一种手性选择性磁性功能化石墨烯修饰微流控芯片的方法

技术领域

本发明涉及微全分析技术，提供了一种在PDMS微芯片通道表面快速可控地固定GO/Fe₃O₄/BSA复合材料的方法，属于微流控芯片技术领域。

背景技术

目前，人类用于治疗各种疾病的化学药物多为低于50个原子的有机小分子，其中大部分具有一到两个手性中心，它们的药理作用是通过与体内大分子之间的严格手性匹配和分子识别来实现的。大量研究表明，含有手性中心的药物，其药物活性与分子的立体构型密切相关。往往一种立体异构体有药效，而其镜像分子的药效却很小，甚至完全没有药效或具有相反的药效（毒副作用）。因此，手性化合物的快速有效分离对保证人类健康具有重要意义。

色谱法和毛细管电泳法是手性分离分析如消旋化合物制备及拆分、对映体纯度测定、对映体和生物大分子的相互作用研究、手性药物代谢产物测定等的常用方法。色谱法包括气相色谱、高效液相色谱和超临界流体色谱等，其中气相色谱和高效液相色谱拆分效率高、重现性好，可以实现定性、定量分析和少量制备，使用广泛，但二者均受到手性固定相的限制，分析时间长、柱子价格昂贵，样品和试剂消耗量大，成本较高，此外，气相色谱还存在消旋化等问题（林炳承，秦建华，微流控芯片实验室[M]. 科学出版社，2006.）。与色谱法相比，毛细管电泳法因具有快速、低耗、应用范围广等特点，而成为手性分离分析的一个活跃技术领域。微流控芯片电泳是微型化的毛细管电泳技术，不仅囊括了毛细管电泳的基本功能，而且其尺寸更小、试剂消耗量更少、分析速度更快、易实现多通道平行分析以及能和其它操作单元整合，特别适合于生物样品的微量分析及功能研究，成为手性分离分析、甚至不对称合成反应的理想平台。利用电泳技术进行手性分离的方式通常有两种：一种是在运行缓冲液内加入手性选择剂，另一种是将手性选择剂固定在通道内壁。通过对映体与手性选择剂之间形成电泳淌度不同的复合物而实现分离。前者虽然是一种简单快速的分离方式，但是由于这种方法会产生较强的背景干扰，使得其应用受到一定限制；而对于后者，由于手性选择剂被固定于通道内壁上，避免了以上所涉及到的问题，但是其操作过程却较为费时耗力。因此，选择一种合适的手性选择剂，并将其通过一种简单灵活的方法固定在通道内表面吸引了越来越多研究者的关注。目前，有多篇综述详尽地总结了传统毛细管电泳所使用的手性选择剂（Wan H, Blomberg L G. Journal of Chromatography A, 2000, 875(1-2): 43~88. Amini A. Electrophoresis, 2001, 22(15): 3107~3130），最常用的有环糊精及其衍生物、冠醚、蛋白质、大分子抗生素、杯环芳烃和金属离子配合物等。在众多的手性选择剂中，BSA等蛋白质分子成为芯片电泳手性分离中常用的手性选择剂（Haginaka J. Journal of Chromatography A, 2000, 875(1-2): 235~254）。Weng等（Weng X X, Bi H Y, Liu B H, et al. Electrophoresis, 2006, 27(15): 3129~3135）制备了碳纳米管-BSA的复合材料，将其固定于PMMA芯片微通道内，成功地实现了色氨酸对映体的手性分离。随后，Li等（Li H F, Zeng H L, Chen Z F, et al. Electrophoresis, 2009, 30(6): 1022~1029）将Au NPs-BSA复合材料作为固定相修饰于玻璃芯片微通道内，对麻黄素和伪麻黄素对映体进行了手性分离，并获得了良好的分离度和分离效率。作为生物分子，只有保持其良好的生物活性才能发挥其作用，而且，生物分子的生物活性与负载材料的亲水性成正相关（Hao C, Ding L, Zhang X J, et al. Analytical Chemistry, 2007 (79): 4442）。然而，常用的芯片材料PDMS表面却具有较强的疏水性，不利于实现生物分子的高效负载和生物活性的保持。作为碳材料中的“明星材料”，石墨烯是一种单层碳原子面的二维晶体，具有高电导率（10³-10⁴ S/m）、大比表面积（2600 m²/g），表面富含亲水基（—OH，—COOH，—C=O等），具有良好的生物相容性。石墨烯独特的亲水性、生物相容性及其超高的比表面积，不仅可大大提高BSA的负载量，还将很好地保持其生物活性，同时，也为其他生物分子的高效固定提供了良好的反应平台。

