呈递空肠弯曲杆菌N-聚糖或其衍生物的肠沙门氏菌

发明领域

本发明涉及肠沙门氏菌(Salmonella enterica)，其包含至少一种空 肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)pgl操纵子或其功能衍生物，并且在 其细胞表面上呈递至少一种空肠弯曲杆菌N-聚糖或其N-聚糖衍生物。 此外，本发明涉及其医学用途、由其制备的药物组合物、食品添加剂 和饲料添加剂，以及用于治疗和/或预防弯曲杆菌感染和任选沙门氏菌 感染的方法和用于制备这些沙门氏菌菌株的方法，所述弯曲杆菌感染 特别是由空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌(C.lari)、大肠弯曲杆菌(C. coli)、乌普萨拉弯曲杆菌(C.upsaliensis)和胎儿弯曲杆菌(C.fetus)引起 的感染。

相关发明背景

空肠弯曲杆菌(C.jejuni)是食物传播的病原体，它是发达国家人急 性胃肠炎的主要病因。它的常规宿主是家畜，特别是鸡和牛。空肠弯 曲杆菌感染也与若干长期后果有关，最严重的就是自身免疫性疾病 Miller-Fisher综合征和格-巴(Guillain-Barré)综合征。它们是由针对病原 体表面上哺乳动物神经节苷脂结构的模拟的哺乳动物宿主抗体所引 发，该病原体然后也攻击宿主本身的神经节苷脂。这种分子模拟是为 什么现在没有可用的针对空肠弯曲杆菌的有效疫苗的原因之一，因为 它排除了使用减毒或杀死的空肠弯曲杆菌细胞作为疫苗。

美国专利2007/065461教导了一种由任选体外连接载体蛋白的至 少一种空肠弯曲杆菌荚膜多糖(CPS)组成的疫苗。注射该缀合物到小鼠 或猿中保护了它们免受之后空肠弯曲杆菌的鼻内攻击。制备这种疫苗 需要分离和纯化CPS，以及化学连接到载体蛋白和进一步的纯化步骤。

Poly等(Infection and Immunity，75：3425-3433，2008)描述了当前作 为候选疫苗测试的缺乏神经节苷脂模拟结构的空肠弯曲杆菌菌株。

糖基化一度被认为是特有的真核现象，但后来被证明在古生菌和 真细菌领域中均广泛存在。比起真核糖蛋白中观察到的，细菌的O- 连接和N-连接与更广范围的糖形成。原核生物中蛋白的糖苷N-糖基 化在空肠弯曲杆菌中首次得到证明(Szymanski等，Molecular  Microbiology 32：1022-1030，1999)。空肠弯曲杆菌的糖基化机制已被表 征，且甚至已成功地转移给大肠杆菌，在大肠杆菌中证实了蛋白质的 活性N-糖基化(Wacker等，Science，298：1790-1793，2002)。称为pgl的 空肠弯曲杆菌基因座(用于蛋白质糖基化)参与多种蛋白质的糖基化。 它的突变沉默导致多种蛋白质免疫原性的丧失。

美国专利申请2006/0165728 A1鉴定了一种特异和高免疫原性的 七糖，其为至少几种弯曲杆菌种和许多作为人和兽病原体重要的菌株 所共有。该七糖有如下的结构式(I)：

GalNAc-a1，4-GalNAc-a1，4-[Glc-β-1，3]GalNAc-a1，4-Gal-NAc-a1，4- GalNAc-a1，3-Bac，

其中Bac(亦称为杆菌胺(bacillosamine))是2，4-二乙酰氨基-2，4，6 三脱氧-D-吡喃葡萄糖，GalNAc是N-乙酰基-半乳糖胺，Glc是葡萄糖。 该聚糖部分是多种糖蛋白的组分。在空肠弯曲杆菌中，N-聚糖对于空 肠弯曲杆菌与宿主细胞的相互作用是重要的。糖基化机制的突变导致 小鼠肠道建群(colonization)减少。此外，含有(i)所述七糖或其缀合物 或者(ii)针对所述七糖的抗体的药物组合物被建议用于家畜(尤其家禽) 的接种用途。

沙门氏菌属是肠杆菌科的成员。该属由兼性厌氧且生有鞭毛(能 动)的革兰氏阴性杆菌组成。它们有三种主要的抗原：“H”抗原或鞭 毛抗原、“O”抗原或菌体抗原(LPS部分的一部分)和“Vi”抗原或荚 膜抗原(在其他的肠杆菌中称作“K”)。沙门氏菌也具有革兰氏阴性菌 的LPS内毒素特征。LPS由三个结构域组成：脂质A部分(亦称作内 毒素)通过其脂肪酸链将LPS分子锚定在外膜中。它通过由庚糖和 KDO(3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸)组成的内核与含有己糖和N-乙酰己糖 的外核连接。与外核的最后一个葡萄糖连接的是聚合O-抗原区。该区 由16至＞100个含4-6个单糖的寡糖结构的重复组成。内毒素脂质A 部分引起发热，并可激活补体、激肽和凝血因子。

对于制备和呈递细菌的免疫原，沙门氏菌菌株已引人关注了一段 时间。例如，通过基因组整合将编码用于志贺氏杆菌O-抗原生物合成 的酶的基因整合到鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌的aroA接种菌株中， 其之后能产生杂合LPS(等，Microbial Pathogenesis 20：11-30， 1996)。同样，将痢疾沙门氏菌(Salmonella dysenteriae)O-抗原生物合 成所需的簇克隆到稳定表达载体中，然后将稳定表达载体转移到伤寒 热接种菌株Ty21a中。所得菌株产生杂合LPS，并诱导针对痢疾沙门 氏菌攻击的保护性免疫(DE Qui Xu等，Vaccine 25：6167-6175，2007)。

美国专利6,399,074 B1公开了一种活体减毒沙门氏菌疫苗，用于 保护鸟类免受禽类致病性革兰氏阴性微生物的感染。该疫苗是重组的 沙门氏菌菌株，其表达禽类致病性革兰氏阴性微生物的O-抗原，例如 在家禽中致病的大肠杆菌O78。重组沙门氏菌菌株因为O-抗原聚合酶 rfz(新基因术语wzy)中的突变而不表达沙门氏菌O-抗原。

