针对甲状腺刺激激素受体的抗体的生物测定法、所述抗体的测量试剂盒、以及用于所述生物测定法或测量试剂盒中的新的遗传修饰的细胞

技术领域

本发明涉及表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞、包含所述细胞的组合物、所述组合物用于诊断甲状腺疾病的应用和使用所述组合物诊断甲状腺疾病的方法等。

背景技术

由垂体生成的甲状腺刺激激素(TSH)会结合存在于甲状腺中的甲状腺刺激激素受体(TSHR)，以促进甲状腺激素的分泌。由于甲状腺激素是增强全身代谢的激素，该激素的作用的异常增加或异常减少会不同地影响身智，造成甲状腺疾病。例如，关于格雷夫氏病，在体内生成甲状腺刺激抗体(TSAb)，且该抗体（而不是TSH）会过度刺激TSHR，使得甲状腺的功能被增强，并出现诸如甲状腺增大、眼球突出和心动过速等征状。另一方面，在甲状腺功能减退中，存在一些疾病，其中生成甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)，使得甲状腺的功能被降低，并出现诸如体重增加、抑郁和四肢无力等征状。

迄今为止，血液中含有的这些自身抗体(TSAb和TSBAb)的测定，已经被用于诊断格雷夫氏病和甲状腺功能减退。

已经报道了用于测量自身抗体的方法的代表性实例如下：

使用放射性同位素-标记的TSH或抗TSHR的单克隆抗体的放射受体测定法(TBII方法)，其中所述放射性同位素-标记的TSH或所述抗TSHR的单克隆抗体竞争性地抑制患者血清中的自身抗体对TSHR的结合，使得结合的自身抗体的量可以被测量；和

用于测量TSAb的量的生物测定法(TSAb方法)，其中用结合TSHR的抗体处理猪甲状腺细胞等，并通过使用放射性同位素-标记的cAMP测量甲状腺细胞中cAMP浓度的增加，测定TSAb的量(非专利文献1和2)。

非专利文献 1: Methods in Enzymology, 74, 405-420 (1981)

非专利文献 2: J Clin Endocrinol Metab. 1986 May; 62 (5): 855-62。

发明内容

要解决的技术问题

本发明的一个目的是，提供用于测量TSAb和/或TSBAb的组合物和用于诊断甲状腺疾病的组合物等，它们可以比常规方法更方便地操作，不需要使用要求特殊技术或装置的放射性同位素。此外，本发明的另一个目的是，提供使用所述组合物诊断甲状腺疾病的方法等。

问题的解决方案

发明人使用钙敏感蛋白来测量进入被cAMP刺激的细胞中的钙离子的量，所述cAMP由甲状腺刺激抗体(TSAb)与甲状腺刺激激素受体(TSHR)的结合形成。结果，发明人不使用放射性同位素，已经成功地测量了TSAb的量。此外，发明人还已经使用类似的原则，成功地测量了甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的量，从而完成了本发明。

具体地，本发明涉及表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞、和包含所述细胞的组合物和试剂盒。

此外，本发明涉及用于测量生物样品中甲状腺刺激抗体的量和/或甲状腺刺激阻断抗体的量的组合物和试剂盒，用于诊断甲状腺疾病的组合物和试剂盒，用于测定具有发生甲状腺疾病的高度危险的人的组合物和试剂盒，或用于测定对在甲状腺疾病治疗下的人的治疗效果的组合物和试剂盒，其包含表达TSHR、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞。

此外，本发明涉及用于诊断甲状腺疾病的方法，用于测定具有发生甲状腺疾病的高度危险的人的方法，或用于测定甲状腺疾病治疗的有效性的方法，所述方法包括下述的步骤(1)、(2)和(3)或(1')、(2)和(3)：

(1) 制备混合物，所述混合物含有表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞、钙敏感蛋白的发光底物、不含有Ca²⁺的培养基或不含有Ca²⁺/Mg²⁺的培养基、TSH和源自实验受试者血液的样品；或