本发明采用一种简单、有效的一步原位合成法制备了GO/Fe₃O₄复合材料。利用BSA与GO之间的π-π键合、氢键以及疏水等作用实现BSA在GO/Fe₃O₄复合材料表面的高效固定。由于合成的复合材料（GO/Fe₃O₄/BSA）具有良好的磁性性能，仅仅通过施加一个外加磁场即可简单方便地实现GO/Fe₃O₄/BSA复合材料在PDMS微芯片通道内的高效可控固定，获得GO/Fe₃O₄/BSA修饰的PDMS芯片微通道。该发明制备的GO/Fe₃O₄复合材料，一方面具有良好的磁性能，可实现GO/Fe₃O₄/BSA磁性复合纳米材料在PDMS芯片微通道内的可控组装等操作，大大节约了修饰时间，而且还提高了芯片的重复利用率；另一方面，该材料所具有的良好的生物相容性和亲水性，有利于保持固定化生物分子的生物活性，实现手性氨基酸的灵敏性快速分离。

发明内容

本发明的目的在于提供一种手性选择性磁性功能化石墨烯修饰微流控芯片的方法。测试结果表明，经GO/Fe₃O₄/BSA复合材料修饰的PDMS芯片微通道亲水性强、生物相容性和稳定性好，成功实现了手性氨基酸分子的高效分离。

为实现所述的在PDMS芯片微通道内修饰GO/Fe₃O₄/BSA复合材料，本发明采用以下技术方案：

一种基于磁性功能化石墨烯材料的具有手性选择功能的PDMS芯片微通道的修饰方法，步骤方法如下：

（1）采用改进的Hummers方法（Hummers W S, Offeman R E. Journal of the American Chemical Society, 1958, 80(6): 1339~1339. Cote L J, Kim F, Huang J. Journal of the American Chemical Society, 2009, 131(3): 1043~1049. Shin H J, Kim K K, Benayad A, et al. Advanced Functional Materials, 2009, 19(12): 1987~1992）制备氧化石墨烯（GO）：将0.5 g 石墨粉和0.5 g NaNO₃ 加入到23 mL 18 mol/L的浓H₂SO₄ 中，冰浴条件下，缓慢加入3 g KMnO₄，充分搅拌使其混合均匀后，把溶液转移到35 ± 5 °C 的水浴中搅拌一个小时，形成灰褐色糊状物，加入40 mL 水，室温下搅拌30 min，再加水稀释至140 mL，最后，逐滴加入3 mL 30 %的H₂O₂，溶液从深棕色变成亮黄色，将得到的产物趁热过滤，用二次蒸馏水离心清洗产物至上层清液为中性，在12000 r/min的转速下离心2 min，得到GO，再将其搅拌分散于二次蒸馏水中，在8000 r/min下离心2 min分钟除去较大的GO块和溶在水中的一些副产物，将得到的产物分散至二次水中，超声处理2小时，即得到单层的GO分散溶液；

（2）Fe₃O₄ NPs功能化GO（GO/Fe₃O₄）的制备：将40 mg GO 溶解到20 mL二次蒸馏水中，超声30 min；待GO 完全溶解后，加热至50 °C，并通入N₂除去O₂；然后向该溶液中加入216 mg FeCl₃·6H₂O 和80 mg FeCl₂·4H₂O，超声20 min，在搅拌条件下逐滴加入1.0 mL NH₃·H₂O后剧烈搅拌40 min，反应完毕后，冷却至室温，将产物用磁铁分离，并用二次蒸馏水清洗数次；

（3）GO/Fe₃O₄/BSA复合材料的制备：将4 mg·mL^-1 的GO/Fe₃O₄和900 mg·mL^-1的BSA加入到4 mL 0.5×TBE（Tris，44.5 mM；boric acid，44.5 mM；EDTA，1 mM；pH 8.0）缓冲溶液中，常温下反应24小时（ Liu J, Fu S, Yuan B, Li Y, et al. Journal of the American Chemical Society，2010, 132(21): 7279~7281）。反应完毕后，产物用磁铁分离并用二次蒸馏水清洗数次，将所得产物（GO/Fe₃O₄/BSA）分散于4 mL二次蒸馏水中，4 °C储存备用；