鉴于上述现有技术，本发明的目的是提供一种安全有效、易于大 规模生产、长效且廉价的疫苗组合物，用于预防和/或治疗人和动物中 的弯曲杆菌感染，特别是家畜、更特别是家禽中的弯曲杆菌感染。

该目的的解决是通过在第一方面提供肠沙门氏菌，其包含至少一 种空肠弯曲杆菌pgl操纵子或其功能衍生物，并且在其细胞表面上呈 递至少一种空肠弯曲杆菌N-聚糖或其N-聚糖衍生物。

可用于本发明的沙门氏菌菌株可以是被或可被充分减毒以使得 能够将其以活和/或死的形式不致病地给予人和/或动物的任何菌株。 优选的沙门氏菌菌株是选自以下的肠沙门氏菌菌株：鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)、海德 尔堡沙门氏菌(Salmonella heidelberg)、鸡沙门氏菌(Salmonella  gallinorum)、哈达尔沙门氏菌(Salmonella hadar)、阿哥纳沙门氏菌 (Salmonella agona)、肯塔基沙门氏菌(Salmonella kentucky)、伤寒沙门 氏菌(Salmonella typhi)和婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis)菌株，更优 选鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌(Salmonella enterica serovar  Typhimurium)菌株。鼠伤寒沙门氏菌尤其可用于接种目的，因为基因 组序列已经充分表征，并且许多动物研究证实了其安全的医学应用。

本文所用术语“pgl操纵子”指能够将由本发明的沙门氏菌菌株 产生的同源或异源结构N-糖基化的任何生理学活性N-糖基化空肠弯 曲杆菌基因簇。空肠弯曲杆菌的pgl操纵子编码为合成空肠弯曲杆菌 N-聚糖七糖、将其转运通过内膜和转移至蛋白质所需的所有酶。PglD、 E、F编码参与杆菌胺生物合成的酶，PglC将磷酸化杆菌胺转移至十 一异戊烯磷酸，而PglA、H和J添加GalNAc残基。分支的Glc通过 PglI连接。已完成七糖的转移通过PglK的作用完成，而寡糖基转移 酶PglB将N-聚糖转移至蛋白质。

pgl操纵子的功能衍生物是衍生自任何空肠弯曲杆菌pgl操纵子 的基因簇，该操纵子具有核苷酸或完整基因的缺失、突变和/或取代， 但仍然能产生可与由本发明的沙门氏菌菌株产生的同源或异源结构 连接的可连接的寡糖或多糖。可将一种或多种pgl操纵子或其衍生物 整合到沙门氏菌菌株的染色体中，或者可将它/它们作为至少一个质粒 的一部分引入。优选染色体整合，因为它相比质粒载体更为稳定，质 粒载体在增殖过程中可能发生丢失。应当注意，本发明的沙门氏菌菌 株可包含产生一种或多种N-聚糖或其衍生物的多于一种的pgl操纵子 或其衍生物。事实上，优选本发明的菌株具有产生多于一种N-聚糖结 构的多于一种类型的pgl操纵子，其对于在人或动物中引发针对不同 的空肠弯曲杆菌菌株的更多样化的免疫应答可能是有利的。

也应当注意，空肠弯曲杆菌N-聚糖的表达水平可任选通过使用 pgl操纵子上游的不同启动子调节，启动子包括但不限于核糖体蛋白 基因(例如spc或rpsm)的启动子以及来自抗生素抗性编码基因(如bla 或类似基因)的启动子，优选强启动子。这种类型的调节可用于质粒编 码的pgl操纵子或是基因组整合的pgl操纵子。此外，质粒稳定性可 任选通过在质粒上包含必需基因同时在本发明的沙门氏菌菌株基因 组中缺失这些基因来增强。优选的靶标涵盖例如编码t-RNA转移酶(如 CysS)的基因。

在一个优选的实施方案中，本发明的沙门氏菌菌株是包含至少一 种pgl操纵子的菌株，其中通过突变和/或部分或完全缺失使用于杆菌 胺生物合成的一个或多个基因失活，优选通过部分和/或完全缺失D、 E、F、G基因。在一个最优选的实施方案中，pgl操纵子的pglE、F 和G基因完全缺失，pglD基因部分缺失，例如pglD开放阅读框(ORF) 在270个碱基对之后终止(全长ORF包含612个碱基对)。

在另一个优选的实施方案中，使pgl操纵子的pglB基因失活，意 指对应的寡糖基转移酶B不表达或至少失去酶活性。pglB基因产物将 N-聚糖转移到下文进一步描述的特异性多肽接受位点。转移酶失活导 致N-聚糖或N-聚糖衍生物与沙门氏菌O-抗原接纳体脂质A核心专一 地结合。

在一个最优选的实施方案中，pgl衍生物中，使用于杆菌胺生物 合成(pgD、E、F、G)和转移的一个或多个基因失活，且也使pglB基 因失活。该实施方案导致GlcNAc交换为杆菌胺，引起增加的细胞呈 递以及修饰七糖转移到脂质A核心而非多肽接纳体。

至少一种空肠弯曲杆菌N-聚糖或其N-聚糖衍生物可以是由任何 空肠弯曲杆菌pgl操纵子或其功能衍生物产生的任何N-聚糖。当然优 选N-聚糖仍然有免疫原性，即引发空肠弯曲杆菌特异的免疫应答。

在一个优选实施方案中，N-聚糖是上述式(I)的七糖，即 GalNAc-a1，4-GalNAc-a1，4-[Glc-β-1，3]GalNAc-a1，4-Gal-NAc-a1，4-GalN  Ac-a1，3-Bac，其中Bac(亦称为杆菌胺)是2，4-二乙酰氨基-2，4，6-三脱氧 -D-吡喃葡萄糖。

其中用于杆菌胺生物合成的基因失活、优选大部分或完全缺失的 优选pgl操纵子，导致合成N-聚糖衍生物，即式(II)的七糖，为 GalNAc-a1，4-GalNAc-a1，4-[Glc-β-1，3]GalNAc-a1，4-Gal-NAc-a1，4-GalN  Ac-a1，3-GlcNAc。

