微-纳多尺度图案结构的抗凝血复合生物材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种复合生物材料及其制备方法，属于生物医用工程和生物材料技术领 域，特别是涉及一种微-纳多尺度图案结构的抗凝血复合生物材料及其制备方法。

背景技术

生物材料是可用来诊断，替代或修复生物机体内损伤的组织或器官的一类功能材 料，但目前绝大多数的生物材料植入体内会引发一系列不良的生理反应，因此除了开发 新的优异材料之外，对如何提高材料的生物相容性以运用到实际医学材料中成为该领域 的研究热点和艰巨挑战。而生物材料的物理与化学性质的稳定性，及生物相容性能的优 劣，成为它能否成功应用于临床医学的关键。

目前，抗凝血材料的研究体系主要包括有金属及其氧化物材料，无机材料，高分子 材料几大类。例如钛金属、氧化锌、碳纤维、生物陶瓷、聚氨醋、聚乳酸、胶原、壳聚 糖等。作为植入体的生物医用材料，必须满足生物相容性或活性、化学稳定性和良好的 机械性能。因此，对生物材料表面改性是提高植入体生物相容性能的主要途径，而表面 改性手段包括生物材料涂层化和材料表面微结构化(或活性化)及其复合技术。不管是 组织工程中的骨替换材料还是传统植入体的血液接触材料，其研究核心要素都包括支架 材料(载体)、表面生物活性因子(生长因子)和功能细胞(种子细胞)，寻求将这三要素有机 结合的新工艺、新技术是目前生物医用材料研究的重要方向。

材料与组织的反应，既有微米层次的材料-细胞或材料-组织之间，又有纳米尺度的 材料-蛋白质之间的相互作用。经由纳米尺度的蛋白质识别与结合，进而与细胞受体配 位，使细胞在材料表面黏附生长，引起组织再生，实现修复。因此，植入材料在纳米层 次的表面特征，包括表面成分、结构、尺度和形貌至关重要。因此，多尺度微-纳结构 材料表面设计的研究已表明能够明显地提高其生物相容性并引起极大关注，它不仅可以 提高表面改性材料的机械力学性能，同时有利于活性生物基团生长，提高生物材料或植 入体的生物相容性能。

发明内容

为了克服目前体内植入材料普遍存在的在体液环境中不稳定，机械性能差，生物相 容性不够优异而导致其医学应用受到限制的问题，本发明的目的在于，提供一种由TiO₂纳米线和非晶碳薄膜组成的多尺度微-纳米图案结构的复合功能材料，其可用作植入人 体内生物器件的生物材料或涂层，可与血液相互接触并能呈现出良好的抗凝血性能。

本发明的另一目的在于提供上述由TiO₂纳米线和非晶碳薄膜组成的多尺度微-纳米 图案结构的抗凝血复合功能材料的制备方法。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的 一种微-纳多尺度图案结构的抗凝血复合生物材料，包括：基片衬底；在该基片衬底上 生长的二氧化钛(TiO₂)纳米线阵列；以及包覆在该纳米线阵列顶端的一层非晶碳薄膜。

根据本发明实施例的抗凝血复合生物材料，所述基片衬底采用氟化导电玻璃(FTO) 基底或金属钛或钛合金；得到的TiO₂纳米线呈区域性生长，纳米线束的直径分布为 20～200纳米，材料是锐钛矿结构。

根据本发明实施例的抗凝血复合生物材料，所述TiO₂纳米线阵列组成为各种微米 级别的图案阵列结构；图案化过程是采用掩膜板图形转移的光刻技术或丝网印刷技术实 现的。

根据本发明实施例的抗凝血复合生物材料，所述图案包括条纹型，方格子型，圆点 排列型等各种图型，图案线宽或间距范围在0.1～5微米之间。

根据本发明实施例的抗凝血复合生物材料，所述非晶碳包覆在TiO₂纳米线阵列顶 端，其厚度在10-100纳米范围内。

另外，本发明还提出了一种微-纳多尺度图案结构的抗凝血复合生物材料的制备方 法，包括以下步骤：

1)采用光刻技术，将所设计的各种微米尺度规格的图案光刻掩模板图案，转移到 涂有感光胶的氟化导电玻璃(FTO)或金属钛衬底上，通过腐蚀得到与掩模板一致的图 案；

2)将上述图案化的FTO或金属钛衬底置入反应釜，采用水热合成法生长二氧化钛 的纳米线阵列，所述TiO₂纳米线阵列呈现出微米尺度的图案，所形成的TiO₂纳米线微- 纳图案与光刻掩膜板图案相似或反演；