（4）GO/Fe₃O₄/BSA复合材料在PDMS微通道表面的修饰：先将PDMS通道用二次蒸馏水冲洗10 min；然后在芯片的上下方各放置一块永久磁铁（相吸引的两极彼此相对），用真空泵将制备的2 mg·mL^-1 GO/Fe₃O₄/BSA复合材料连续抽入分离管道中5 min，在外磁场作用下，GO/Fe₃O₄/BSA复合材料被迅速可控地固定于PDMS通道内，将修饰后的芯片在冰箱中放置1小时；用缓冲溶液连续冲洗通道5分钟，将分离通道内的残留物洗掉，即获得GO/Fe₃O₄/BSA复合材料修饰的PDMS芯片微通道。

步骤（2）中，所用GO、FeCl₂·4H₂O和FeCl₃·6H₂O的质量分别为40 mg、80 mg和216 mg，即GO:FeCl₂·4H₂O:FeCl₃·6H₂O的质量比为1:2:5.4。

步骤（2）中，所述的在FeCl₂·4H₂O和FeCl₃·6H₂O加入到GO溶液前，必须先通入N₂ 除去GO溶液中的O₂，防止生成的Fe₃O₄ NPs部分氧化为Fe₂O₃ NPs。

步骤（2）中，所述的整个反应过程都需要不停地搅拌。

步骤（2）中，所述的反应温度为50 °C。

步骤（2）中，所述的加入NH₃·H₂O的体积为1.0 mL。

步骤（2）中，所述的当加入1.0 mL NH₃·H₂O后，继续反应的时间为40 min。

步骤（2）中，所述的Fe₃O₄ NPs的粒径为8 nm。

步骤（3）中，所用GO/Fe₃O₄复合材料和BSA的浓度分别为4 mg·mL^-1和900 mg·mL^-1，即GO/Fe₃O₄:BSA的质量浓度比为1:225。

步骤（4）中，所用GO/Fe₃O₄/BSA的质量浓度为2 mg·mL^-1。

步骤（4）中，为更好地将GO/Fe₃O₄/BSA复合材料修饰于PDMS微芯片通道表面，在将该复合材料连续抽入分离管道中5 min后，须将修饰后的芯片在冰箱中静置1小时后使用。

本发明的优点是：该发明制备的GO/Fe₃O₄复合材料，一方面具有良好的磁性能，仅仅在施加一个外加磁场的作用下，即可实现GO/Fe₃O₄/BSA磁性复合纳米材料在PDMS芯片微通道内的可控组装等操作，与现有的技术相比，本发明操作简单可控，大大节约了修饰时间，而且，还有效提高了芯片的重复利用率，整个过程不需要有机溶剂和有毒试剂，具有绿色环保、成本低廉、高效等优点；另一方面，该材料的生物相容性和亲水性好，有利于生物分子在PDMS微通道内的高效固定化和生物分子活性的保持，可实现手性氨基酸的灵敏性快速分离，有望应用于生物医药、生物分子的检测和生物诊断等其它领域。

附图说明

图1是本发明涉及的PDMS微流控芯片结构示意图：（1）样品池，（2）缓冲溶液池，（3）样品废液池。

图2是材料的扫描电镜图：（A）GO和（B）GO/Fe₃O₄纳米复合材料。内插图为GO/Fe₃O₄复合材料在无（1）和有（2）外加磁场条件下的照片。

图3是GO/Fe₃O₄纳米复合材料的XRD表征。

图4是（a）GO，（b）Fe₃O₄，（c）BSA，（d）GO/Fe₃O₄ 复合材料和（e）GO/Fe₃O₄/BSA 复合材料的紫外可见吸收光谱表征。

图5是（a）裸芯片，（b）GO/Fe₃O₄和（c）GO/Fe₃O₄/BSA 复合材料的接触角表征。

图6是（a）裸芯片和（b）GO/Fe₃O₄/BSA复合材料修饰的PDMS芯片在不同pH的运行缓冲溶液中电渗流变化情况。

图7是（a）裸PDMS，（b）GO/Fe₃O₄，（c）GO/Fe₃O₄/PDDA/Au NPs/BSA，（d）GO/Fe₃O₄/PDA/BSA，（e）GO/Fe₃O₄/PDA/Au NPs/BSA 和（f）GO/Fe₃O₄/BSA复合材料修饰的PDMS芯片对手性分子色氨酸的电泳分离图谱。运行缓冲溶液：20 mM（pH 7.17）PBS；分离电压：+1200 V；进样电压：+800 V；进样时间：5 s；检测电极：碳纤维电极；检测电位：0.6 V（vs. Ag/AgCl）。

