一种BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊及应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊及其应用， 包裹的质粒是分别由绿色和红色荧光蛋白标记的BMP-2(骨形态发生蛋白-2)和bFGF(碱 性成纤维细胞生长因子)，该壳聚糖纳米微囊包裹的BMP-2和bFGF双基因能同时转染入细 胞并有效表达。

背景技术

骨缺损常由外伤、感染及肿瘤等疾病引起，会造成严重的人体功能障碍和外貌畸形，给 患者工作、生活、社交带来巨大的影响，是临床医学面临的一大难题。目前对骨缺损的治疗 主要有自体骨移植修复和各种材料充填两种。前者的主要缺点在于供区损伤和供骨有限；后 者的主要缺点在于移植物排斥和成骨性能不良等。当前骨缺损治疗的困境在于：骨缺损治疗 仍然以传统方法为主，且效果欠佳；基因治疗骨缺损存在很多问题。这就有必要应用多样的 技术，特别是多基因联合治疗的方法，对组织工程化人工骨的构建进行改良和完善。

基因治疗是维持骨缺损局部生长因子有效治疗浓度进而提高疗效最有希望的一种方法。 其优点在于：保证基因产物的局部靶向释放；可最大限度地增加局部治疗效果，减少副作用； 多种基因可分别转导，并分别调控，内源性合成的蛋白质比外源性重组蛋白具有更强的生物 活性。

但是，骨缺损基因治疗目前至少存在以下问题：①研究多集中与单一基因方面，而事实 上，在骨折愈合及骨生成过程中，有多个基因共同参与并协同表达；②基因转染多采用病 毒为载体，一般只转载一个基因，同时存在免疫原性、安全性等很多问题；③种子细胞来 源受限制，骨髓基质细胞等的获取繁琐且难于被患者所接受。

自1965年Urist首先发现骨形态发生蛋白(Bone morphogenticproteins，BMPs)具有骨诱导 能力以来，骨的生长和修复受骨诱导因子的调控已被国内外学者所公认。BMPs是唯一一类 能够启动成骨分化，并作用于成骨整个过程的细胞因子。BMP-2是第一个在体内实验中证 明具有诱骨活性的BMP分子，并且可作为诱骨的充分条件，即在只有单独BMP-2存在的情 况下即可诱导软骨和骨组织的形成。在局部使用BMP-2蛋白或转染了BMP-2基因的骨髓基 质干细胞用于治疗骨缺损已经获得了一定的成功。

然而，组织工程骨要得到理想的愈合效果，其再血管化是一个十分关键的环节。现已证 明碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)是体内最为有效的血管形成 因子之一，对新生血管形成过程中多个环节起作用，可刺激毛细血管内皮细胞的迁移和增生， 形成毛细血管芽，同时能刺激纤溶酶原激活剂和胶原酶分泌，对创伤区域的细胞外基质进行 降解，使毛细血管向创面区域延伸。bFGF也是一种强大的促软骨细胞、骨髓基质干细胞有 丝分裂因子，可促进软骨和骨组织的形成。与VEGF(Vascular endothelial growth factor，血 管内皮细胞生长因子)相比，BMP-2、bFGF基因修饰(各基因分别单独转染)的种子细胞 能够更为有效地在骨组织工程中发挥作用。

Franceschi等用腺病毒分别表达BMP-2、4和7后转染细胞，结果发现联合应用时成骨 能力提高。理论上BMP-2和bFGF的协同作用将取得更佳的成骨效果，这就需要去寻找能 同时转导多个基因的载体。

目前基因转染多采用病毒为载体，如逆转录病毒、腺病毒等，虽取得一定成功，但一个 病毒载体一般只能转载一个目标基因，同时在表达时间、免疫源性反应以及安全性方面仍存 在很多问题。据Nature和Scinece和的报道，1999年9月，18岁的美国少年Gelsinger J在 腺病毒介导的基因治疗临床研究中不幸死亡。裸露质粒由于转染效率较低而未推广，非病毒 载体如阳离子脂质体lipofectamine早在1987年就已研发，随之一些合成聚合物载体如赖氨 酸(PLL)、二氯乙基(DEAE)-葡聚糖、磷酸钙和树枝状聚合物等均用于DNA释放，还包 括一些控制释放聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(EVAc)等。