3)在制得的微-纳米图案阵列表面包覆一层非晶碳薄膜，形成微-纳图案结构的TiO₂纳米线/非晶碳复合薄膜材料。

根据本发明实施例的抗凝血复合生物材料的制备方法，步骤1)中，所述光刻采用 正胶或负胶进行光刻。

根据本发明实施例的抗凝血复合生物材料的制备方法，步骤2)中，所述水热合成 法的工艺为：对于100ml容量的反应釜，生长温度控制在120℃～180℃，盐酸与去离子 水的体积比例配置为15/25，17/22，20/20，22/17，再加入0.2～0.7ml的分析纯试剂钛酸 丁酯(纯度为98％)。

根据本发明实施例的抗凝血复合生物材料的制备方法，步骤3)中，所述非晶碳薄 膜的厚度在10-100纳米范围内，非晶碳薄膜中sp3C-C键成份在20％～90％可调。

根据本发明实施例的抗凝血复合生物材料的制备方法，步骤3)中，非晶碳薄膜的 制备方法是采用脉冲磁过滤阴极金属真空弧镀膜方法制备，典型工艺条件为：本底真空 为10^-2～1.0×10^-4Pa，触发电压为5.5kV，频率为1～20Hz，衬底负偏压可调。

借由上述技术方案，本发明微-纳多尺度图案结构的抗凝血复合生物材料及其制备 方法具有的技术效果如下：

本发明选取微-纳米TiO₂纳米线图案结构和非晶碳薄膜复合材料体系，通过设计出 不同尺度的微-纳结构图案，并在其顶端包覆非晶碳薄膜；一方面可以改善血液接触材 料界面的表面性质，从而影响血小板粘附的因素，如亲疏水性、表面能、表面形貌、粗 糙度等；另一方面控制材料的能带结构，阻止血浆中纤维蛋白向材料转移电子，以减少 该因素最终引发的血栓，从而更加有效的提高材料的抗凝血性能。

本发明的抗凝血符合材料体系可应用于生物医用器械或植入体器件制备或表面改 性，通过微-纳米尺度和材料的设计与制备，提高生物材料的血液相容特性，改善血液 接触材料或器件的抗凝血性能。

因此，这种独特设计的多尺度微-纳图案结构的TiO₂纳米线/非晶碳薄膜复合生物材 料有望于成为抗凝血性能优异的生物材料。

附图说明

图1(a)为微米图案结构的掩模板网格图；图1(b)为微米图案结构的网格图的 反演图；图1(c)为微米图案结构的条文图；图1(d)为微米图案结构的点阵图本。

图2(a)～2(d)分别为TiO₂纳米线构成的不同微纳图案结构的典型SEM实验结 果图。

图3为TiO₂纳米线/非晶碳薄膜复合材料的结构示意图。

图4为TiO₂纳米线阵列的X射线衍射图。

图5为TiO₂纳米线/非晶碳薄膜复合材料与其他生物复合材料样品，在血液相容性 方面，对血浆纤维蛋白(FHG)吸附量的对比(吸光密度OD标定)图。

具体实施方式

请参阅图1(a)～图1(d)所示，为本发明的微米图案结构的掩模板示意图。但本 发明并不局限于此图案的设计。本发明设计了一种具有微-纳结构图案的TiO₂纳米阵列 并在纳米线顶端包覆一层非晶碳薄膜的复合材料。其材料体系成本低，制备方法简单， 所制得的复合薄膜与基体材料附着性能良好，下层TiO₂纳米线尺寸和阵列图案易控制， 上层非晶碳薄膜致密均匀，sp³C-C键成份可控，如图3所示。

本发明TiO₂纳米线/非晶碳薄膜复合材料的制备方法，包括以下工艺步骤：

1)首先，采用光刻技术，将所设计的各种微米尺度规格的图案光刻掩模板图案(如 图1所示)，转移到涂有感光胶的氟化导电玻璃(FTO)或金属钛衬底上，通过腐蚀得 到与掩模板一致的图案。

2)其次，将上述图案化的FTO或金属钛衬底置入反应釜，用水热合成法生长二氧 化钛的纳米阵列。阵列整体呈现微-纳米图案结构，表现出微相分离，其亲疏水性变化 较大，也易于非晶碳的附着。由于TiO₂纳米线只能在微米级图案区域进行选择性生长， 在没有FTO薄膜区域或被光刻胶覆盖的区域无法生长TiO₂纳米线。因此，TiO₂纳米线 阵列呈现出微米尺度的图案，所形成的TiO₂纳米线微-纳图案与光刻掩膜板图案相似或 反演(如图2所示)，这取决于采用的正胶还是负胶进行光刻。

其中，图2(b)是与图1(a)掩模板相对应的图。

TiO₂纳米阵列的制备方法是采用水热合成技术，其典型的制备条件为：对于100ml 容量的反应釜，生长温度控制在120℃～180℃，盐酸与去离子水的体积比例分别配置为 15/25，17/22，20/20，22/17，再加入0.2～0.7ml的分析纯试剂钛酸丁酯(纯度为98％)。