(1') 制备混合物，所述混合物含有表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞、钙敏感蛋白的发光底物、不含有Ca²⁺的培养基或不含有Ca²⁺/Mg²⁺的培养基和源自实验受试者血液的样品；

(2) 将含有Ca²⁺的溶液加入在(1)或(1')中制备的混合物中；和

(3) 测量从细胞发出的、钙敏感蛋白的发光（luminescence）。

此外，本发明还涉及用于诊断甲状腺功能减退的方法，用于测定具有发生甲状腺功能减退的高度危险的人的方法，或用于测定甲状腺功能减退的治疗有效性的方法，所述方法包括下述的步骤(1)至(3)：

(1) 制备混合物，所述混合物含有表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞、钙敏感蛋白的发光底物、含有Ca²⁺的培养基、TSH和源自实验受试者血液的样品；

(2) 将含有福司柯林（forskolin）的溶液加入在(1)中制备的混合物中；和

(3) 测量从细胞发出的、钙敏感蛋白的发光。

发明的有益效果

本发明消除了对使用放射性同位素所伴有的复杂操作的需要。因而，通过简单的且安全的操作，可以测量生物样品中含有的甲状腺刺激抗体(TSAb)的量和甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb) 的量，并诊断甲状腺疾病。

附图说明

图1表明，从表达人TSHR、修饰的CNG通道和修饰的水母发光蛋白(aequorin)的CHO细胞发出的发光依赖于牛TSH (bTSH)的浓度。

图2显示了在有低剂量的bTSH存在下，从表达人TSHR、修饰的CNG通道和修饰的水母发光蛋白的CHO细胞发出的发光的量。

图3显示了水母发光蛋白的发光底物的浓度和温育时间对从表达人TSHR、修饰的CNG通道和修饰的水母发光蛋白的CHO细胞发出的发光的量的影响。

图4显示了导入的TSHR表达质粒的量对从表达人TSHR、修饰的CNG通道和修饰的水母发光蛋白的CHO细胞发出的发光的量的影响。

图5显示了表达人TSHR、修饰的CNG通道和修饰的水母发光蛋白的CHO细胞的浓度和细胞的发光量之间的关系。

图6显示了表达人TSHR、修饰的CNG通道和修饰的水母发光蛋白的CHO细胞的浓度和细胞的发光量之间的关系，其中发光量被指示为假设每个空白的相对值是1时计算的相对值。

图7显示了加入的CaCl₂的浓度对从表达人TSHR、修饰的CNG通道和修饰的水母发光蛋白的CHO细胞发出的发光的量的影响。

图8表明，根据本发明的试剂盒能够定量甲状腺刺激抗体(TSAb)。

图9表明，根据本发明的试剂盒能够检测甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)。

图10表明，根据本发明的试剂盒使用能够检测甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的细胞脱敏作用。

图11表明，与常规产品 (甲状腺刺激自身抗体试剂盒; TSAb试剂盒“YAMASA”?)相比，根据本发明的试剂盒能够以更高的灵敏度检测甲状腺刺激抗体(TSAb)。

