棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法及检测用引物

技术领域

本发明涉及农业和动物检疫技术领域，具体涉及一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏 颚口线虫的检测方法，具体涉及一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR 检测方法。此外，本发明还涉及用于同时检测棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的 引物。

背景技术

颚口线虫病是因人食入生的或未熟的含有颚口属(Gnathostoma)幼虫的淡水鱼引起的人 畜共患寄生虫病。颚口线虫属有13个有效种，目前已报道的致病种有棘颚口线虫 (G.spinigerum)、刚刺颚口线虫(G.hispidum)、杜氏颚口线虫(G.doloresi)、日本颚口线 虫(G.nipponicum)、马来颚口线虫(G.malaysiae)和双核颚口线虫(G.binucleatum)，因 此，对食品中检出的颚口线虫幼虫虫种的鉴别对该病的诊断与防治有重要意义。颚口线虫种 类的鉴定，传统方法是以形态特征为鉴别指标，但颚口线虫的生活史复杂，不同发育阶段形 态变化较大，有些虫种的第三期幼虫形态相似，传统形态方法很难鉴别，因而不能作为虫种 鉴别的精确指标，且传统方法也费时费力。

PCR技术具有简便、快速、灵敏的优点，目前，该技术已逐渐应用于寄生虫种类的鉴别， 研究的目的基因多以核糖体DNA(rDNA)为主。真核生物rDNA的内转录间隔区(internal  transcribed spacerregion，ITS)包括ITS-1和ITS-2，进化较快，具有种间特异性和种内 保守性，是进行种间分类的极好材料，可设计特异性的引物进行扩增，并比较ITS序列的差 异来鉴定形态学上难以区别的近缘种。将ITS序列用多重PCR方法来鉴别颚口线虫虫种，目 前国内尚无相关报道。棘颚口线虫、杜氏颚口线虫、日本颚口线虫是亚洲最常见的3种颚口 线虫致病种，本发明根据ITS-2序列，分别设计这3种颚口线虫的特异引物，进行多重PCR 扩增，旨在建立一种快速、灵敏、可靠的鉴别颚口线虫种类的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多 重PCR检测方法，其不需要繁杂的形态鉴定与测序步骤，就可以同时鉴别棘颚口线虫、日本 颚口线虫、杜氏颚口线虫三种颚口线虫。旨在解决颚口线虫鉴定时耗时、成本高、工作量大 等问题，也为进一步同时鉴定所有13个颚口线虫虫种奠定了基础。该方法的建立可满足进出 口水产品检疫、快速、准确的要求，同时，为我国人畜共患寄生虫病的研究与食品安全防控 上提供一种新的适用方法。为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物。

本发明是通过以下技术方案实现的：

在本发明的一方面，提供一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检 测方法，具体步骤包括：

1虫体DNA提取

2引物设计与筛选

3PCR反应条件优化

4单一PCR扩增特异性验证

5多重PCR扩增特异性验证

6PCR敏感性验证

7临床虫种鉴定方法的可行性验证

步骤1中，所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫DNA提取方法为：从70％ 乙醇保存液中取出单个标准虫种(3株标准虫种已经过形态学和分子生物学鉴定)，置于1.5mL Eppendorf管中，按照QIAGEN公司DNA提取试剂盒(DNeasy Blood&Tissue kit)使用说 明书提取颚口线虫基因组DNA，将提取的基因组DNA置-20℃保存备用。

步骤2中，所述的颚口线虫引物设计与筛选具体为：应用DNAstar7.1与Primer5.0等分 子生物学软件对颚口属线虫种间的ITS2基因序列进行比对分析，选择碱基差异较大的区域， 在该范围设计棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫特异性引物。筛选确定最终实验所 用的引物，确保所设计引物能特异扩增出对应虫种的目标产物，并且在实施多重PCR过程中， 多对引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不形成发卡结构等。最终所确定的引物序列见 表1。