纳米载体分为纳米微囊和纳米颗粒，壳聚糖载体是纳米微囊结构，它将基因包裹在内部， 纳米颗粒则将基因结合在颗粒的表面。壳聚糖是由β-1-4键合葡糖胺和一部分N-乙酰基葡 糖胺组成的天然线性阳离子多糖，为低毒性且生物相容性基因载体，因而可增加DNA/壳聚 糖配合物剂量而提高其转染率。Corsi等采用壳聚糖DNA纳米载体转染人骨髓间充质干细 胞、肾肉瘤细胞和人胎肾细胞，发现壳聚糖DNA纳米微囊在基因转运中具有毒性小、细胞 型依赖性的特点。

壳聚糖纳米微囊(Nanosphere)包裹非病毒载体基因转移技术是一种较为成熟的多基因转 移技术。主要特点在于：①纳米微囊包裹可避免转载物在受体内被溶酶体酶降解；②同时 可包裹多个转导基因；③由于采用可降解生物材料包裹，故明显提高转载基因的活性并具 有长时间缓释功能；④体内及体外多种细胞系转染证明其有较脂质体优越的基因转移效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊，微囊的基质为壳聚糖， 包裹的质粒分别是绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白-2(pEGFP-N2-Hu-BMP-2)和红色 荧光蛋白标记的人碱性成纤维细胞生长因子(pTagRFP-C1-Hu-bFGF)。壳聚糖购自美国Sigma 公司(low molecular weight，Sigma-Aldrich，脱乙酰度75-85％，货号：448869-50G)，包裹 的质粒与壳聚糖的质量比为1∶1，其中BMP-2和bFGF各半(质量比1∶1)。

本发明所述微囊主要通过以下步骤制备：

(1)壳聚糖溶液的配制：称壳聚糖50mg，加入359ul乙酸，加灭菌去离子水(SDW) 至2.5mL，37度过夜；次日加SDW至245ml，调pH为5.5，最后定容250mL，真空过滤 (0.22um滤膜)除菌得a液的壳聚糖溶液，此时壳聚糖溶液的溶度为0.2g/L；

(2)DNA溶液的配制：将质量比1∶1的pEGFP-N2-Hu-BMP-2和pTagRFP-C1-Hu-bFGF 溶解于5mM的硫酸钠钠溶液中，配制成200μg/mL(0.2g/L)质粒溶液(100μg/mL BMP-2 质粒+100μg/mL bFGF质粒)，得到b液；

(3)壳聚糖纳米微囊的制备：将a液、b液分别加热，55度水浴15min，按1∶1混合， 2500rpm搅拌30秒，即得100ng/uL的BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊溶液，4摄氏度 保存。

本发明的另一个目的是提供所述微囊在制备基因治疗骨缺损药物中的应用。

绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白-2(pEGFP-N2-Hu-BMP-2)和红色荧光蛋白标记 的人碱性成纤维细胞生长因子(pTagRFP-C1-Hu-bFGF)是从人成纤维细胞中分别提取BMP-2 和bFGF，再分别与绿色荧光蛋白载体pEGFP-N2(Clontech，美国)和红色荧光蛋白载体 pTagRFP-C1(Evrogen，Moscow，Russia)连接构建，具体构建方法见实施例1。经菌落PCR、 双酶切鉴定以及测序三种方法，均表明pTagRFP-Hu-bFGF重组表达载体的构建是正确的， 而且Hu-bFGF和RFP(红色荧光蛋白)以融合表达的方式在Kozak sequence的帮助下进行 高水平真核细胞的表达。

原子力显微镜(SPI3800N)下观察见壳聚糖纳米微囊呈不规则球形，结构紧密，粒径约 为100-200nm，大小较均一(图1)。荧光显微镜下观察可见转染后同一细胞内出现绿色和红 色(图2)，说明分别标记有绿色和红色荧光蛋白的双基因转入同一细胞表达。

本发明针对骨缺损基因治疗方面的三方面不足设计BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微 囊，采用纳米微囊包裹非病毒载体多基因转移技术，转染于脂肪干细胞(脂肪源性基质细胞， Adipose Derived Stem Cells，ADSCs)，以取得更好的成骨性能。本发明微囊的基质选用壳聚 糖，包裹的质粒是分别由绿色和红色荧光蛋白标记的BMP-2和bFGF。经实验证实，该壳聚 糖纳米微囊包裹的BMP-2和bFGF双基因能同时进入细胞并有效表达，因此可在制备基因 治疗骨缺损药物中的应用。该微囊的制备方法简单，条件温和，效果良好，壳聚糖在体内可 以完全降解并代谢，其分解产物及代谢产物对人体健康无害，有良好的应用前景。