意想不到地，式(II)的N-聚糖衍生物以比式(I)的N-聚糖高的量呈 递在本发明的沙门氏菌菌株细胞表面上，且也有免疫原性。这在下文 实施例部分通过实验证实。

在一个优选的实施方案中，由至少一种pgl操纵子或其衍生物产 生的N-聚糖或衍生物可与最终被转移至细胞表面并在细胞表面上呈 递的至少一种同源或异源沙门氏菌多肽连接。优选地，至少一种N- 聚糖或N-聚糖衍生物与含有至少一种共有序列肽段N-Z-S/T(见 Nita-Lazar M等，Glycobiology.2005；15(4)：361-7)的多肽连接，该共有 序列肽段优选D/E-X-N-Z-S/T(SEQ ID NO：1)，其中X和Z可以是非 Pro的任何天然氨基酸(见Kowarik等.EMBO J.2006；25(9)：1957-66)。

与N-聚糖(衍生物)连接的多肽可以是任何类型的多肽，例如纯多 肽(仅氨基酸)或翻译后修饰多肽(例如脂连多肽)。

对于作为N-聚糖(衍生物)载体的异源多肽，优选地，它们包含将 N联缀合物导向细胞外膜的信号序列MKKILLSVLTTFVAVVLAAC (SEQ ID NO：2)，其中LAAC基序(SEQ ID NO：3)用于酰化将多肽锚 定在外膜上的半胱氨酸残基(亦参见Kowarik等，EMBO J.5月3 日；25(9)：1957-66，2006)。

在最优选的实施方案中，由至少一种pgl操纵子或其衍生物产生 的至少一种N-聚糖或其衍生物与沙门氏菌脂质A核心或其等功能衍 生物连接。沙门氏菌的脂质A核心是由己糖、N-乙酰己糖、庚糖和 KDO(3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸)组成的寡糖结构，其通过两个葡糖胺 与将该结构锚定到细菌外膜中的六个脂肪酸链连接。脂质A核心的等 功能衍生物能够接纳一种或多种聚糖或其衍生物，并将它们呈递到细 胞表面上。应当注意，在该情况下，N-聚糖或其衍生物不是N-连接的， 因为沙门氏菌结构脂质A不是多肽。N-聚糖优选与脂质A核心或其 等功能衍生物中的GlcII连接。

优选地，至少一种N-聚糖或其衍生物占据LPS(脂多糖)中O-抗 原侧链的位置。沙门氏菌的内和外脂质A核心保持不变，而O-抗原 生物合成通过wbaP的突变而废止。N-聚糖然后通过O-抗原连接酶 WaaL转移，并与脂质A外核心寡糖结构的GlcII残基连接。

优选且对于医学用途非常重要的是，本发明的沙门氏菌菌株当以 活的和/或失活形式给予动物或人时不引发致病作用。技术人员知道许 多通过突变对有毒力的沙门氏菌种减毒的方法。用于本发明中对沙门 氏菌菌株减毒的优选突变选自：pab、pur、aro、aroA、asd、dap、nadA、 pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cya、crp、 phoP、phoQ、rfc、poxA和galU。可存在这些突变中的一种或多种。 更优选突变aroA、cya和/或crp。

沙门氏菌的O-抗原生物合成基因在rfb基因座中成簇，该基因座 是沙门氏菌染色体的高变DNA区。已将部分或完全失活与沙门氏菌 菌株的减毒相关联。另一方面，O-抗原也是在宿主中诱导免疫的重要 抗原决定簇。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的沙门氏菌菌株通过O- 抗原表达的部分或完全失活减毒，优选通过rfb基因簇中、更优选wbaP 基因中的一个或多个突变和/或缺失，最优选wbaP基因的缺失。

应当理解，本文所用术语“rfb基因座”和“wbaP基因”意在涵 盖能够表达O-抗原或相关抗原的任何沙门氏菌菌株中的任何对应基 因座和基因。

wbaP基因产物是磷酸半乳糖基转移酶，其通过将磷酸半乳糖添 加到十一异戊烯磷酸来开始O-抗原生物合成。其失活/缺失导致O-抗 原合成的完全废止，O-抗原合成的糖产物与空肠弯曲杆菌N-聚糖(衍 生物)竞争脂质载体十一异戊烯磷酸和通过连接酶WaaL的转移。细菌 中的pgl基因座诱导的蛋白质N-糖基化和wzy依赖性O-抗原合成是 同源过程。据发现，沙门氏菌O-抗原连接酶WaaL具有不严格的底物 特异性，其可将空肠弯曲杆菌N-聚糖转移到沙门氏菌脂质A核心。

因此，在一个最优选的实施方案中，本发明的沙门氏菌菌株在 wbaP基因中突变，使磷酸半乳糖基转移酶失活。应当注意，以前没 有描述该类型的O-抗原失活用于接种目的，且其优于现在已知的O- 抗原阴性突变体，因为它被遗传限定且使得能够增加沙门氏菌菌株细 胞表面上呈递的空肠弯曲杆菌N-聚糖(衍生物)的量。

因此，作为一项独立发明，本发明还涉及在wbaP基因中突变(优 选缺失)且从而失活的沙门氏菌菌株，其可用于沙门氏菌菌株的疫苗用 途，同样也可用于作为异源抗原(优选糖基化抗原，更优选N-糖基化 抗原)载体的沙门氏菌菌株。

在一个最优选的实施方案中，本发明涉及肠沙门氏菌，优选鼠伤 寒血清变型菌株，其

(a)包含：

(i)至少一种空肠弯曲杆菌pgl操纵子或其功能衍生物，优选至少 一种pgl操纵子，其中用于杆菌胺生物合成的一个或多个基因失活， 和

(ii)导致O-抗原生物合成完全失活的wbaP基因中的突变和/或缺 失，

(b)并在其细胞表面上呈递至少一种空肠弯曲杆菌N-聚糖或其 N-聚糖衍生物，优选(I) GalNAc-a1，4-GalNAc-a1，4-[Glc-β-1，3]GalNAc-a1，4-Gal-NAc-a1，4-GalN Ac-a1，3-2，4-二乙酰氨基-2，4，6-三脱氧-D-吡喃葡萄糖和/或(II) GalNAc-a1，4-GalNAc-a1，4-[Glc-β-1，3]GalNAc-a1，4-Gal-NAc-a1，4-GalN Ac-a1，3-GlcNAc。