图12显示了从表达人TSHR、修饰的CNG通道和修饰的水母发光蛋白的CHO细胞发出的发光的量的时程。

图13显示了阻断抗体的浓度依赖性。

图14表明，福司柯林溶液的加入允许以剂量-依赖性的方式检测到阻断抗体。

图15显示了发光量依赖于刺激抗体(TSAb)温育时间的变化。

图16显示了发光量依赖于阻断抗体(TSBAb)温育时间的变化。

图17显示了通过加入福司柯林诱导的发光量依赖于阻断抗体(TSBAb)温育时间的变化。

图18显示了质粒 pmCNGα2。

图19显示了质粒 pcDNA mt sAEQ。

图20显示了使用根据本发明的试剂盒测量的48个正常个体的TSAb 值的直方图。

图21显示了使用根据本发明的试剂盒测量的源自不同甲状腺疾病的血清样品中的TSAb 值的分布。

具体实施方式

本发明提供了表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞和包含所述细胞的组合物。

甲状腺刺激激素受体(TSHR)可以是甲状腺刺激激素(TSH)所结合的任意受体，并包括活化腺苷酸环化酶来增加cAMP的受体。TSHR 的来源没有特别限制，只要它是哺乳动物即可。所述来源可以是，例如，人、小鼠、牛、大鼠或猪。此外，TSHR可以在氨基酸序列中具有适当修饰的(添加的、置换的、缺失的等)一个或几个氨基酸，或者TSHR可以是这样的蛋白：所述蛋白由与天然TSHR的氨基酸序列具有70%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、98%或更高或99%或更高同源性的氨基酸序列组成；结合TSH；并具有通过腺苷酸环化酶的活化来增加cAMP的功能。

TSHR可以是这样的蛋白：所述蛋白具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。此外，TSHR可以是这样的蛋白：所述蛋白由与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有70%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、98%或更高或99%或更高同源性的氨基酸序列组成；结合TSH；并具有通过腺苷酸环化酶的活化来增加cAMP的功能。

或者，TSHR可以是TSHR和类似于TSHR的受体（例如，黄体激素受体、滤泡刺激激素受体或人绒毛膜促性腺激素受体）的嵌合蛋白。这些嵌合蛋白可以如下制备：用黄体激素受体、滤泡刺激激素受体或人绒毛膜促性腺激素受体的适当部分，置换TSHR中除了氨基酸残基8-89或8-165以外的部分。例如，为了制备TSHR-黄体激素受体嵌合蛋白，可以用LH-CG受体的区段Mc2置换TSHR中的氨基酸残基90-165，并可以另外用LH-CG受体的区段Mc4置换TSHR中的氨基酸残基261-370。

本文使用的TSH没有特别限制，只要它源自哺乳动物。TSH可以源自，例如，人、小鼠、牛、大鼠或猪。TSH可以在氨基酸序列中具有适当修饰的(添加的、置换的、缺失的等)一个或几个氨基酸，或者可以是这样的蛋白：所述蛋白由与天然TSH的氨基酸序列具有70%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、98%或更高或99%或更高同源性的氨基酸序列组成；结合TSHR；并具有通过腺苷酸环化酶的活化来增加cAMP的功能。

cAMP依赖性的钙通道是响应于cAMP浓度的变化而改变进入细胞中的钙离子的量的通道，并包括响应于cAMP浓度的增加而增加进入细胞中的钙离子的量的通道。cAMP依赖性的钙通道的实例包括CNG (环核苷酸门控的离子通道)钙通道。任选地，所述cAMP依赖性的钙通道可以在氨基酸序列中具有一个或几个修饰的(添加的、置换的、缺失的等)的氨基酸，并可以被修饰(包括置换、添加和删除) 成使得它表现出例如对cAMP比对cGMP更高的灵敏度。CNG钙通道可以是这样的蛋白：所述蛋白由与天然的CNG钙通道的氨基酸序列具有70%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、98%或更高或99%或更高同源性的氨基酸序列组成，并响应于cAMP浓度的增加而增加进入细胞中的钙离子的量。修饰的实例包括：用色氨酸置换小鼠CNG钙通道中的第460位半胱氨酸，用甲硫氨酸置换小鼠CNG钙通道中的第583位谷氨酸，用丝氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或丙氨酸置换牛CNG钙通道中的537位苏氨酸，和它们的组合。上面例示的这些置换不限于其中分别存在所述置换的动物物种，也适用于在其它动物物种中的对应部位处的氨基酸置换。例如，可以用丝氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或丙氨酸置换与牛CNG钙通道中的537位苏氨酸相对应的小鼠CNG钙通道中的苏氨酸。这样的置换可以在一个或多个位置处进行。例如，用色氨酸置换小鼠CNG钙通道中的第460位半胱氨酸，也可以用甲硫氨酸置换第583位谷氨酸。