附图说明

图1为原子力显微镜下的壳聚糖纳米微囊。

图2为BMP-2/bFGF双基因共转染的荧光照片(a为绿色荧光激发，b为红色荧光激发，c 为双色荧光合成照片)。

图3为壳聚糖纳米微囊的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

图4为原子力显微镜下的壳聚糖纳米微囊(稀释后放于云母片上)。

图5为原子力显微镜下壳聚糖纳米微囊粒径测量(稀释后放于云母片上)。

图6为Western Blotting检测。

具体实施方法

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊的制备

BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊的制备方法主要分为如下4个步骤：

①构建绿色和红色荧光蛋白分别标记的BMP-2和bFGF：分别构建pEGFP-N2-Hu-BMP-2 和pTagRFP-C1-Hu-bFGF，并经经菌落PCR、双酶切鉴定以及测序三种方法，均表明 pTagRFP-Hu-bFGF重组表达载体的构建是正确的，而且Hu-bFGF和RFP(红色荧光蛋白) 以融合表达的方式在Kozak sequence的帮助下进行高水平真核细胞的表达。构建方法如下。

(一)pEGFP-N2-Hu-BMP-2的构建：用总RNA提取试剂盒(杭州浩基生物科技有限 公司)提取人成纤维细胞总RNA，再用SuperScript^TM II RTase(Invitrogen)合成cDNA，然 后进行Hu VEGF ORF PCR扩增反应。

PCR引物设计和合成：根据基因数据库VEGF-A序列，采用Primer Premier 6.0软件进 行荧光引物的设计，然后由上海生物工程有限公司负责合成，引物序列如下：

正向引物：Hu-Bmp2-F：见SEQ ID NO.1。

反向引物：Hu-Bmp2-R：见SEQ ID NO.2。

表1PCR反应体系

PCR反应条件：94℃2min；35cycles：94℃30sec  68℃1min

Hu BMP-2PCR扩增结果：1200bp左右(实际为1188bp)。该PCR产物通过凝胶回收 试剂盒(杭州浩基生物科技有限公司)进行纯化回收。

Hu BMP ORF PCR和表达载体pEGFP-N2(Clontech，美国)双酶切

表2双酶切反应体系及条件

双酶切反应条件：37℃酶切5hr。用PCR产物纯化试剂盒(杭州浩基生物科技有限公 司)进行纯化。

Hu BMP ORF PCR和表达载体pEGFP-N2双酶切产物连接反应

表3连接反应体系

连接反应条件：16℃过夜连接。

连接产物的转化：42℃热激条件下，连接产物转化化学感受态细胞JM109(杭州浩基生 物科技有限公司)，取50ul进行SOC固体培养板(含50ug/ml Kanamycin)涂板，37℃培养 过夜。

pEGFP-N2-Hu-BMP测序结果见SEQ ID NO.3。

(二)pTagRFP-C1-Hu-bFGF的构建：用总RNA提取试剂盒(杭州浩基生物科技有限 公司)提取人成纤维细胞总RNA，再用SuperScript^TM II RTase(Invitrogen)合成cDNA，然 后进行Hu bFGF ORF PCR扩增反应。

PCR引物设计和合成：根据基因数据bFGF基因序列，采用PrimerPremier 6.0软件进行 bFGF ORF克隆引物的设计，然后由上海生物工程有限公司负责合成，引物序列如下：

正向引物：Hu-bFGF-F：见SEQ ID NO.4。

反向引物：Hu-bFGF-R：见SEQ ID NO.5。

表4PCR反应体系

PCR反应条件：94℃2min；35cycles：94℃30sec  68℃30sec

Hu bFGF PCR扩增结果：460bp左右(实际为468bp)。该PCR产物通过凝胶回收试剂 盒(杭州浩基生物科技有限公司)进行纯化回收。然后进行Hu bFGF ORF PCR和表达载体 pTagRFP-C 1双酶切。