表1多重PCR引物序列

步骤3中，所述的PCR反应条件优化具体方法为：选择25μL的PCR反应体系，体系包 含25mmol/L Mg²⁺2.5μL，10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 1μL，5U/μL Taq聚合酶0.1μL，DNA模板1μL，引物工作浓度为10μmol/L，根据多重PCR条带的 明亮，适当调整3对引物加入量的比例。退火温度根据引物Tm值范围进行51℃、53℃、55 ℃、57℃、59℃、61℃退火温度梯度试验。最后确定最佳的多重PCR模式。最终确定最佳的 多重PCR反应体系为：25μL反应体系中10×buffer 2.5μL，Mg²⁺2.5μL(25mmol)，dNTP 1μL(2.5mmol)，G.doloresi与G.nipponicum上下游引物各0.3μL(10μmol)， G.spinigerum上下游引物各0.4μL(10μmol)。Taq聚合酶0.1μL(5U/μL)，模板 DNA各1μL，加灭菌双蒸水至25μL。最佳的多重PCR反应条件为：95℃3min；95℃30s， 55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。

步骤4中，所述的单一PCR扩增特异性验证具体方法为：用G.spinigerum、G.doloresi 或G.nipponicum的单一引物，分别对G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum、宫 脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫与欧猥裂头蚴的DNA模板，在同等条件下进行PCR反应，以鉴 定其特异性。

步骤5中，所述的多重PCR扩增特异性验证具体为：同时用3对引物，分别对 G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum及其不同组合、宫脂线虫、异尖线虫、棘口 吸虫与欧猥裂头蚴的DNA模板，在同等条件下进行PCR反应，以鉴定其特异性。

步骤6中，所述的PCR敏感性验证具体为：先将3种标准虫种DNA用核酸蛋白测定仪测 定模板原液浓度，再以10倍连续稀释分别将G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum 3种颚口线虫的DNA模板稀释成5个浓度梯度，按以上条件进行PCR扩增，测定单一PCR和 多重PCR反应的敏感性。

步骤7中，所述的临床虫种的鉴定验证方法可行性具体为：将各地检出的颚口线虫虫体 (均经过形态学和分子生物学鉴定)，提取DNA模板，按上述建立的多重PCR方法进行扩增。

在本发明的另一方面，还提供用于同时检测棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫 的引物，其序列为：

棘颚口线虫的特异性引物：

GS2-F：5’-GAGATGTCTAGCATCATCTCT-3’(SEQ ID NO.1)；

6S4-R：5’-ACTGTATCGGCGAAGCTG-3’(SEQ ID NO.2)；

杜氏颚口线虫的特异性引物：

GD2-F：5’-AGATTTTGTTGCTGTTCGTT-3’(SEQ ID NO.3)；

GD3-R：5’-TATATACGGCCGCAGCTC-3’(SEQ ID NO.4)；

日本颚口线虫的特异性引物：

6N1-F：5’-TCTACGACGACGAGAGGACT-3’(SEQ ID NO.5)；

GN5-R：5’-TGGAGTTGTCGATGTGTG-3’(SEQ ID NO.6)。

上述3种颚口线虫多重PCR检测方法具有如下优点：

1.简单、直观：本发明设计的3对引物，GC含量相近，Tm值相近，这就保证了在相同 的退火温度下，G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum都能得到很好的扩增。其扩 增片段分别为282bp、183bp、358bp，这使得在检测时能在同一个电泳胶上进行，通过观 察PCR产物条带的位置就能判断虫种。

2.特异性强：本发明建立的检测方法显示，无论是单一PCR还是多重PCR，均能特异性 扩增出G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum条带；同时试剂用量少，所需成本较 低，可节约成本，减少人力消耗。

3.反应快速，耗时短：本发明方法耗时仅需3小时，反应快速、充分、需时短，节省了 测序过程的时间。

与现有技术相比，本发明可以同时鉴定3种颚口线虫(棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏 颚口线虫)，并且可以根据需要进行灵活组合，联合检测，且操作简单，用时短(整个反应可 以在3小时内完成)，传统的形态学鉴定方法与测序鉴定方法无法做到这点。利用该发明可以 快速、廉价、准确地鉴定棘颚口线虫、杜氏颚口线虫、日本颚口线虫，其快速、敏感、特异 和同步鉴定3种颚口线虫的特点可以应用于颚口线虫种的鉴定和水产品颚口线虫的检疫。

附图说明

图1是本发明实施例中单一引物PCR扩增特异性验证的结果示意图；其中，图1A是 G.spinigerum引物PCR的结果示意图，其中1-7分别以G.spinigerum、G.doloresi、 G.nipponicum、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫、迭宫绦虫DNA为模板，8为空白对照；图 1B是G.doloresi引物PCR的结果示意图，其中1-7分别以G.doloresi、G.spinigerum、 G.nipponicum、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫、迭宫绦虫DNA为模板，8为空白对照；图 1C是G.nipponicum引物PCR的结果示意图，其中1-7分别以G.nipponicum、G.spinigerum、 G.doloresi、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫、迭宫绦虫DNA为模板，8为空白对照；M：DL500 Marker。