CNG钙通道可以由α-亚基和/或β-亚基组成。它可以具有任意组成，例如，由至少一个选自下述的亚基组成：α2亚基、α3亚基、α4亚基和β1b亚基。此外，所述亚基可以如上所述被修饰。

CNG钙通道的来源没有特别限制，只要它是哺乳动物。所述来源可以是，例如，人、小鼠、牛、大鼠或猪。CNG钙通道可以是这样的蛋白：所述蛋白具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。此外，CNG钙通道可以是这样的蛋白：所述蛋白由与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有70%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、98%或更高或99%或更高同源性的氨基酸序列组成，并响应于cAMP浓度的增加而增加进入细胞中的钙离子的量。

钙敏感蛋白包括其结构响应于钙而改变的蛋白，并包括响应于钙而发光的蛋白和起所谓的钙传感器的功能的蛋白。

钙敏感蛋白的实例包括：水母发光蛋白、cameleon (Invitrogen Corp.)、Case12 (Evrogen)、clytin、obelin、mitrocomin、mineopsin、瓜水母光蛋白（berovin）、包含在颜色上存在差别的2种GFP（结合到钙敏感的钙调蛋白和与其结合的肌球蛋白轻链激酶的部分序列上）的蛋白、包含结合在GFP的氨基酸序列中的144位和146位残基之间的钙调蛋白的钙敏感蛋白、和在日本专利公开号2002-153279中所述的探针号G3-85或A1-2的蛋白和它们的脱辅基蛋白（如果存在的话） (例如，脱辅基水母发光蛋白（apoaequorin）)。

钙敏感蛋白的氨基酸序列可以根据目的适当地修饰(添加、置换、删除等)，或可以被修饰以增加发光的量和/或提高信噪比。所述修饰包括在氨基酸序列中添加、置换和删除一个或几个氨基酸。钙敏感蛋白包括这样的蛋白：所述蛋白由与天然的钙敏感蛋白的氨基酸序列具有70%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、98%或更高或99%或更高同源性的氨基酸序列组成，并响应于钙而发光。例如，可以修饰钙敏感蛋白，使得它的基因为人密码子选择而优化，并具有线粒体靶向信号。

钙敏感蛋白可以是具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的蛋白。此外，钙敏感蛋白可以是这样的蛋白：所述蛋白由与SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列具有70%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、98%或更高或99%或更高同源性的氨基酸序列组成，并响应于钙而发光。

根据本发明的表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞会暂时地或稳定地表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白中的每一种。所述细胞没有特别限制，且可以是诸如CHO细胞、HEK293细胞或3T3细胞等细胞系。例如，根据本发明的表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞可以是稳定地表达每种蛋白的CHO细胞，其中所述TSHR具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，所述cAMP依赖性的钙通道是具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的修饰的CNG钙通道，且所述钙敏感蛋白是具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的修饰的脱辅基水母发光蛋白。此外，根据本发明的表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞可以是，例如，稳定地表达TSHR、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的CHO细胞，它们中的每一种是这样的蛋白：所述蛋白由与SEQ ID NO: 1-3中的任一个的氨基酸序列具有70%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、98%或更高或99%或更高同源性的氨基酸序列组成，且维持甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道或钙敏感蛋白的功能。

此外，可以使用天然地表达一种或多种选自下述的蛋白的细胞：甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白。在该情况下，根据本发明的表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞也可以如下制备：迫使所述细胞暂时地或稳定地表达在所述细胞中不表达的蛋白。这样的细胞的实例包括：内源地表达TSHR的甲状腺-衍生的细胞(例如，FRTL-5或Nthy-ori 3-1)，其迫使暂时地或稳定地表达cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白中的每一种；和内源地表达CNG钙通道的嗅觉组织-衍生的细胞，其迫使暂时地或稳定地表达TSHR和钙敏感蛋白中的每一种。