表5双酶切反应体系

双酶切反应条件：37℃酶切5hr。PCR产物纯化试剂盒(杭州浩基生物科技有限公司) 进行纯化。

最后进行Hu bFGF ORF PCR和表达载体pTagRFP-C1(Evrogen，Moscow，Russia)双酶 切产物连接反应。

表6连接反应体系

连接反应条件：16℃过夜连接。

连接产物的转化：42℃热激条件下，连接产物转化化学感受态细胞JM109(杭州浩基生 物科技有限公司)，取50ul进行SOC固体培养板(含50ug/ml Kanamycin)涂板，37℃培养 过夜。

pTagRFP-C1-Hu-bFGF测序结果见SEQ ID NO.6。

②壳聚糖溶液的配制：称壳聚糖50mg，加入359ul乙酸，加SDW(灭菌去离子水)至 2.5mL，37度过夜；次日加SDW至245ml，调pH为5.5，最后定容250mL，真空过滤(0.22 um滤膜)除菌得a液。壳聚糖购自美国Sigma公司(low molecular weight，Sigma-Aldrich， 脱乙酰度75-85％，货号：448869-50G)。

③DNA溶液的配制：将质量比1∶1的pEGFP-N2-Hu-BMP-2和pTagRFP-C1-Hu-bFGF 溶解于5mM的硫酸钠钠溶液中，配制成200μg/mL质粒溶液(100μg/mL BMP-2质粒+100 μg/mL bFGF质粒)，得到b液。

④壳聚糖纳米微囊的构建：将a、b分别加热，55度水浴15min，按1∶1混合，漩涡(2500 rpm)30sec即得100ng/uL的BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊溶液，4摄氏度保存。包裹 的质粒与壳聚糖的质量比为1∶1。

实施例2壳聚糖纳米微囊的鉴定

壳聚糖-质粒纳米粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定：取壳聚糖-质粒纳米粒，进行0.8％琼脂糖凝 胶电泳，经溴化乙啶染色，然后紫外成像，P对照为纯的质粒泳道，1和2号为壳聚糖-质粒 纳米粒泳道，因DNA与壳聚糖形成包裹颗粒而滞留在加样孔附近(图3)。

壳聚糖-质粒纳米粒的形态和粒径：将制备好的包含质粒的纳米微囊直接放于原子力显 微镜(SPI3800N)下观察见壳聚糖纳米微囊呈不规则球形，结构紧密，粒径约为100-200nm， 大小较均一(图1)。再将壳聚糖-质粒纳米粒用30mmol/LNa2SO4按1∶15稀释，取稀释液 5ul固定于清洁的云母片上，用N₂吹干，于原子力显微镜下观察纳米形态(图4)并测量粒 径(图5)。

实施例3BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊转染脂肪干细胞后的表达

用BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊转染脂肪干细胞，荧光显微镜下观察可见转染后 24小时同一细胞内出现绿色和红色，说明标记有红色和绿色荧光蛋白的双基因转入同一细 胞表达(图2)。

实施例4BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊转染脂肪干细胞后的Western Blotting检 测

(一)主要试剂和仪器

1.试剂：40％丙烯酰胺溶液(Sangon公司)；West Dura Extended Duration Substrate(美国Pierce)；PVDF膜(Millipore)；PageRuler^TM Plus Prestained Protein Ladder (10-250kDa)(Fermentas)，BMP-2(ab6285)抗体(美国abcam)；bFGF(ab16828)抗体(美 国abcam)；内参β-actin(美国Santa Cruz)；羊抗兔IgG-HRP(美国Pierce)；羊抗小鼠IgG-HRP (美国Pierce)；(甲醇、冰乙酸等常规试剂(华东医药股份有限公司)

2.仪器：紫外分光光度计(德国Eppendorf)；Mini-PROTEAN垂直电泳和转膜系统(美 国BIO-RAD)

(二)主要步骤

1.样品制备和定量

采用T-PER Tissue Protein Extraction Reagent(含Protease Inhibitor Cocktail)(美国Pierce) 进行8个样品总蛋白的提取，然后采用BCA定量试剂盒(碧云天生物科技有限公司)进行 总蛋白定量。

