芍药高频胚性愈伤组织分化的培养基及培养方法

技术领域

本发明涉及植物的组织培养领域，具体涉及一种芍药高频胚性愈伤组织分化的培养基及培养方法。

背景技术

芍药是我国传统名花，与其他花卉相比，芍药的组织培养难度较大。前人的研究表明，以叶片、叶柄、茎段等为外植体均能诱导愈伤组织，并能分化出芽，但试验取材污染重、愈伤褐化多、芽分化率低，这些研究结果与芍药遗传转化再生体系的要求相差甚远。

     中国专利申请《芍药离体组织培养方法》（公开号CN1675992）中公开了一种培养基：1/2MS培养基+V_C 50mg/L, pH为5.6。该申请成功之处在于建立了茎尖试管无性繁殖的方法；但不足之处体现在：不经过愈伤组织脱分化成苗的过程，未有芽生根的培养基配方，因此在生产和科研上均无应用价值。

     王吉凤等的研究结果能诱导出愈伤，并分化出不定芽（王吉凤, 李青, 孟会. 5个芍药品种愈伤组织诱导及分化研究[J]. 北京林业大学学报, 2011, 32(3): 213-216.），但仍存在愈伤褐化严重、玻璃化、易碎,芽分化率低，仅有7.95%，不适宜转基因研究应用的不足。

黄凤兰等的研究结果能诱导出愈伤组织，不定芽诱导率较高，达到每块愈伤组织分化出1.55个不定芽（黄凤兰, 孟凡娟, 牛红云, 张继星, 王莹. 芍药遗传转化再生体系的建立[J]. 东北农业大学学报, 2009, 40(6): 50-57.）。但胚性愈伤分化率同其他植物相比，仍然较低，与转基因研究的要求距离较远。

因此，芍药愈伤组织胚性芽分化率低的技术难题有待解决。

发明内容

为了克服现有技术芍药愈伤组织胚性芽分化率低的不足，本发明提供了一种芍药高频胚性愈伤组织分化的培养基及培养方法，有效地解决了问题。

本发明所采用的技术方案是，一种芍药高频胚性愈伤组织分化的培养方法，包括以下步骤：

(1) 选材：选生长健康、饱满、绿熟的种子；

(2) 种胚消毒及分离：将种子用75%酒精灭菌30 s，无菌水冲洗干净后0.1%升汞灭菌8 min，无菌水冲洗干净后浸泡于水中，依次将种皮、胚乳剥离，获得待接的种胚；

(3) 培养基配方及培养方法：

①愈伤组织分化：改良1/2MS基本培养基，添加NAA(0.5-2.0)mg/L + TDZ(0.1-0.5)mg/L，附加蔗糖30 g/L，琼脂 6 g/L， pH为5.8；

培养条件：温度25±2℃，暗培养两个月(图1)。

②胚性芽分化：改良1/2MS基本培养基，添加TDZ(1.0-5.0) mg/L，附加蔗糖100 g/L，琼脂 6 g/L，pH为5.8；

培养条件：温度25±2℃，光照强度1200lx±100lx，光照时间 12h/d(图2-3)。

本发明还公开了用于上述方法的培养基，包括芍药愈伤组织分化培养基芍药胚性芽分化培养基；所述芍药愈伤组织分化培养基，是在改良1/2MS基本培养基中添加NAA 0.5-2.0mg/L ， TDZ0.1-0.5mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂 6 g/L， pH为5.8；所述芍药胚性芽分化培养基，是在改良1/2MS基本培养基中添加TDZ 1.0-5.0mg/L，蔗糖100 g/L，琼脂 6 g/L，pH为5.8；其中改良1/2MS基本培养基配方是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO₃ 62.5 mg/L、NH₄NO₃ 125 mg/L、MgSO₄·7H₂O 62.5 mg/L、KH₂PO₄ 137.5 mg/L、CaCl₂·2H₂O 125 mg/L，其它微量元素、铁盐与有机成分含量不变。

本发明的有益效果体现在：

(1) 取材方便：利用种子作外植体可周年取材，不受季节限制，且初代培养污染率低。

(2) 出愈率高，褐化率低：该方法在种胚接种1个月后开始脱分化形成愈伤组织，2个月愈伤诱导效率达100%，且其不易褐化、质地致密，符合转基因的要求。

(3) 胚性芽的分化率高：每个愈伤组织可再分化形成8-16个胚性芽，能够满足转基因研究应用。

附图说明

图1是种胚形成愈伤组织的照片。

图2是愈伤分化胚性芽的照片。

图3是胚性芽后期生长情况照片。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1：

收集‘紫凤羽’ 自然成熟的种子，置于冰箱中备用。

（1）取材：将供试种子用1% NaClO消毒10 min，自来水冲洗干净，在水中浸泡1天，然后用75%酒精灭菌30 s， 0.1%升汞灭菌8 min，无菌水漂洗干净后，置于超净工作台上，依次将种皮、胚乳剥离，用解剖针挑出种胚。

（2）培养基配方：

改良1/2MS配方是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO₃ 62.5 mg/L、NH₄NO₃ 125 mg/L、MgSO₄·7H₂O 62.5 mg/L、KH₂PO₄ 137.5 mg/L、CaCl₂·2H₂O 125 mg/L，其它微量元素、铁盐与有机成分含量不变。

① 将种胚先接种于诱导胚性愈伤组织的以下3种培养基中：

1）、改良1/2 MS + NAA 0.5 mg/L + TDZ 0.1 mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6.0 g/L，pH为 5.8；

2）、改良1/2 MS + NAA 1.0 mg/L + TDZ 0.5 mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6.0 g/L，pH为 5.8；

3）、改良1/2 MS + NAA 2.0 mg/L + TDZ 0.5 mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6.0 g/L，pH为 5.8；

置于25 ℃暗培养2个月，种胚脱分化后均能形成一团不易褐化、质地致密的胚性愈伤组织（图1）。

② 将上述愈伤组织转入以下2种培养基中：

1）、改良1/2 MS + TDZ 1.0 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂 6.0 g/L，pH为5.8，

2）、改良1/2 MS + TDZ 5.0 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂 6.0 g/L，pH为5.8，

置于25 ℃，光强1200lx，光照时间12h/d的条件下进行培养，每块愈伤组织再分化可形成 8-16个胚性芽（图2、图3）。

本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求范围的各种变型和等效变化。