图 8是不同分离电压对D，L-色氨酸电泳分离检测影响的考察。

图 9是不同缓冲液浓度对D，L-色氨酸电泳分离检测影响的考察。

图 10是不同缓冲液pH对D，L-色氨酸电泳分离检测影响的考察。

具体实施方案

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。

实施例1

PDMS芯片的制作：以GaAs阳模（南京第55电子研究所制作）为模板，制作典型的十字型PDMS微流控芯片通道，如图1所示。具体制作过程如下：取一定量的PDMS单体和固化剂按10:1（质量比）混合均匀、除气，倾注于GaAs模板上，在 70 oC下固化2小时。待冷却后从模板上剥下含十字型通道的PDMS芯片，用刀片切割成所需形状，并用打孔器在缓冲液池、样品池和样品废液池等三处打孔，形成直径为3 mm的孔。同时，以平滑玻璃板为模板，按照同样步骤制备不含微通道的PDMS芯片为盖片。将含十字通道的PDMS芯片和不含通道的PDMS盖片分别用二次水、甲醇、二次水超声清洗10分钟，在红外灯下烘干，随即将两片PDMS封合，形成一块可逆的PDMS芯片。PDMS分离通道长42 mm（有效分离长度37 mm），进样通道长10 mm。所制得的PDMS分离通道呈梯形，上底宽50 μm，下底宽65 μm，深18 μm。

实施例2

（1）采用改进的Hummers方法（Hummers W S, Offeman R E. Journal of the American Chemical Society, 1958, 80(6): 1339~1339. Cote L J, Kim F, Huang J. Journal of the American Chemical Society, 2009, 131(3): 1043~1049. Shin H J, Kim K K, Benayad A, et al. Advanced Functional Materials, 2009, 19(12): 1987~1992）制备GO：将0.5 g 石墨粉和0.5 g NaNO₃ 加入到23 mL 18 mol/L的浓H₂SO₄ 中，冰浴条件下，缓慢加入3 g KMnO₄，充分搅拌使其混合均匀后，把溶液转移到35 ± 5 °C 的水浴中搅拌一个小时，形成灰褐色糊状物。加入40 mL 水，室温下搅拌30 min，再加水稀释至140 mL。逐滴加入3 mL 30 %的H₂O₂，溶液从深棕色变成亮黄色。将得到的产物趁热过滤，用二次蒸馏水离心清洗产物至上层清液为中性，在12000 r/min的转速下离心2 min，得到GO，再将其通过搅拌分散于二次蒸馏水中，在8000 r/min下离心2 min除去较大的GO块和溶在水中的一些副产物。将得到的产物分散至二次水中，超声处理2小时，即得到单层的GO分散溶液。

（2）Fe₃O₄ NPs功能化GO（GO/Fe₃O₄）的制备：将40 mg GO 溶解到20 mL二次蒸馏水中，超声30 min；待GO 完全溶解后，加热至50 °C，通入N₂除去O₂；然后加入216 mg FeCl₃·6H₂O 和80 mg FeCl₂·4H₂O，超声20 min，在搅拌的条件下逐滴加入1.0 mL NH₃·H₂O后剧烈搅拌40 min，反应完毕后，冷却至室温，将产物用磁铁分离，并用二次蒸馏水清洗数次。

（3）GO/Fe₃O₄/BSA复合材料的制备：将4 mg·mL^-1 的GO/Fe₃O₄和900 mg·mL^-1的BSA加入到4 mL 0.5×TBE（Tris，44.5 mM；boric acid，44.5 mM；EDTA，1 mM；pH 8.0）缓冲溶液中，常温下反应24小时（ Liu J, Fu S, Yuan B, Li Y, et al. Journal of the American Chemical Society 2010, 132(21): 7279~7281）。反应完毕后，产物用磁铁分离并用二次蒸馏水清洗数次，将所得产物（GO/Fe₃O₄/BSA）分散于4 mL二次蒸馏水中，4 °C储存备用。