2.SDS-PAGE电泳分析

配制8％分离胶和5％浓缩胶，每个孔60ug总蛋白进行上样，每孔12ul，浓缩胶60V， 分离胶80V进行电泳3hr左右。

3.蛋白质转膜

PVDF膜甲醇中浸泡20sec，然后转移到Tris-Glycine转移缓冲液(15％甲醇)中平衡至 少5min；SDS-PAGE胶在Tris-Glycine转移缓冲液平衡至少30min；在冷却条件下以100v 恒压转膜2hr。

4.转印膜封闭

转膜结束后，放到T-TBS(含5％脱脂奶粉)室温封闭1hr，然后T-TBS漂洗，5min×3；

5.一抗杂交

一抗以1∶1000比例溶于T-TBS(含2％脱脂奶粉)，4℃孵育过夜；然后T-TBS漂洗5 min×4；内参β-actin以1∶1000溶于一抗稀释液中；

6.二抗杂交

bFGF采用羊抗兔IgG-HRP以1∶8000溶于T-TBS(含2％脱脂奶粉)，室温1hr，；然后 T-TBS漂洗5min×5；BMP-2与内参β-actin采用羊抗小鼠IgG-HRP以1∶10000溶于二抗稀释 液中；

7.信号检测

采用West Dura Extended Duration Substrate，按说明书操作，制备约1ml ECL 工作液，室温孵育转印膜1min，然后去除多余ECL试剂，保鲜膜密封，暗盒中放上X-film 曝光5-10min后进行显影和定影。

8.数据分析

光密度扫描BMP-2相对表达量＝BMP-2/内参β-actin*10bFGF相对表达量＝bFGF/内 参β-actin*10进行表示。

(三)实验结果

检测结果见图6，样品编号(1-8)从左到右依次为：正常，bFGF，BMP-2，bFGF+BMP-2； 正常，bFGF，BMP-2，bFGF+BMP-2。

表7

(四)结论

BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊转染组中，BMP-2的表达量明显高于空白组和和 bFGF对照组，但是略低于BMP-2对照组；bFGF表达量均明显高于空白组和和BMP-2对照 组，但是略低于bFGF对照组。

实施例5BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊转染脂肪干细胞后的Real-Time PCR检测

(一)组织总RNA提取方法

1.试剂：总RNA提取试剂盒(杭州浩基生物科技有限公司)

2.仪器：移液器(Gilson)，高速冷冻离心机(Sigma)，振荡器，紫外分光光度计(Eppendorf 公司)

3.步骤：

1.人脂肪干细胞：

8个人脂肪干细胞样品处理后已加裂解液，再加0.2ml氯仿。

2.盖上离心管盖子，剧烈的振荡15sec，在冰上孵育5min。室温下，12,000rmp离心10min。 此时混合物分成三层：底层为苯酚-氯仿相层，中间层和上层水相层。RNA完全存在与水 相中。

3.转移不多于80％上层水相至新的离心管中，缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀。将 得到溶液和沉淀一起转入GBC吸附柱中，12,000rpm离心30sec；若一次不能将全部溶液 和混合物加入GBC吸附柱，请分两次转入GBC吸附柱中，12000rpm离心30sec，弃掉收 集管中的废液。

4.向GBC吸附柱中加入500ul Wash Buffer I离心1min，弃废液。

5.向GBC吸附柱中加入680ul Wash Buffer B，12,000rmp离心30sec，倒掉废液，GBC吸 附柱放入收集管中。

6.向GBC吸附柱中加入680ul Wash Buffer B，12,000rmp离心30sec，倒掉废液，GBC 吸附柱放入收集管中。

7.12,000rmp离心1min。

8.将GBC吸附柱转入一个新的离心管中，加50ul RNase-free ddH₂O，室温放置2min，然 后4℃12,000rmp离心1min.。分光光度计测定RNA样品的含量及纯度，具体结果见表8：

表8 8个样品Total RNA含量和纯度

样品编号(从上到下)：正常，bFGF，BMP-2，bFGF+BMP-2；正常，bFGF，BMP-2，bFGF+BMP-2

(二)逆转录实验

1.试剂：SuperScript^TM II RTase(Invitrogen)

2.仪器：PCR基因扩增仪(Bio-Rad)

3.步骤

(1)在200ul RNase-free的离心管中混合下列成分：

Total RNA      2ug

Oligo(dT)18    1ul

dNTPs(10mM)    1ul

加DEPC处理水至15ul；70℃，5min变性，立即放到冰上；

(2)然后依次加入下列试剂：

混合上述成分，离心，42℃温育1hr，-20℃长期保存。

(三)基因表达水平差异检测(Real-Time PCR)