3)然后在制得的微-纳米图案阵列表面包覆一层非晶碳薄膜，其厚度在10-100纳米 范围内；分别改变靶材负偏压或者脉冲频率等工艺参数，制得不同sp³C-C键含量的纳 米级厚度的非晶碳薄膜，非晶碳薄膜中sp3C-C键成份在20％～90％可调，形成微-纳图 案结构的TiO₂纳米线/非晶碳复合薄膜材料。

非晶碳薄膜的制备方法是采用脉冲磁过滤阴极弧沉积技术，典型工艺条件为：本底 真空为10^-2～1.0×10^-4Pa，触发电压为5.5kV，频率为1～20Hz，衬底负偏压可调。

4)最后，对各种规格的微-纳图案结构TiO₂纳米线/非晶碳复合薄膜材料的表面形 貌、亲疏水特性、白蛋白/纤维蛋白选择吸附、血小板黏附进行表征，研究微-纳米图案 结构和尺度、非晶碳薄膜厚度和sp3成份对血液相容性的影响，从而研究凝血或抗凝血 机理。

通过上述工艺步骤制备的TiO₂纳米线和非晶碳薄膜复合微-纳米图案结构材料，用 于血液接触材料或植入体器件的表面改性，通过改变图案的微米、纳米尺度和非晶碳薄 膜厚度，调节并控制微-纳米图案结构的表面形貌、亲疏水性、电子转移特性等性质， 用于改善复合材料的血液相容性。

以下通过较佳实施例对本发明的TiO₂纳米线/非晶碳薄膜复合材料及其制备方法作 进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。

实施例1

利用光刻技术制备微纳米尺度图案

通过制定一套图案规格的掩模板(图1(a)～图1(d)所示)，如：直径和间距都 是1微米的点阵图、线宽：间距为1∶1.5微米的平行线阵列图、0.5微米×1微米点阵图， 或它们的反演图。将掩模板的图案通过常规光刻技术或丝网印刷技术转移制备在氟化导 电玻璃(FTO)上，最后得到与掩模板对应图案的氟化导电玻璃FTO衬底图案。

实施例2

水热合成法制备TiO₂纳米线阵列微-纳图案结构

在微米级图案结构的氟化导电玻璃或钛金属衬底上，采用水热合成方法，在图案区 域选择性合成TiO₂纳米阵列。通过改变反应溶液的浓度、反应温度、生长时间，制备 出不同直径、不同纳米线密度的TiO₂纳米阵列，典型工艺为：钛酸丁酯0.5ml(纯度98％)、 反应时间0.5小时、反应温度150℃、盐酸：去离子水的体积比例分别为15/25、18/23、 20/20、23/18。

实施例3

脉冲磁过滤阴极金属真空弧制备非晶碳薄膜

采用脉冲磁过滤阴极弧在TiO₂纳米线阵列微-纳图案结构的样品表面，更确切地说， 是在纳米线阵列顶端包覆一层致密的非晶碳薄膜，薄膜厚度在20～200纳米之间，厚度 的选择取决于纳米线阵列的粗细和密度，保证非晶碳薄膜能全覆盖纳米线顶端并维持纳 米线阵列顶端平面的表面形貌基本不变。阴极靶材是直径为10mm，纯度为99.99％的石 墨，衬底距弧源的距离为16cm，真空室的工作气压为9.0×10^-5Pa，沉积过程中触发电压 为5.5keV，靶材负偏压为100V，通过调节频率，制备sp²/sp³成分在20％-90％范围内的 非晶碳薄膜。

实施例4

微-纳图案结构TiO₂纳米线阵列/非晶碳复合薄膜材料的微结构和血液相容性

X射线衍射(XRD)结果表明(图4所示)，TiO₂纳米阵列为锐钛矿结构。通过热 场发射环境扫描电镜(SEM)、接触角测试分析，对微-纳米图案化结构的复合材料表面形 貌、亲疏水性进行研究，结果表明：总体呈现出疏水性，表面能小，且表面形貌、亲疏 水性与微米级图案、TiO₂纳米线尺寸和密度有密切的关系。采用拉曼光谱对非晶碳薄膜 中sp³C-C的成分百分含量进行标度。

实施例5

对于上述实施例所描述的一系列图案化TiO₂纳米阵列/非晶碳复合薄膜样品进行血 液相容性测试。包括血小板黏附实验、本实施案例首先进行血小板粘附实验，以观察其 粘附数量以及形变情况，评判材料的血液相容性。其实验过程如下：