上述的本发明沙门氏菌菌株是高度免疫原性的，且产生针对空肠 弯曲杆菌感染的免疫应答。此外，一旦被制备，它们便可容易地增殖 和大规模生产。作为一项附加优势，将其给予动物或人提供针对空肠 弯曲杆菌感染和沙门氏菌感染的免疫。它们可作为死的或活的疫苗给 予，活的疫苗使得能够在宿主中长期增殖和维持免疫刺激以及无佐剂 的完全免疫应答。

因此，本发明还涉及本发明活或死的沙门氏菌菌株的医学用途， 特别是用于制备药物，优选疫苗。

优选地，所述药物可用于预防和/或治疗空肠弯曲杆菌感染和任选 沙门氏菌感染，感染优选家畜、更优选牛和家禽、最优选家禽(例如鸡、 火鸡、鹅和鸭)中的感染。

本发明的第三方面涉及药物组合物、食品或饲料(添加剂)，其包 含死或活的本发明肠沙门氏菌和生理学上可接受的赋形剂。

例如，本发明的药物组合物可通过包含至少一种质粒编码的或染 色体整合的pgl操纵子或其衍生物的本发明沙门氏菌株的中等或大规 模培养来制备。这些沙门氏菌可直接用于或经配制以适应特定的人或 动物靶标和特定的给药途径。因为明显的原因，优选包含活的沙门氏 菌的药物组合物。

备选地，本发明涉及用于人或动物、优选家畜、更优选家禽的食 品或饲料，其包含死或活的本发明肠沙门氏菌和生理学上可接受的赋 形剂和/或食物。例如，这样的饲料极大地减少家禽群的空肠弯曲杆菌 建群，因此降低人被空肠弯曲杆菌感染以及通过污染的肉感染沙门氏 菌的机会。

本发明的第四方面涉及用于治疗和/或预防空肠弯曲杆菌感染和 任选沙门氏菌感染的方法，包括将本发明的肠沙门氏菌、药物组合物、 食品或饲料按生理学有效量给予有需要的人或动物。

对于治疗和/或预防用途，本发明的药物组合物可以任何常规剂型 以任何常规方式给药。给药途径包括但不限于静脉内、肌内、皮下、 鼻内、滑膜内、通过输注、舌下、透皮、口服(例如管饲法)、局部或 通过吸入。优选的给药模式是口服、静脉内和鼻内，最优选口服和鼻 内。

本发明的沙门氏菌可单独给药或与包括其它活性成分在内的佐 剂联合给药，该佐剂增强细菌的稳定性和/或免疫原性、有助于给予包 含它们的药物组合物、提供增加的溶解性或分散性、增加增殖活性、 提供辅助治疗等。

本文所述的沙门氏菌药学剂型包含本领域普通技术人员已知的 药学上可接受的载体和/或佐剂。这些载体和佐剂包括，例如离子交换 剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白、缓冲物质、水、盐、电 解质、基于纤维素的物质、明胶、水、凡士林、动物油或植物油、矿 物油或合成油、盐水、葡萄糖或其他糖和二醇化合物(例如乙二醇、丙 二醇或聚乙二醇)、抗氧化剂、乳酸盐(酯)等。优选的剂型包括片剂、 胶囊剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、可复溶的粉剂和透皮贴剂。制备剂 型的方法是公知的，例如参见H.C.Ansel和N.G.Popovish， Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第5版，Lea  and Febiger(1990)和尤其Pastoret等，Veterinary Vaccinology，Elsevier  1999年3月)。剂量水平和要求为本领域所熟知，并可由本领域技术 人员从适合特定患者的可用方法和技术中选择。本领域技术人员将认 识到，可能需要较低或较高的剂量，视具体因素而定。例如，特定的 剂量和治疗方案取决于例如患者(人或动物)的一般健康特征、患者病 症的严重性和疗程或对病症的处置和治疗医师或兽医的判断。

在口服疫苗的一个优选实施方案中，方案组成如下：将包含质粒 上的或整合到染色体中的pgl操纵子或其衍生物的沙门氏菌以每只小 鸡大约10⁶cfu(菌落形成单位)在小鸡孵化后的第1或2天给予，以及 在孵化后第14或21天使用相同量的细菌进行加强免疫。这两次给予 为免疫系统提供足够的刺激，以建立针对空肠弯曲杆菌N-聚糖或其衍 生物以及沙门氏菌蛋白质的应答，对之后小鸡的建群提供保护。接种 小鸡的备选方法是在孵化后第1或2天通过静脉内注射灭活(例如，热 灭活或福尔马林灭活)的细菌，以及在第14或21天进行加强免疫。作 为进一步的选择，小鸡也可在直到3周龄的较晚时间点通过静脉内使 用热灭活或福尔马林灭活细菌或者胃内使用活的细菌仅接种一次。

最后但非最不重要地，本发明涉及一种制备本发明肠沙门氏菌的 方法，其包括以下步骤：

(i)优选通过至少一种质粒载体或通过基因组整合，将至少一种 空肠弯曲杆菌pgl操纵子或其功能衍生物、优选至少一种pgl操纵子 引入肠沙门氏菌，其中用于杆菌胺生物合成的一个或多个基因、优选 所有基因失活，和

(ii)优选在wbaP基因中引入导致O-抗原生物合成完全失活的突 变和/或缺失。

接下来，参照特定实施方案和实验进一步说明本发明，它们不应 被理解为限制由所附权利要求提出的本发明的范围。

附图

图1是在鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌上展示的空肠弯曲杆菌N- 聚糖示意图。

A)显示空肠弯曲杆菌N-聚糖到产生O-抗原且以pgl_mut操纵子 (“mut”是指PglB通过2个点突变失活)为特征的菌株中的鼠伤寒沙 门氏菌脂质A核心的转移；