1.试剂：Premix Ex Taq^TM(Peffect Real Time)(TaKaRa公司)(Catalog No. DRR041A)

2.仪器：iQ^TM5多重实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)

3.实验过程

(1)荧光定量PCR引物设计和合成

采用Primer Premier 6.0和Beacon designer软件进行荧光引物的设计，然后由上海生物 工程有限公司负责合成，引物序列见SEQ ID NO.7～16。

(2)Real-Time PCR扩增体系和反应条件

反应体系(25u1)

ddH2O：10.5ul

SYBR Premix Ex Taq^TM (2×)：12.5ul

PCR-F(10uM)：0.5ul

PCR-R(10uM)：0.5ul

模板cDNA：1.0ul

反应条件：95℃，1min；45个循环：95℃，10sec；62℃，25sec(收集荧光)

熔点曲线分析55℃to 95℃。

(3)Real-Time PCR基因表达差异的数据统计

每个样品重复三次，各个基因的相对表达水平以2^{(Ct内参基因-Ct目的基因)}进行统计分析。

(四)实验结果

表9Human bFGF基因相对表达量结果

表10Human BMP-2基因相对表达量结果

表11Human BSP基因相对表达量结果

表12Human OCN基因相对表达量结果

(五)结论

虽然BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊转染组的BMP-2和bFGF表达低于相应单基 因转染组(这与实施例4中Western Blotting的检测结果一致)，但是成骨性能却明显增强， 具体表现为BSP(bone sialoprotein，骨唾液蛋白)和OCN(osteocalcin，骨钙素)的明显升 高，明显高于空白组、BMP-2对照组和bFGF对照组。

<110> 浙江大学

<120>一种BMP-2/bFGF双基因壳聚糖纳米微囊及应用

<160> 16

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>构建Hu-BMP-2的正向引物(Hu-Bmp2-F)

<400> 1

GA AGATCT GCCACC ATGGTGGCCGGGACCCG    31                          

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>构建Hu-BMP-2的反向引物(Hu-Bmp2-R)