所制得GO和GO/Fe₃O₄纳米复合材料的扫描电镜如图2所示。照片见图2B，与GO的扫描电镜形貌（图2A）相比，负载了Fe₃O₄ NPs后的GO表面有大量粒径均匀的纳米粒子，平均粒径为8 nm，且未见明显的团聚现象。从图2B内插图中可以看出，GO/Fe₃O₄的悬浮液分散均匀且呈黑色（内插图1），当在该悬浮液附近施加一个外磁场时，GO/Fe₃O₄复合材料迅速朝向磁铁方向移动，在磁铁附近形成一个棕黑色的GO/Fe₃O₄斑点，而剩下的溶液则澄清透明（内插图2）。以上实验结果表明该GO/Fe₃O₄复合材料具有很好的水溶性，而且负载于GO表面的Fe₃O₄纳米粒子仍然保持了良好的磁性能，这使得仅仅在外磁场作用下就可以很好地实现GO/Fe₃O₄复合材料在PDMS芯片微通道表面的固定化。

采用XRD对负载于GO表面的Fe₃O₄纳米粒子的晶型进行表征，图3为GO/Fe₃O₄复合材料的XRD图谱。由GO/Fe₃O₄材料的XRD图可见，在2θ=30.2°，35.5°，43.2 °，53.6 °，57.08 ° 和62.9 °处出现了Fe₃O₄ NPs的衍射峰，这与文献报道的磁铁矿的立方尖晶石晶体结构的标准XRD 数据中（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面相一致（JCPDS file No. 19-0629），进一步表明Fe₃O₄ NPs已被成功负载到GO的表面。本发明合成GO/ Fe₃O₄复合材料的目的是为了更好地负载生物分子BSA，进而通过外加磁场将其固定到PDMS芯片微通道内，构建具有手性选择功能的芯片微通道。

为了进一步证实BSA已被成功负载于GO/Fe₃O₄复合材料表面，我们对合成的GO，Fe₃O₄，BSA，GO/Fe₃O₄和GO/Fe₃O₄/BSA等材料进行了紫外光谱表征，结果如图4所示。由图4中的曲线a-e的光谱图比较可见，GO/Fe₃O₄/BSA复合材料在216 nm和270 nm处出现了BSA的特征吸收峰，如曲线e所示，说明BSA已被成功负载到了GO/Fe₃O₄复合材料表面，并很好地保持了固定化BSA的生物活性。当BSA负载到GO/Fe₃O₄复合材料表面后，其紫外特征吸收峰与纯BSA在216 nm和279 nm处的特征吸收（曲线e）相比，稍微发生了蓝移，这可能是由于BSA与GO之间发生了π-π相互作用所引起的。此外，在GO/Fe₃O₄/BSA复合材料的紫外可见吸收光谱图上并未出现GO的特征吸收峰（230 nm），这可能主要由于GO表面负载了大量纳米粒子和生物分子BSA，极大地覆盖了GO表面，使得GO的紫外吸收无法显现出来所致。

实施例3

GO/Fe₃O₄/BSA复合材料在PDMS微通道表面的修饰过程

（1）单纯PDMS微流控芯片的制作过程参照实施例1的步骤。

（2）GO/Fe₃O₄/BSA复合材料在PDMS微通道表面的修饰过程：首先，PDMS通道用二次蒸馏水冲洗10 min；在芯片的上下方各放置一块永久磁铁（相吸引的两极彼此相对），用真空泵将制备的2 mg·mL^-1 GO/Fe₃O₄/BSA复合材料连续抽入分离管道中5 min，在外加磁场的作用下，GO/Fe₃O₄/BSA复合材料被迅速可控地固定于PDMS通道内，将修饰后的芯片在冰箱中放置1个小时；用缓冲溶液连续冲洗通道5 min，将分离通道内的残留物洗掉，即获得GO/Fe₃O₄/BSA 复合材料修饰的PDMS芯片微通道。