B)显示无任何O-抗原且以pgl3_mut操纵子为特征的鼠伤寒沙门氏 菌ΔwbaP菌株，pgl3_mut操纵子中缺失用于杆菌胺生物合成的基因；

C)阐明pgl3_mut操纵子中的缺失。

图2证明了空肠弯曲杆菌N-聚糖在鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌 上的展示

A)显示携带所示质粒的野生型和ΔwbaP鼠伤寒沙门氏菌菌株的 蛋白酶K处理的全细胞提取物的SDS-PAGE的抗空肠弯曲杆菌N-聚 糖免疫印迹，和证明空肠弯曲杆菌N-聚糖在鼠伤寒沙门氏菌脂质A 核心上的展示。

B)是蛋白酶K处理的野生型和ΔwbaP鼠伤寒沙门氏菌全细胞提 取物的银染SDS-PAGE(左侧图)和SDS-PAGE的抗沙门氏菌B群O- 抗原免疫印迹(右侧图)。它证实ΔwbaP菌株中缺乏聚O-抗原。

C)显示带有整合的空载体(对照)或整合的pgl3_mut操纵子的 ΔwbaP鼠伤寒沙门氏菌菌株的SDS-PAGE的抗空肠弯曲杆菌N-聚糖 免疫印迹，和证明空肠弯曲杆菌N-聚糖通过整合的pgl3_mut操纵子在 ΔwbaP鼠伤寒沙门氏菌脂质A核心上的表达。

D)在左侧图中描述了使用热杀死ΔwbaP鼠伤寒沙门氏菌静脉内 感染鼠的血清的免疫印迹，其展示在还原端带有GlcNAc且由pgl3_mut编码的空肠弯曲杆菌N-聚糖。识别野生型空肠弯曲杆菌细胞和 81-176pglB空肠弯曲杆菌细胞是明显的。右侧图显示小鼠血清免疫印 迹分析中所用样品的考马斯染SDS-PAGE。

图3描述了用于证明ΔwbaP鼠伤寒沙门氏菌减毒的体外测试

A)显示ΔwbaP鼠伤寒沙门氏菌对人血清中补体的敏感性增加： 补体介导杀死卡那霉素抗性的鼠伤寒血清变型野生型菌株M939、O- 抗原阴性ΔwbaP::cat (SKI11)和补体突变型(complemented mutant) ΔwbaP::pKI9(SKI33)的测试通过：将野生型、ΔwbaP和ΔwbaP::pKI9 (SKI33)沙门氏菌的1∶1∶1混合物与20％人血清或20％热灭活人血清一 起孵育所示的时间点。通过涂板到分化培养基上来分析存活。

B)描述了除使用热灭活血清的不同之外的A)中实验设置的结 果。在存活方面没有菌株受到影响。

C)阐述了ΔwbaP鼠伤寒沙门氏菌在游动性方面相比野生型鼠伤 寒沙门氏菌和非运动性菌株fliGHI:Tn10的缺陷。

图4证明ΔwbaP鼠伤寒沙门氏菌在与野生型鼠伤寒沙门氏菌的 共感染实验中建群能力降低。

A)图示在感染后第1-3天的粪便中和感染后第4天的盲肠内含 物中测定的ΔwbaP(SKI12)和野生型鼠伤寒血清变型的竞争指数(CI； (突变型/野生型)输出/(突变型/野生型)输入)，证明ΔwbaP鼠伤寒沙门 氏菌与野生型相比建群能力降低。

B)感染后第4天在mLN、脾和肝中的CI。

实施例

细菌菌株和生长条件

用于实施例所列实验的细菌菌株汇总于表1。将细菌培养在 Luria-Bertani(LB)培养基(10g/l Bacto胰蛋白胨、5g/l Bacto酵母提取 物、5g/l NaCl)中。LB琼脂平板补充有1.5％(w/v)琼脂。抗生素按如 下终浓度使用：氨苄青霉素(amp)100μg/ml，卡那霉素(kan)50μg/ml， 氯霉素(cam)25μg/ml，链霉素(strep)50μg/ml，四环素(tet)10μg/ml。

实施例1-空肠弯曲杆菌N-聚糖在鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌 脂质A核心上的展示

Wzy依赖性O-抗原生物合成和空肠弯曲杆菌N-聚糖生物合成是 同源过程(Feldman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.；102(8)：3016-21， 2005)，二者都是从寡糖结构在十一异戊烯磷酸连接体上的装配开始。 对于联合两条途径以将空肠弯曲杆菌N-聚糖展示在沙门氏菌脂质A 核心上的可能性，探究了两条途径的同源性及鼠伤寒血清变型肠沙门 氏菌O-抗原连接酶WaaL不严格的底物特异性(等，Microbial  Pathogenesis 20：11-30，1996；De Qui Xu等，Vaccine 25：6167-6175， 2007)。

将含有带失活PglB的空肠弯曲杆菌pgl_mut操纵子的质粒 (pACYCpgl_mut；Wacker等2002)通过电穿孔引入鼠伤寒血清变型肠沙 门氏菌菌株中。作为阴性对照，使用相应的空载体pACYC184。

通过SDS-PAGE和随后使用抗空肠弯曲杆菌N-聚糖抗血清的免 疫印迹来测试转化突变型的糖缀合物的空肠弯曲杆菌N-聚糖展示 (Amber 2008)。样品如下制备：将2OD₆₀₀/ml当量的含有pACYC184 或pACYpgl_mut的鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌对数期生长培养物以 16,000g离心2min，弃去上清液。将细胞重悬于100μl样品缓 冲液(0.065M Tris-HCl pH 6.8、2％SDS(w/v)、5％β-巯基乙醇(v/v)、 10％甘油(v/v)、0.05％溴酚蓝(w/v))，并在95℃裂解5min。冷却到室温 后，加入蛋白酶K(Gibco/Life Technologies)(终浓度为0.4mg/ml)，并 在60℃孵育1h，然后将等份上样到15％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺 凝胶电泳(SDS-PAGE)中。为检测空肠弯曲杆菌N-聚糖，使用抗空肠 弯曲杆菌N-聚糖的兔多克隆抗血清(S.Amber，博士论文，ETH Zürich， Department of Biological Science.Zürich，2008)。使用制造商推荐的山 羊抗兔IgG-HRP缀合物(Santa Cruz)和ECL(Amersham)完成信号的可 视化。