图2是本发明实施例中多重PCR扩增特异性验证的结果示意图；其中，M：DL500Marker； 1：G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum混合模板；2：G.spinigerum、G.doloresi 混合模板；3：G.spinigerum、G.nipponicum混合模板；4：G.doloresi、G.nipponicum混合 模板；5：G.spinigerum模板；6：G.doloresi模板；7：G.nipponicum模板；8-11分别为宫 脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫、迭宫绦虫DNA模板；12为空白对照。

图3是本发明实施例中PCR敏感性试验验证的结果示意图；图3A是G.doloresi单一PCR 敏感性试验的结果示意图；图3B是G.nipponicum单一PCR敏感性试验的结果示意图；图3C 是G.spinigerum单一PCR敏感性试验的结果示意图；图3D是混合模板多重PCR敏感性试验 的结果示意图；其中，M：DL500Marker；1-6分别为100-10-5倍稀释的各DNA模板。

图4是本发明实施例中多重PCR方法鉴定样品结果示意图；其中，M：DL500Marker；1-8 为印度尼西亚分离株，9-10为菲律宾分离株，12-13为黑龙江分离株，11、14为G.spinigerum、 G.doloresi、G.nipponicum阳性混合样品对照，15为空白对照。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给 出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明 的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如J.Sambrook等在《分 子克隆实验指南》(科学出版社，1992)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

1.首先提取棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫DNA

DNA提取方法以QIAGEN公司的DNA抽提试剂盒(DNeasy Blood&Tissue kit)描述DNA 提取方法：挑取单条三种已知虫体(这三株虫的来源：G.spinigerum(宜州株)、G.doloresi (福建株)由广西疫病预防控制中心张鸿满主任医师惠赠，G.nipponicum(广州株)由上海出 入境检验检疫从泥鳅中分离并经形态学和分子生物学鉴定，70％乙醇中保存)放入灭菌离心管， 加入灭菌蒸馏水，重复洗涤3次，洗涤完毕后弃掉离心管中蒸馏水，用碾磨棒将离心管中虫 体碾碎，加入180μl Buffer ATL，20μL蛋白酶K，混匀后于56℃孵育1h～3h至消化 完全，期间不时震荡摇晃。消化完全后，漩涡震荡15s，加200μL Buffer AL，立即漩涡 震荡混匀，再加入200μL乙醇(96％～100％)，漩涡震荡混匀。离心柱置于收集管上，将上 一步的混合物吸入离心柱中，8000r/min离心1min，弃收集管。将离心柱置于新的收集 管中，加500μL Buffer AW1，8000r/min离心1min，弃收集管。将离心柱置于新的收集 管中，加500μL Buffer AW2，14000r/min离心3min，弃收集管。将离心柱置于一灭菌 的1.5mL离心管中，加入200μL Buffer AE室温孵育1min，8000r/min离心1min，离心 所得DNA于-20℃冰箱保存备用。(重复该步骤可扩大DNA回收率)

2.引物设计与筛选

应用DNAstar7.1与Primer5.0等分子生物学软件对颚口属线虫种间的ITS2基因序列进 行比对分析，选择碱基差异较大的区域，在该范围设计棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚 口线虫特异性引物。筛选确定最终实验所用的引物，确保所设计引物能特异扩增出对应虫种 的目标产物，并且在实施多重PCR过程中，多对引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不 形成发卡结构等。最终所确定的引物序列见表1。

表1多重PCR引物序列

3.PCR反应体系与条件

本发明所使用的PCR试剂为TAKARA公司生产。PCR反应条件优化具体方法为：选择25μL 的PCR反应体系，体系包含25mmol/L Mg²⁺2.5μL，10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol /L dNTP 1μL，5U/μL Taq聚合酶0.1μL，DNA模板1μL，引物工作浓度为10μmol/L， 根据多重PCR条带的明亮，适当调整3对引物加入量的比例。退火温度根据引物Tm值范围进 行51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃退火温度梯度试验。最后确定最佳的多重PCR模式。 最终确定最佳的多重PCR反应体系为：25μL反应体系中10×buffer 2.5μL，Mg²⁺2.5 μL(25mmol)，dNTP 1μL(2.5mmol)，G.doloresi与G.nipponicum上下游引物(见表1) 各0.3μL(10μmol)，G.spinigerum上下游引物(见表1)各0.4μL(10μmol)。Taq聚 合酶0.1μL(5U/μL)，模板DNA各1μL，加灭菌双蒸水至25μL。最佳的多重PCR反应 条件为：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。

