deane JA，Ricardo SD，Little MH.肾副群体 显示多谱系能力和肾功能容量以及细胞异种性(Kidney side population reveals  multilineage potential and renal functional capacity but also cellular heterogeneity). J Am Soc Nephrol.2006；17：1896-1912.

38.Lazzeri E，Crescioli C，Ronconi E，Mazzinghi B，Sagrinati C，Netti  GS，Angelotti ML，Parente E，Ballerini L，Cosmi L，Maggi L，Gesualdo L，Rotondi  M，Annunziato F，Maggi E，Lasagni L，Serio M，Romagnani S，Vannelli GB， Romagnani P.胚胎肾多潜能祖细胞在急性肾衰中的再生能力(Regenerative  potential of embryonic renal multipotent progenitors in acute renal failure).J Am  Soc Nephrol.2007；18：3128-3138.

39.Dekel B，Zangi L，Shezen E，Reich-Zeliger S，Eventov-Friedman S， Katchman H，Jacob-Hirsch J，Amariglio N，Rechavi G，Margalit R，Reisner Y.源 自成年小鼠肾脏的非肾小管sca-1+lin-多潜能干细胞/祖细胞的分离和表征 (Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin-multipotent  stem/progenitor cells from adult mouse kidney).J Am Soc Nephrol.2006；17： 3300-3314.

40.Hoogduijn MJ，Crop MJ，Peeters AM，Van Osch GJ，Balk AH，Ijzermans  JN，Weimar W，Baan CC.源自人类心脏、脾和肾脏外脂肪的间充质干细胞具 有免疫调节能力(Human heart，spleen，and perirenal fat-derived mesenchymal stem  cells have immunomodulatory capacities).Stem Cells Dev.2007；16：597-604.