可以冷冻保存根据本发明的表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞。冷冻保存可以在适当的温度（例如，-20℃或-80℃）在细胞冷冻保存溶液中进行。细胞冷冻保存溶液没有限制，包括：CELLBANKER? (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.)、BAMBANKER? (Lymphotec Inc.)、Cellvation? (CELOX LABORATORIES, Inc.)、CryoStor? (BIOLIFE SOLUTIONS Ltd.)等。可以在大量相同批次中冷冻保存细胞，使得在组合物或试剂盒之间的细胞-衍生的测量误差急剧减小。结果，可以提高测量结果的再现性。此外，根据本发明的表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞会维持足以检测人血液中的甲状腺刺激抗体(TSAb)和甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的灵敏度，甚至在冷冻保存并使用温浴等解冻以后。此外，在解冻以后，仅将细胞转移进适当的容器中，并培养大约2小时，为检测TSAb和TSBAb而加入的试剂或人血液-衍生的组分不会恶化细胞的状态。

包含根据本发明的表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞的组合物(例如，包含根据本发明的表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞的水溶液)可以用于测定甲状腺刺激抗体的量和/或甲状腺刺激阻断抗体的的量，用于诊断甲状腺疾病，用于测定具有发生甲状腺疾病的高度危险的人，和/或用于测定对在甲状腺疾病治疗下的人的治疗效果。

本文使用的甲状腺疾病包括甲状腺功能亢进和甲状腺功能减退。甲状腺功能亢进包括格雷夫氏病，甲状腺功能减退包括桥本氏病。本文使用的桥本氏病包括：血液中TSBAb-阳性的甲状腺功能减退、没有甲状腺肿的萎缩性甲状腺炎、由TSBAb造成的萎缩性甲状腺炎和粘液水肿。

表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞如上所述。

所述甲状腺刺激抗体(TSAb)是这样的抗体：所述抗体能够起TSHR 激动剂的作用，并可以在格雷夫氏病患者的血液中发现。

所述甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb) 是这样的抗体：所述抗体能够结合TSHR并起TSHR拮抗剂的作用，包括例如，竞争性地抑制TSH与TSHR的结合的抗体。所述甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb) 可以在甲状腺功能减退患者的血液中（例如，在桥本氏病患者的血液中）发现。

通过使用下述的作用机理，可以测量在生物样品中存在的甲状腺刺激抗体(TSAb)或甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)：

(1) 当甲状腺刺激抗体(TSAb)存在于生物样品中时

TSAb通过对根据本发明的细胞的TSHR的作用，增加cAMP。结果，CNG钙通道被活化，使得进入细胞中的钙增加。因而，钙敏感蛋白会发光。这意味着，TSAb在样品中的存在被钙敏感蛋白的发光表示为输出。

(2) 当甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)存在于生物样品中时

(a) 使用针对TSH的竞争性抑制的方法

在与TSH一起加入以后，TSBAb会竞争性地抑制TSH与TSHR的结合。结果，TSH的作用被抑制，以阻止cAMP浓度的增加，还由此阻止CNG钙通道-介导的钙进入的增加。因而，钙敏感蛋白的发光减小。这意味着，TSBAb在样品中的存在被钙敏感蛋白的发光的抑制表示为输出。

(b) 使用CNG钙通道的脱敏作用的方法

在与TSH一起加入以后，TSBAb会竞争性地抑制TSH与TSHR的结合。结果，TSH的作用被抑制，以阻止cAMP浓度的增加。在该情况下，如果TSBAb不存在，TSH的作用会增加cAMP的浓度，以活化CNG钙通道。但是，在给定的时间以后，CNG钙通道被脱敏，因而不会对新加入的福司柯林 (或增加cAMP浓度的试剂)做出响应。因此，如果TSBAb在样品中不存在，钙不会进入细胞中。这意味着，TSBAb的缺失被钙敏感蛋白的发光的抑制表示为输出。另一方面，如果TSBAb存在于样品中，CNG钙通道不会被脱敏。因而，钙敏感蛋白的发光不会减小。