当细胞中含有pACYCpgl_mut时，可在鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌 脂质A核心上检测到空肠弯曲杆菌N-聚糖(图2A泳道2)，但是若将 空载体时引入细胞中时，则检测不到(图2A泳道1)。这表明，鼠伤寒 血清变型肠沙门氏菌WaaL将空肠弯曲杆菌N-聚糖从十一异戊烯磷酸 转移到脂质A核心。

实施例2-在鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌中构建wbaP缺失和增 加空肠弯曲杆菌N-聚糖在O-抗原阴性菌株中的展示

假定O-抗原生物合成缺失废止O-抗原生物合成途径和空肠弯曲 杆菌N-聚糖生物合成之间对脂质载体十一异戊烯磷酸的竞争。

按照所述(Datsenko和Wanner，PNAS USA97(12)：6640-5，2000)构 建野生型鼠伤寒沙门氏菌SL1344的wbaP缺失突变型。合成与质粒 pKD3的模板DNA退火的引物RfbP H1P1(序列见表1)和RfbP H2P2， 质粒pKD3携带两侧为FRT(FLP识别靶标)位点的氯霉素抗性基因。 这些引物也含有对应紧邻wbaP基因上游和下游的区的40-45个另外 的核苷酸。按照所述(Datsenko和Wanner，见上文)，它们用于扩增用 于wbaP基因框内缺失的基因盒。在鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株 SL1344中来自质粒pKD46的λ红色重组酶(λ Red recombinase)的阿拉 伯糖诱导的表达后，重组酶与通过电穿孔引入的PCR产物的氯霉素盒 交换靶基因。通过涂板到氯霉素板上37℃过夜选择转化突变型，并通 过PCR证实cat基因在基因组中正确位置的存在情况。所得氯霉素抗 性克隆(wbaP::cat)称为SKI11。移除氯霉素抗性盒可通过使用编码识 别侧翼FRT区的FLP重组酶的pCP20，所得菌株经PCR验证后称为 SKI12(亦参见IIg，Endt等，Inf.Immun.，77，2568，2009年6月)。

所得菌株的糖缀合物的表型分析通过SDS-PAGE和随后银对糖 缀合物的染色来进行。对于SDS-PAGE，样品如下制备：将2OD₆₀₀/ml 当量的野生型鼠伤寒沙门氏菌或ΔwbaP鼠伤寒沙门氏菌(SKI12)的对 数期菌生长培养物以16,000g离心2min，弃去上清液。将细胞重悬于 100μl样品缓冲液(0.065M Tris-HCl pH 6.8、2％SDS(w/v)、5％ β-巯基乙醇(v/v)、10％甘油(v/v)、0.05％溴酚蓝(w/v))，并在95℃裂解 5min。冷却到室温后，加入蛋白酶K(Gibco/Life Technologies)(终浓 度为0.4mg/ml)并在60℃孵育1h，然后将等份上样到12％十二烷基硫 酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中。为检测鼠伤寒沙门氏菌O- 抗原，使用沙门氏菌O抗血清B群因子1、4、5、12(Difco)。使用制 造商推荐的山羊抗兔IgG-HRP缀合物(Santa Cruz)和ECL(Amersham) 完成信号的可视化。对于染色，使用Tsai和Frasch的方法(Tsai和Frasch， Anal.Biochem.119(1)：115-9，1982)。

野生型肠沙门氏菌中缺失编码磷酸半乳糖基转移酶的基因WbaP 导致O-抗原生物合成的废止，如图2B中所示。SDS-PAGE和随后的 糖缀合物银染以及SDS-PAGE和之后使用沙门氏菌B群特异性抗-O- 抗血清的免疫印迹，显示鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌野生型菌株的典 型脂多糖梯状图案，而在ΔwbaP菌株中不存在该图案。

测试了该O-抗原阴性鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌ΔwbaP SKI12 在其细胞表面上展示空肠弯曲杆菌N-聚糖的能力。通过电穿孔引入质 粒pACYCpgl_mut或pACYC184。按照实施例1所述分析转化突变型的 糖缀合物。相比含有野生型，在含有ΔwbaP菌株的泳道中可检测到较 高强度的空肠弯曲杆菌N-聚糖(图2A泳道2对比泳道4)。当空载体 pACYC184存在于鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌ΔwbaP SKI12中时，检 测不到空肠弯曲杆菌N-聚糖。这证明，在ΔwbaP菌株中更多空肠弯 曲杆菌N-聚糖被转移到脂质A核心。

实施例3：构建导致鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌上空肠弯曲N- 聚糖展示增加的改变的空肠弯曲杆菌pgl_mut操纵子