1)采血

健康雄兔颈部伤口，分离颈动脉，阻断血流。切开颈动脉，在近端插入预涂聚氨酯 的2mm胶管，开放血流，舍弃最早流出1ml血流，然后将流出的兔血收集在装有3ml 3.2％ 枸橼酸钠的烧杯中，轻轻摇匀，至总容积60ml为止，再流入另一只装有枸橼酸钠的烧 杯，保持兔血/枸橼酸钠体积比为9∶1。

2)制备血小板悬浮液

将抗凝兔血分别装入离心试管，在1000转/分下离心20分钟，分离上层黄色血浆， 即为富血小板血浆(Platelet-rich plasma——PRP)；将PRP再装入离心管，在3000转/ 分下离心20分钟，此上清血浆为贫血小板血浆(Platelet-poor plasma——PPP)；

此时送0.5ml PPP去血小板计数，留0.5ml PPP备用，其余PPP经过0.4μm漏斗过 滤，得无血小板血浆(PFP)，将计量好体积的PPP与PFP配制成2000个/μl浓度的稀 释血小板悬浮液。

3)血小板粘附

圆柱形内腔(内径10mm，容积12ml)的有机玻璃容器，每个底部分别贴上1个待 试样品或者对照样品，对照样品一般选玻璃和聚氨酯(或硅橡胶)；

同时加入1.2ml血小板悬浮液，塞盖，保证没有气泡和不泄漏，所有样品先表面朝 上，以3500转/分离心1分钟后自然停止。

4)试样处理

将容器从离心机取出，用PBS溶液(或者台式缓冲液Tys)清洗3次，操作方式为 倾斜容器，让吸管接触器壁，让溶液慢慢顺壁而下，切莫让液柱直接冲刷样品表面(下 面各步与此相同)；用镊子小心将上述试样从有机玻璃容器取出，转移至5ml小瓶内(西 林瓶)，注意吸附面朝上，放入2.0％戊二醛1ml固定；

此后在电镜室操作，系列乙醇脱水，临界点干燥(或者冷冻干燥)，镀金。

5)扫描电镜观察

在扫描电镜下，每个样品随机取6～10个不同的低倍视野下(×500)拍照，作日后 计算粘附血小板的数目，取平均值，同时在2～3个高倍视野(×2000～×3000)拍照， 用作日后分析血小板的形状。

实施例6

对上述材料进行人纤维蛋白(FHG)的吸附性实验，从而评价材料的生物相容性。其 实验过程如下：

1)用PBS溶液配备3ml/ml的人纤维蛋白原溶液；

2)把面积相等(7mm*7mm)的样品放进酶标板孔中，每孔加入200uL人纤维蛋白 原溶液中，在37℃孵化箱孵育2h，开启摇床装置；

3)用PBS溶液洗涤3遍，每次3min，在室温下干燥；

4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗人纤维蛋白原溶液融入PBST溶液中，得到抗体 溶液；

5)将样品转移到新酶标板测试孔中，每孔加入200uL抗体溶液，37℃下孵育样1h.；

6)用PBST将样品洗涤3次，每次3min，在室温下干燥；

7)将样品转移到新酶标板测试孔中，每孔加入100uL TMB工作液，在37℃下避 光反应10min；

8)在各孔中加入50uL 0.2M的硫酸后溶液终止反应；

9)把样品从酶标孔夹出，用酶标仪测定溶液在450nm下的吸光度(OD)值。通过 标准曲线，计算样品表面吸附纤维蛋白原的数量。

通过研究TiO₂纳米阵列、无图案化TiO₂纳米阵列、图案化TiO₂纳米阵列/非晶碳复 合薄膜及其微-纳米尺度差异对材料血液相容性的影响，寻找最佳的微-纳图案及其制备 工艺，以寻求获得血液相容性优异的图案化TiO₂纳米阵列/非晶碳复合薄膜样品。

另外，请参阅图5所示，为本发明的TiO₂纳米线/非晶碳薄膜复合材料与其他生物 复合材料样品，在血液相容性方面，对血浆纤维蛋白(FHG)吸附量的对比(吸光密度OD 标定)图。图中。横坐标对应的依次是：TiO₂纳米线样品(TiO₂)、TiO₂纳米线/非晶 碳薄膜(TiO₂/C_1-3)和FTO/C₃复合材料样品。图5为TiO₂纳米线样品，非晶碳薄膜样 品，以及镀碳工艺条件为60V，100V，150V负偏压下TiO₂纳米线/非晶碳薄膜(C_1-3)的复 合材料样品，对血浆纤维蛋白(FHG)吸附量的对比(吸光密度OD标定)图。结果表明 在负偏压为100V工艺参数下，TiO₂纳米线/非晶碳薄膜复合材料吸附的纤维蛋白最少， 体现出最好的血液相容性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故 凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单 修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。