<400> 2

CG GAATTC GCGACACCCACAACCCTCCACAA 31

<210> 3

<211> 1438

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pEGFP-N2-Hu-BMP测序结果

<400> 3

TGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGT 80

GTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTGCCA 160

CCATGGTGGCCGGGACCCGCTGTCTTCTAGCGTTGCTGCTTCCCCAGGTCCTCCTGGGCGGCGCGGCTGGCCTCGTTCCG 240

GAGCTGGGCCGCAGGAAGTTCGCGGCGGCGTCGTCGGGCCGCCCCTCATCCCAGCCCTCTGACGAGGTCCTGAGCGAGTT 320

CGAGTTGCGGCTGCTCAGCATGTTCGGCCTGAAACAGAGACCCACCCCCAGCAGGGACGCCGTGGTGCCCCCCTACATGC 400

TAGACCTGTATCGCAGGCACTCAGGTCAGCCGGGCTCACCCGCCCCAGACCACCGGTTGGAGAGGGCAGCCAGCCGAGCC 480

AACACTGTGCGCAGCTTCCACCATGAAGAATCTTTGGAAGAACTACCAGAAACGAGTGGGAAAACAACCCGGAGATTCTT 560

CTTTAATTTAAGTTCTATCCCCACGGAGGAGTTTATCACCTCAGCAGAGCTTCAGGTTTTCCGAGAACAGATGCAAGATG 640

CTTTAGGAAACAATAGCAGTTTCCATCACCGAATTAATATTTATGAAATCATAAAACCTGCAACAGCCAACTCGAAATTC 720

CCCGTGACCAGACTTTTGGACACCAGGTTGGTGAATCAGAATGCAAGCAGGTGGGAAAGTTTTGATGTCACCCCCGCTGT 800

GATGCGGTGGACTGCACAGGGACACGCCAACCATGGATTCGTGGTGGAAGTGGCCCACTTGGAGGAGAAACAAGGTGTCT 880

CCAAGAGACATGTTAGGATAAGCAGGTCTTTGCACCAAGATGAACACAGCTGGTCACAGATAAGGCCATTGCTAGTAACT 960

TTTGGCCATGATGGAAAAGGGCATCCTCTCCACAAAAGAGAAAAACGTCAAGCCAAACACAAACAGCGGAAACGCCTTAA 1040

GTCCAGCTGTAAGAGACACCCTTTGTACGTGGACTTCAGTGACGTGGGGTGGAATGACTGGATTGTGGCTCCCCCGGGGT 1120

ATCACGCCTTTTACTGCCACGGAGAATGCCCTTTTCCTCTGGCTGATCATCTGAACTCCACTAATCATGCCATTGTTCAG 1200

ACGTTGGTCAACTCTGTTAACTCTAAGATTCCTAAGGCATGCTGTGTCCCGACAGAACTCAGTGCTATCTCGATGCTGTA 1280

CCTTGACGAGAATGAAAAGGTTGTATTAAAGAACTATCAGGACATGGTTGTGGAGGGTTGTGGGTGTCGCGAATTCTGCA 1360

GTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGCCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTtCACCGGGG 1438

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>构建Hu-bFGF的正向引物(Hu-bFGF-F)

<400> 4

GA AGATCT GCCACC ATGGCAGCCGGGAGCATC 32

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>构建Hu-bFGF的反向引物(Hu-bFGF-R)

<400> 5

ACGC GTCGAC TCAGCTCTTAGCAGACATTGG 31

<210> 6

<211> 1066

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pTagRFP-C1-Hu-bFGF测序结果

<400> 6

TCCCATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACTCGGCTGGGAGGCCAACACCGAGATGCTGTACCCCGCTGACGGC 80

GGCCTGGAAGGCAGAAGCGACATGGCCCTGAAGCTCGTGGGCGGGGGCCACCTGATCTGCAACTTCAAGACCACATACAG 160

ATCCAAGAAACCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCCGGCGTCTACTATGTGGACCACAGACTGGaAAGAATCAAGGAGGCCG 240

ACAAAGAGACCTACGTCGAGCAGCACGAGGTGGCTGTGGCCAGATACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGCACAAACTT 320

AATTCCGGACTCAGATCTGCCACCATGGCAGCCGGGAGCATCACCACGCTGCCAGCCCTGCCGGAGGACGGCGGCAGCGG 400

CGCTTTCCCGCCGGGCCACTTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTGCAAGAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCG 480

ACGGCCGAGTGGACGGGGTCCGCGAGAAGAGCGACCCACACATCAAACTACAACTTCAAGCAGAAGAGAGAGGGGTTGTG 560

TCTATCAAAGGAGTGTGTGCAAACCGTTACCTTGCTATGAAAGAAGATGGAAGATTACTAGCTTCTAAATGTGTTACAGA 640

CGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAGTCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGCTGGTATGTGG 720

CACTGAAACGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTTCTTCCAATGTCT 800

GCTAAGAGCTGAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCATAATCAGCCATACCACATT 880

TGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTG 960

TTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCA 1040

CTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAA 1066

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>荧光定量PCR正向引物（Hu BMP-2）

<400> 7

CCAAGATGAACACAGCTGGTCACAGA 26                          

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>荧光定量PCR反向引物(Hu-Bmp2)

<400> 8

CCCACGTCACTGAAGTCCACG 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>荧光定量PCR正向引物（Hu bFGF）

<400> 9

GGAGAAGAGCGACCCTCACATCA 23                          

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>荧光定量PCR反向引物(Hu bFGF)

<400> 10

GCCAGGTAACGGTTAGCACACACT 24

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>荧光定量PCR正向引物（Hu BSP）

<400> 11

CGAACAAGGCATAAACGGCACCA 23                          

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>荧光定量PCR反向引物(Hu BSP)

<400> 12

CTCCATTGTCTTCTCCGCTGCT 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>荧光定量PCR正向引物（Human OCN）

<400> 13

CAGTTCTGCTCCTCTCCAGGCA 22                          

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>荧光定量PCR反向引物(Human OCN)

<400> 14

CATCCATAGGGCTGGGAGGTCA 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>荧光定量PCR正向引物（Human OCN）

<400> 15

GACTCAACACGGGAAACCTCAC 22                          

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>荧光定量PCR反向引物(Human OCN)

<400> 16

CCAGACAAATCGCTCCACCAAC 22