4.单一PCR扩增特异性验证

用G.spinigerum、G.doloresi或G.nipponicum的单一引物(见表1)，分别对 G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫与欧猥裂头 蚴的DNA模板，按照以上PCR反应体系与条件，在同等条件下进行PCR反应。单一PCR扩增 后，产物经3.0％琼脂糖凝胶电泳检测，可见G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum 分别扩增出1条282bp、183bp、358bp的条带，与各自的预期目的条带相符；3种引物对 宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫与欧猥裂头蚴均未扩增出任何条带(见图1)。G.spinigerum、 G.doloresi、G.nipponicum单一PCR特异性扩增产物经测序分析后，结果显示与该3种颚 口线虫的ITS2目的基因序列相吻合。可见，单一PCR的特异性验证试验证实了这3对引物有 很强的特异性，可以分别检测棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫。

5.多重PCR扩增特异性验证

同时用3对引物(见表1)，分别对G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum及其 不同组合、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫与欧猥裂头蚴的DNA模板，按照以上PCR反应体 系与条件，在同等条件下进行PCR反应。同时用3对引物分别对G.spinigerum、G.doloresi、 G.nipponicum的DNA模板进行PCR扩增，均扩增出1条预期目的条带；对G.spinigerum 与G.doloresi、G.spinigerum与G.nipponicum和G.doloresi与G.nipponicum 3种不 同组合的DNA模板进行PCR扩增，分别扩增出2条预期目的条带，而对宫脂线虫、异尖线虫、 棘口吸虫以及欧猥裂头蚴DNA均未扩增出相应条带；对G.spinigerum、G.doloresi和 G.nipponicum 3种颚口线虫的混合DNA模板，扩增出3条预期大小的目的条带(见图2)。 可见，多重PCR的特异性验证试验证实了这3对引物有很强的特异性，可以同时检测棘颚口 线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫。

6.敏感性试验验证

经核酸蛋白测定仪测定G.doloresi、G.nipponicum、G.spinigerum DNA模板原浓度 分别为133ng/μL、125ng/μL、204ng/μL。将DNA模板按10-1～10-5倍连续稀释成5个浓 度梯度，按以上PCR反应体系与条件进行PCR扩增，单一PCR对G.doloresi、G.nipponicum 和G.spinigerum的最小检出量分别为0.01ng/μL、0.01ng/μL、0.2ng/μL。混合模板 多重PCR最小检出量与单一PCR相同(见图3)。可见，PCR敏感性试验验证了这3对引物对 模板浓度的敏感性较高，远远超过对1条颚口线虫所提DNA浓度的实验要求。

7.临床虫种的鉴定验证方法的可行性

对2010年～2011年分离自菲律宾、印度尼西亚进口黄鳝与黑龙江泥鳅的颚口线虫分离 株，按照建立的多重PCR方法进行鉴定。2株菲律宾、8株印度尼西亚颚口线虫分离株的DNA 模板进行扩增，电泳条带与G.spinigerum阳性对照的条带位置一致，为282bp；对2株黑 龙江颚口线虫分离株的DNA模板进行扩增，电泳条带与G.nipponicum阳性对照条带位置一 致，为358bp(见图4)。可见，多重PCR鉴定结果与原样品形态鉴定和分子鉴定结果完全相 符，证明该多重PCR方法进行临床样本的鉴定时，验证了该方法的可行性。

在图4中，8株印度尼西亚颚口线虫(图4中1-8)：上海出入境检验检疫局自印度尼西 亚进口黄鳝中分离出，并且经过形态学和分子生物学测序鉴定为棘颚口线虫。2株菲律宾(图 4中9-10)：上海出入境检验检疫局从菲律宾进口黄鳝中分离出，并且经过形态学和分子生物 学测序鉴定为棘颚口线虫。2株黑龙江颚口线虫(图4中12-13)：上海出入境检验检疫局委 托黑龙江出入境检验检疫局购自黑龙江农贸市场的泥鳅中分离出，并且经过形态学和分子生 物学测序鉴定为日本颚口线虫。