PDMS芯片表面经本发明描述的方法处理，可获得亲水性的GO/Fe₃O₄/BSA复合材料修饰层，使PDMS芯片的接触角从未经修饰的PDMS芯片的111°（图5a）降低到经GO/Fe₃O₄/BSA修饰后的26°（图5c），可见，经GO/Fe₃O₄/BSA修饰的PDMS芯片表面的亲水性得到了极为显著的改善，有利于有效抑制分析物在通道表面的非特异性吸附。这主要是由于通过本发明合成的GO/Fe₃O₄复合材料具有良好的亲水性，在GO/Fe₃O₄复合材料修饰的芯片上接触角仅仅为16°（图5b）。此外，负载了生物分子BSA后的GO/Fe₃O₄/BSA复合材料修饰的PDMS芯片表面的接触角比GO/Fe₃O₄复合材料修饰的PDMS芯片表面的接触角高10°，这主要归因于BSA表面含有的疏水基团，使得接触角增大，疏水性比GO/Fe₃O₄稍有增强所致。但与裸芯片的111°相比，经GO/Fe₃O₄/BSA修饰的PDMS芯片的亲水性非常理想。

PDMS芯片表面经本发明描述的方法处理，还可获得稳定的降低的电渗流，由图6可见，电渗流在pH 7.17时，由未经修饰时的2.59×10^?4 cm² V^?1s^?1降低到经GO/Fe₃O₄/BSA修饰后的2.32×10^?4 cm² V^?1 s^?1，且修饰后的PDMS芯片的电渗流的稳定性也得到了极大提高。说明通过本发明的修饰技术，在PDMS芯片上获得了稳定的降低的电渗流。

实施例4

GO/Fe₃O₄/BSA 复合材料修饰PDMS微流控芯片的应用

（1）微流控芯片的一个重要应用是进行分析物的分离，图7分别为未经修饰的PDMS，以及经GO/Fe₃O₄，GO/Fe₃O₄/PDDA/AuNPs/BSA，GO/Fe₃O₄/PDA/BSA，GO/Fe₃O₄/PDA/Au NPs/BSA 和GO/Fe₃O₄/BSA复合材料修饰PDMS芯片对D/L-色氨酸的电泳分离图。由图可见，在（a）裸PDMS和（b）GO/Fe₃O₄修饰芯片上，D/L-色氨酸根本无法达到基线分离，并且相对于裸芯片，GO/Fe₃O₄修饰的芯片上峰电流较低，非特异性吸附严重，这可能是由于GO与氨基酸之间的相互作用所致。当通过不同方法将BSA负载在预先合成的GO/Fe₃O₄复合材料表面并固定在PDMS芯片微通道内时，由图7中曲线c-f可见，在GO/Fe₃O₄/BSA修饰的PDMS芯片上，D/L-色氨酸的分离效果得到显著改善，在短短的80秒内即获得了良好的基线分离（曲线f），不仅峰电流大大提高了，分离度和分离效率也得到了极大提高，同时分析物的非特异性吸附也得到了有效抑制。测试结果表明，本发明提供的经GO/Fe₃O₄/BSA复合材料表面修饰的PDMS芯片微通道在氨基酸手性分子电泳分离中具有良好的实际应用价值。

（2）分离电压，缓冲液浓度和pH对电泳分离的影响

图 8考察了不同分离电压（900 V-1300 V）对电泳分离检测的影响。随着分离电压的增大，D/L-色氨酸的峰电流逐渐增大，出峰时间逐渐缩短，峰型变得尖锐且对称，但当分离电压超过1200 V后，D/L-色氨酸的分离效率下降，无法达到基线分离，且噪音也增大，综合考虑，本发明选择1200 V作为分离电压。

图 9考察了运行缓冲液浓度对D/L-色氨酸分离的影响。通常，增大运行缓冲液的浓度会使双电层变薄、zeta电势和EOF下降，导致物质的迁移时间延长。在经GO/Fe₃O₄/BSA复合材料修饰的PDMS芯片上，当运行缓冲液浓度从10 mM增加到25 mM时，EOF呈下降趋势，D/L-色氨酸在芯片通道内的迁移时间延长，分离度显著增加。而当浓度超过20 mM后，D/L-色氨酸的峰型变宽，电流减小，分离效率降低。因此，测试过程中选用20 mM的PBS作为运行缓冲液。

图10考察了在pH 6.64-8.04范围内，运行缓冲液pH对D/L-色氨酸的分离效率和电化学响应的影响。当pH由6.64增加到8.04时，D/L-色氨酸的迁移时间逐渐缩短，分离度逐渐增大。在pH 7.17 的PBS缓冲液中，D/L-色氨酸达到良好的基线分离，分离度为1.35。为了更好地保持修饰层BSA的生物活性以及分析物的稳定结构，测试过程选用pH 7.17的PBS作为运行缓冲液。