家养鹧鸪(石鸡)源性成分实时荧光PCR检测引物与探针

技术领域

本发明涉及动物物种和动物源性成分鉴定技术领域，具体涉及一种用于检测家养鹧鸪(石 鸡)源性成分的检测方法，尤其涉及一对用于检测家养鹧鸪(石鸡)细胞线粒体核苷酸序列 的引物探针。

背景技术

世界各国政府大多将食品安全、饲料安全视为涉及国家公共安全的问题，并纷纷加大监 管力度，特别是在出入境和市场的畜禽肉类食品、饲料及其商品的检验检疫工作方面，加强 了监控畜禽肉类食品及其饲料的动物源性产品安全监测技术研究，该检测技术的研究与应用 越来越受到重视。

实时荧光PCR扩增目的片段是线粒体DNA。线粒体DNA是高等动物唯一的核外遗传物质， 是一个比较理想的用于物种鉴别检测的靶基因序列，其主要原因是：(1)在所有组织细胞中 均含有大量的线粒体，可以获得大量的mtDNA，mtDNA在不同的物种间具有高度的变异性；每 个动物细胞中存在许多拷贝的线粒体基因组，在采取相同体积的DNA样品进行PCR检测时， 线粒体基因组的模板数大大高于细胞核基因组的模板数，这就大大提高了PCR检测的灵敏 度。(2)mtDNA主要以编码序列构成，种内的异质基因很少。(3)不同种类的动物线粒体基 因组序列虽然高度同源，存在高度保守区域，但也存在一定的变异区域。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测家养鹧鸪(石鸡)源性成分的引物和探针。以解决准确、 快速、可靠的用实时荧光PCR技术鉴定家养鹧鸪(石鸡)源性成分。

本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现：

用于检测家养鹧鸪(石鸡)源性成分线粒体中COI的引物和探针序列包括：

上游引物F的序列为：5’-CAGGCTTTACCCTACACCCC-3’；

下游引物R的序列为：5’-AGTATCGGCGAGGTATGCCG-3’；

探针序列P的序列为：5’(FAM)-AGCACACTTCGGAGTTATGTTTGT-3’(ECLIPSE)。

本发明的原理为：在传统的PCR扩增体系中加入一个与靶序列特异互补的荧光标记寡核 苷酸探针，探针的5’端设计了一个报告荧光基因FAM，3’端设计了一个淬灭基因ECLIPSE。 在探针完整的情况下，报告荧光基因发出荧光被淬灭基因吸收，此时检测不到荧光信号。当 有特异PCR产物时，复性状态下标记探针与靶序列结合互补，形成局部双链适合于5’-3’核酸 外切活性的底物，激活Taq聚合酶的5’外切酶活性，将5’的荧光分子切除，报告荧光基因 与淬灭基因分离，淬灭作用被解除，产生荧光信号，通过荧光定量PCR仪实时检测荧光度， 通过荧光度的变化来反应是否扩增。

附图说明：

图1家养鹧鸪(石鸡)引物和探针特异性荧光PCR图

图中A5：鸡；B5：鸭；C5：鹅；D5：火鸡；E5：鸽子；F5：鸵鸟；G5：鹌鹑；H5：牛；A6：山羊；B6：猪；C6：绵 羊；D6：兔；E6：鱼；F6：鹿；G6：狗；H6：驴；D8：马E8：阴性对照；F8：石鸡

图2家养鹧鸪(石鸡)引物和探针灵敏度荧光PCR检测图

图中A：10^-1纯石鸡肉样DNA；B：10^-2纯石鸡肉样DNA；C：10^-3纯石鸡肉样DNA；D：10^-4纯石 鸡肉样DNA；E：10^-5纯石鸡肉样DNA；F：10^-6纯石鸡肉样DNA；G：10^-7纯石鸡肉样DNA；H： 阴性对照

具体实施方式：

以下据所示最佳实施例对本发明作进一步详述。应理解，实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。

1.引物和探针的设计：通过在动物分类学中相近的种如鸡和鹌鹑线粒体基因序列比较分 析，选择高保守区段的COI基因设计并优化引物和探针，序列如下：

上游引物F的序列为：5’-CAGGCTTTACCCTACACCCC-3’；

下游引物R的序列为：5’-AGTATCGGCGAGGTATGCCG-3’；

探针序列P的序列为：5’(FAM)-AGCACACTTCGGAGTTATGTTTGT-3’(ECLIPSE)。

2.样品总DNA的提取

采用氯仿抽提法或商业DNA提取试剂盒，提取鸡、鸭、鹅、火鸡、鸽子、鸵鸟、鹌鹑、 牛、山羊、猪、绵羊、兔、鱼、鹿、狗、驴、马、石鸡动物的基因组DNA，提取的基因组 DNA均经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD₂₆₀/OD₂₈₀值均为1.8左右，说明DNA 纯度较高符合PCR扩增要求。

3.家养鹧鸪(石鸡)源性成分实时荧光PCR检测

利用步骤1设计的特异性引物和探针，以家养鹧鸪(石鸡)DNA为模板并设阴性对照进 行PCR扩增。

3.1实时荧光PCR反应体系为20μL，包括10μL 2×real time PCR Buffer(包含有dNTP， Mg2+以及Taq酶等)，上下游引物F/R各0.4μL(终浓度为0.2μM)，探针P 0.4μL(终浓 度为0.2μM)，DNA模板2μL，超纯水补至20μL。可采用商业化的实时荧光PCR反应母 液。

3.2实时荧光PCR反应程序为：预变性95℃30sec；然后95℃15sec，60℃34sec循环 40次。

进行PCR反应，反应结束后保存文件，打开分析软件，分析实验结果，给出ΔRn(第n 个循环时的荧光增加值)与循环数图像，阳性样品出现明显的“S”状扩增曲线。

4.引物和探针的特异性验证

利用所设计鉴别检测家养鹧鸪(石鸡)源性成分的特异性引物和探针，分别以鸡、鸭、 鹅、火鸡、鸽子、鸵鸟、鹌鹑、牛、山羊、猪、绵羊、兔、鱼、鹿、狗、驴、马、石鸡等动 物的总DNA为模板，按上述3进行实时荧光PCR，验证引物的特异性。检测结果如图1所 示，F8出现阳性扩增曲线，其它样品没有家养鹧鸪(石鸡)源性成分DNA，则没有信号， 显示上述引物和探针有良好的特异性。

5.实时荧光PCR的灵敏度验证

用超纯水10倍梯度稀释纯家养鹧鸪(石鸡)肉样DNA，直至10-7，按上述3进行实时 荧光PCR，结果如图2。可知其检测低限至少可达0.001％纯家养鹧鸪(石鸡)肉样DNA浓 度，该引物探针的灵敏度可达0.001％纯家养鹧鸪(石鸡)肉样品。