在空肠弯曲杆菌中，N-聚糖被合成为七糖GalNAc5(Glc)-Bac，其 中还原末端的糖Bac是2，4-二乙酰氨基-2，4，6三脱氧-D-吡喃葡萄糖。 在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中不合成Bac，除非异源表达空肠弯曲 杆菌N-聚糖生物合成机制。在共表达空肠弯曲杆菌N-聚糖生物合成 机制的大肠杆菌野生型细胞中，合成两种不同类型的N-聚糖，一种在 还原端带有Bac，一种带有GlcNAc。该现象可归因于WecA的作用， WecA是参与糖脂生物合成的UDP-GlcNAc：十一异戊烯磷酸 GlcNAc-1-磷酸转移酶(Linton D.等，Mol.Microbiol.，55(6)：1695-703， 2005)。由于已知鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌O-抗原连接酶WaaL可 将含GlcNAc的结构转移到脂质A核心，故推断，含GlcNAc的N- 聚糖相比含Bac的N-聚糖可能是更好的WaaL底物。构建pgl_mut操纵 子，其缺失用于杆菌胺生物合成的基因，即pglD、E、F、G。编码PglE、 F、G的基因完全缺失，而编码PglD的基因部分缺失。改变的pgl操 纵子中的pglD开放阅读框(ORF)在270个碱基对后终止，而全长ORF 包含612个碱基对。构建该改变的pgl_mut操纵子的步骤是使用大肠杆 菌DH5α作为质粒增殖的宿主菌株进行，步骤如下：用Alw44I和SmaI 消化pACYCpglmut DNA，然后用DNA聚合酶I Klenow片段补平 Alw44I突出端并重新连接。将所得操纵子称为pACYCpgl3mut，并转 化到ΔwbaP菌株中。按照实施例1所述分析所得转化突变型的糖缀合 物。当与野生型相比时，在含有带pgl3mut操纵子的ΔwbaP菌株的泳 道中相比含有带pglmut操纵子的ΔwbaP菌株的泳道中，可检测到较 高强度的空肠弯曲杆菌N-聚糖(图2A泳道5对比泳道4)。总而言之， 当用抗空肠弯曲杆菌N-聚糖抗血清调查时，带pgl3mut的ΔwbaP菌 株显示最高强度，因此证明空肠弯曲杆菌N-聚糖展示在鼠伤寒血清变 型肠沙门氏菌脂质A核心上的最高水平。

实施例4：将pgl3mut操纵子整合到O-抗原阴性鼠伤寒血清变型 肠沙门氏菌ΔwbaP菌株基因组中

为保证空肠弯曲杆菌N-聚糖持续体内展示在鼠伤寒血清变型肠 沙门氏菌ΔwbaP菌株脂质A核心上，将pgl3mut操纵子整合到ΔwbaP 菌株SKI12基因组中pagC基因下游。

涉及带oriR6K的自杀质粒的所有克隆步骤在CC118λpir大肠杆 菌中进行。最终整合的自杀质粒pKI15如下构建：与沙门氏菌基因组 中的靶区同源的512bp序列通过PCR扩增，引物为3′PagC Fw NotI 和3′PagC Rev SacII(序列见表1)。用SacII和NotI将所得DNA片段 插入pSB377中，并在验证插入序列后将质粒称为pKI14。PKI15通过 用BamHI和EheI消化pACYCpgl3mut DNA及同时用BamHI和SmaI 消化pKI14来构建。然后将从pACYCpgl3mut切下的11083bp片段与 pKI14骨架连接。因为将自杀质粒电穿孔到沙门氏菌菌株中的效率非 常低，故首先通过电穿孔将pKI15或pKI14引入大肠杆菌Sm10λpir 中接合。含有pKI15或pKI14的Sm10λpir然后与SKI12接合。为了 杂交，将4OD600当量的含有pKI15和SKI12的Sm10λpir对数期后 期培养物离心，并用1mL LB洗涤3次。将沉淀重悬于100μl LB、混 合并以3cm的直径涂布到LB琼脂平板上，然后在37℃孵育过夜。次 日早晨用1mL LB将细菌从平板上洗下，并将数种稀释物涂布到 LB(+strep+tet)上以选择接合体。所得菌株称为SKI34(SKI12::pKI14) 和SKI35(SKI12::pKI15)。

为测试含有整合的pgl3_mut簇或作为阴性对照的整合空载体的O- 抗原阴性菌株脂质A核心上的空肠弯曲杆菌N-聚糖，按照实施例1 所述制备和分析SKI34和SKI35的全细胞提取物。图2C是用抗空肠 弯曲杆菌N-聚糖抗血清检测的免疫印迹，其显示在含SKI35的泳道2 中的强信号，但是含SKI34的泳道1中没有信号。这证明了空肠弯曲 杆菌N-聚糖从整合的pgl3mut操纵子到鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌脂 质A核心的有效转移。

实施例5：pgl3_mut操纵子编码的聚糖的免疫原性

为了研究pgl3_mut编码聚糖的免疫原性，用热灭活细菌 SKI12+pMLpgl3_mut感染小鼠，并对小鼠血清测试抗空肠弯曲杆菌N- 聚糖抗体。实验如下进行：

小鼠感染实验

按照之前所述(Stecher，Hapfelmeier等，Infection Infect Immun. 2004年7月；72(7)：4138-502004)，沙门氏菌感染在RCHCL，Zurich 的单独通风的笼子中进行。对于静脉内感染，将5x 10⁵CFU的携带 pMLBAD(对照)或pMLpgl3_mut的热灭活鼠伤寒沙门氏菌SL1344 wbaP (SKI12)注射到小鼠尾部静脉中。在感染后第29天分析血清后，在第 36天用相同的细菌菌株再次注射小鼠并在第50天分析血清。

小鼠血清分析

通过针对空肠弯曲杆菌81-176和81-176pglB(阴性对照)的全细 胞提取物的免疫印迹来对小鼠血清分析抗空肠弯曲杆菌抗体的产生。 空肠弯曲杆菌81-176pglB不产生糖基化蛋白质，作为阴性对照。全细 胞提取物通过用1ml PBS从汇合细菌生长的平板上收获空肠弯曲杆 菌来制备。在用PBS调节样品至相同光密度后，通过室温16000x g 离心2min收集细胞。将细胞在样品缓冲液(0.065M Tris-HCl  pH 6.8、2％SDS(w/v)、5％β-巯基乙醇(v/v)、10％甘油(v/v)、0.05％溴 酚蓝(w/v))中于95℃裂解5min，用PBS添加至如前所确定的相同终体 积，以在每个样品中得到相同数量的细胞。这通过SDS-PAGE分离等 体积的各样品之后用考马斯蓝对蛋白质染色来证实。此外，使用糖基 化和未糖基化的蛋白AcrA使针对空肠弯曲杆菌N-聚糖的免疫应答可 视化。对于小鼠血清的分析，通过SDS-PAGE分离等体积的全细胞提 取物以及等量的糖基化和未糖基化的AcrA，然后将这些蛋白质转移 到聚偏二氟乙烯膜上以进行免疫印迹检测。小鼠血清在第一孵育步骤 中作为第一抗血清。结合的IgG通过抗小鼠IgG-HRP缀合物(Bethyl  Laboratories)鉴定。根据制造商的说明用ECL(Amersham)进行检测。