在本发明的一个实施方案中，上述作用机理使用根据本发明的组合物，可以检测生物样品中的甲状腺刺激抗体和/或甲状腺刺激阻断抗体；可以对比2个生物样品之间的甲状腺刺激抗体和/或甲状腺刺激阻断抗体的浓度；或可以测量2个生物样品中甲状腺刺激抗体和/或甲状腺刺激阻断抗体的相对量。此外，使用根据本发明的组合物，也可以测量生物样品中甲状腺刺激抗体和/或甲状腺刺激阻断抗体的浓度。

本文使用的生物样品包括生物体-衍生的样品诸如血液和从血液制备的样品，并包括，例如，人血液、从人血液制备的样品、犬血液、从犬血液制备的样品、猫血液和从猫血液制备的样品。

使用根据本发明的组合物，可以测量人血液中的甲状腺刺激抗体和/或甲状腺刺激阻断抗体。因而，可以诊断出实验受试者是否具有甲状腺疾病。

当使用在(1)中的上述作用机理时，使用根据本发明的组合物，可以诊断格雷夫氏病。例如，可以如下诊断格雷夫氏病：测量从用实验受试者的血液样品处理过的细胞发出的钙敏感蛋白的发光量，以及从用与实验受试者的血液样品相同量的正常个体的血液样品(标准品)处理过的细胞发出的钙敏感蛋白的发光量。在该情况下，当用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量高于从用正常个体的血液样品(标准品)处理过的细胞发出的发光量时，可以确定实验受试者的甲状腺刺激抗体(TSAb)的血清浓度高于正常个体的相应值。因而，所述实验受试者可以被诊断为格雷夫氏病。

此外，预先测量用正常个体的大群体（例如，50-100个正常个体）的血液样品处理过的细胞所发出的各自发光量(积分值)，并可以计算其均值和标准差(SD)。当用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量高于用正常个体群体的血液样品处理过的细胞所发出的发光量(积分值)的均值+ nSD (例如，n = 1、2、3、4或5)时，可以确定实验受试者的甲状腺刺激抗体的血清浓度高于正常个体的相应值。因而，所述实验受试者可以被诊断为格雷夫氏病。

在本说明书和权利要求书中，从“源自正常个体血液的样品”得到的值可以是，例如，正常个体的血液样品(标准品)的测量值，或预先从正常个体群体的测量值得到的值，除非另外指出。

或者，可以计算用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量(积分值)/ 用正常个体的血液样品处理过的细胞所发出的发光量(积分值) × 100 (%) (在下文中，该计算的值被定义为计算的值A)。预先测量用正常个体的大群体和未治疗的格雷夫氏病患者的大群体（例如， 50-100个体/群体）的各个血液样品处理过的细胞所发出的各自发光量(积分值)，并可以设定截止值，使得格雷夫氏病的真阳性率和/或真阴性率(即，是正常个体)分别是，例如，80%或更高、90%或更高、92%或更高、94%或更高、96%或更高或98%或更高。当计算的值A高于截止值时，所述实验受试者可以被诊断为格雷夫氏病。根据目标群体的性质，诸如年龄和性别，可以适当地设置截止值，且可以设置为，例如，120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%或200%。

此外，也使用抗体(TSAb)标准品(例如，NIBSC 90/672或65/122)，且可以连续地稀释它的浓度，以制备校正曲线。参照校正曲线，从用实验受试者的血液样品处理过的细胞发出的钙敏感蛋白的测量发光量，计算抗体(TSAb)的实际血清浓度。可以将该浓度与以前测量的每个正常个体的大群体和未治疗的格雷夫氏病患者的大群体 (例如，50-100个体/群体)中的抗体(TSAb)血清浓度相对比，或与文献中报道的已知数据等相对比，以诊断实验受试者是否具有格雷夫氏病。例如，当该浓度高于正常个体群体的(TSAb)血清浓度的均值+ nSD (例如，n = 1、2、3、4或5)时，所述实验受试者可以被诊断为格雷夫氏病。