图1D)显示再次感染后61天的小鼠血清中抗空肠弯曲杆菌N-聚 糖-IgG的存在情况。抗体不识别未糖基化的AcrA或未糖基化的空肠 弯曲杆菌蛋白质提取物，从而证明了对多糖的特异性。用对照菌株感 染小鼠血清观察不到空肠弯曲杆菌N-聚糖特异性反应(数据未显示)。

实施例6：鼠伤寒沙门氏菌ΔwbaP的减毒表型

鼠伤寒沙门氏菌ΔwbaP的减毒通过若干体外方法和一种体内方 法测试。体外方法由测试突变型以及野生型的血清抗性、移动性和对 抗微生物肽模拟多粘菌素B的抗性组成。在体内共感染实验中分析 ΔwbaP的建群能力。

血清抗性分析

基本按照所述(Bengoechea，Najdenski等2004)测试补体的杀菌 活性。简言之，将取自对数生长培养物的鼠伤寒血清变型wbaP::cat (SKI11)、鼠伤寒血清变型野生型SL1344菌株的卡那霉素抗性衍生菌 株M939(aph整合到sopE下游)和鼠伤寒血清变型ΔwbaP::pKI9 (SKI33)细胞以等量混合(M393为3x10⁸cfu/ml；SKI11和SKI33为 4x10⁸cfu/ml)，在使用前在无菌1x PBS中稀释5x10⁴倍。将该稀释的 细菌培养物与不含针对鼠伤寒血清变型LPS的抗体的20％人血清以 1∶1混合，并在37℃轻微搅拌下孵育。在混合后第0、15、30min取 整分试样，并通过加入脑心浸液肉汤猝灭补体活性。将整分试样置于 冰上，直到涂板在LB(strep、kan)上以选择野生型、涂板在LB(Sm、 Cam)上以选择wbaP::cat和涂板在LB(Sm、Tet)上以测定ΔwbaP::pKI9 CFU。用其中补体在56℃热灭活30min的血清进行相同实验。数据显 示为log CFU平均值±标准差。图3A显示ΔwbaP鼠伤寒沙门氏菌的 血清抗性比野生型降低：在与20％人血清孵育30min之后，ΔwbaP 的数目减少为孵育期开始时的六十分之一。图3B描述作为阴性对照 的与热灭活血清一起孵育的相同菌株。

游动性测定

因为细菌的游动性是已知的毒力因子，故在软的琼脂平板(0.3％ (w/v)琼脂、5g/l NaCl、10g/l Baceto胰蛋白胨)上测试细菌的游动性。 将1μl鼠伤寒血清变型野生型(SL1344)、鼠伤寒血清变型ΔwbaP (SKI12)、鼠伤寒血清变型ΔwbaP::pKI9(SKI33)或鼠伤寒血清变型 fliGHI::Tn10(M933)的过夜培养物点在平板中央，通过在37℃孵育 4.75h和9.5h后测量可见菌斑的直径来定量游动性。每个实验均在两 个不同的地方做三个重复，数据显示为平均值±标准差。如图3C中所 示，ΔwbaP(SKI12)的游动性与野生型相比大大降低，但仍高于非游动 性对照fliGHI::Tn10。

多粘菌素B抗性分析

在使用前，将1OD₆₀₀/ml当量的鼠伤寒血清变型野生型SL1344 菌株或鼠伤寒血清变型ΔwbaP(SKI12)的指数生长培养物离心，重悬 于150μl冷的无菌1x PBS中并稀释5×10⁶倍。对于测定，将45μl稀 释的培养物与5μl多粘菌素B(Sigma，1μg/ml终浓度)或5μl PBS混合， 并在37℃轻微搅拌下孵育1h。加入80μl LB后，将细菌涂板于含链霉 素的LB琼脂平板上。存活率(survival efficiency)通过将肽处理培养物 的CFU(菌落形成单位)除以未处理培养物的CFU再乘以100来计算。 测定通过两次独立实验各进行三次，数据显示为平均值±标准差。图 3D中证实ΔwbaP鼠伤寒沙门氏菌的多粘菌素B抗性相比野生型降低。

ΔwbaP在共感染实验中的建群能力

在共感染实验中测试ΔwbaP鼠伤寒沙门氏菌的建群能力，其中 用ΔwbaP突变型和野生型菌株胃内感染小鼠。通过管饲法用20mg 链霉素预处理C57BL/6小鼠(SPF；RCHCI，Zurich的群体)。24h后，对 小鼠接种5×10⁷CFU的所示的鼠伤寒血清变型菌株或菌株混合物。按 照之前所述(Barthel，Hapfelmeier等2003)，通过涂板到MacConkey琼 脂平板(含50μg/ml链霉素)上测定新鲜粪粒、肠系膜淋巴结(mLN)、 脾和盲肠内含物中的细菌载量(CFU)。在涂板后，竞争指数(CI)按照如 下公式确定：CI＝(突变型/野生型)输出/(突变型/野生型)输入。进行鼠 伤寒血清变型野生型(M939)和ΔwbaP菌株(SKI11)的共感染实验。对 5只链霉素处理小鼠胃内感染ΔwbaP菌株(SKI11)和野生型菌株的1∶2 混合物(共5×10⁷CFU)。在感染后第1、2和3天的粪便中测定2种菌 株的比率(CI；竞争指数，见材料与方法)。检测到ΔwbaP菌株数目相 比野生型减少(每天一个对数级)，证明ΔwbaP菌株(SKI11)与野生型鼠 伤寒血清变型相比在肠道中确实具有严重的竞争缺陷(p＞0.05；图 4A)。此外，感染后第4天两种菌株在全身性部位(mLN、肝、脾)的 CI也证明鼠伤寒血清变型ΔwbaP(SKI12)显著的竞争缺陷。然而，缺 陷不如在肠中显著(图4B)。

表1：本研究中所用的用于WbaP缺失的菌株、质粒和引物