为了测量发光量，优选地，测量给定时间的积分值。例如，可以测量5 秒、10 秒、15 秒、20 秒、30 秒、40 秒、50 秒或1分钟的积分值。

此外，当使用(2)(a)中的上述作用机理时，使用根据本发明的组合物，可以诊断出甲状腺功能减退(包括桥本氏病)。例如，可以如下诊断甲状腺功能减退：测量用实验受试者的血液样品处理过的细胞中钙敏感蛋白的TSH-诱导的发光量，以及用与实验受试者的血液样品相同量的正常个体的血液样品(标准品)处理过的细胞中钙敏感蛋白的TSH-诱导的发光量。在该情况下，当用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量低于从用正常个体的血液样品(标准品)处理过的细胞发出的发光量时，可以确定实验受试者的甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的血清浓度高于正常个体的相应值。因而，所述实验受试者可以被诊断为甲状腺功能减退。

此外，预先测量用正常个体的大群体（例如，50-100个正常个体）的血液样品处理过的细胞中钙敏感蛋白的各个TSH-诱导的发光量(积分值)，并可以计算其均值和标准差(SD)。当用实验受试者的血液样品处理过的细胞发出的TSH-诱导的发光量低于用正常个体群体的血液样品处理过的细胞的TSH-诱导的发光量(积分值)的均值- nSD (例如，n = 1、2、3、4或5)时，可以确定实验受试者的甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的血清浓度高于正常个体的相应值。因而，所述实验受试者可以被诊断为甲状腺功能减退。

或者，可以计算用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量(积分值) / 用正常个体的血液样品处理过的细胞所发出的发光量(积分值) × 100 (%)(在下文中，该计算的值被定义为计算的值B)。预先测量用正常个体的大群体和未处理的甲状腺功能减退患者的大群体(例如，50-100个体/群体)的各个血液样品引起的各自发光量(积分值)，并设定截止值，使得甲状腺功能减退的真阳性率和/或真阴性率(即，是正常个体)分别是，例如，80%或更高、90%或更高、92%或更高、94%或更高、96%或更高或98%或更高。当计算的值B低于截止值时，所述实验受试者也可以被诊断为甲状腺功能减退。根据目标群体的性质，诸如年龄和性别，可以适当地设置截止值，且可以设置为，例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。

此外，还可以使用具有已知浓度的抗体(TSBAb)标准品，可以连续地稀释它的浓度，以制备校正曲线。参照校正曲线，从用实验受试者的血液样品处理过的细胞中测得的钙敏感蛋白的TSH-诱导的发光量，计算抗体(TSBAb)的实际血清浓度。可以将该浓度与以前测量的每个正常个体的大群体和未治疗的格雷夫氏病患者的大群体 (例如，50-100个体/群体)中的抗体(TSBAb)血清浓度相对比，或与文献中报道的已知数据等相对比，以诊断实验受试者是否具有甲状腺功能减退。例如，当该浓度高于正常个体群体的(TSBAb)血清浓度的均值+ nSD (例如，n = 1、2、3、4或5)时，所述实验受试者可以被诊断为甲状腺功能减退。

为了测量发光量，优选地，测量给定时间的积分值。例如，可以测量5 秒、10 秒、15 秒、20 秒、30 秒、40 秒、50 秒或1分钟的积分值。

此外，当使用(2)(b)中的上述作用机理时，使用根据本发明的组合物，可以诊断出甲状腺功能减退 (包括桥本氏病)。例如，可以如下诊断甲状腺功能减退：测量用实验受试者的血液样品处理过的细胞中钙敏感蛋白的福司柯林-诱导的发光量，以及用与实验受试者的血液样品相同量的正常个体的血液样品(标准品)处理过的细胞中钙敏感蛋白的福司柯林-诱导的发光量。在该情况下，当用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量高于从用正常个体的血液样品(标准品)处理过的细胞发出的发光量时，可以确定实验受试者的甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的血清浓度高于正常个体的相应值。因而，所述实验受试者可以被诊断为甲状腺功能减退。

此外，预先测量用正常个体的大群体（例如，50-100个正常个体）的血液样品处理过的细胞中钙敏感蛋白的各个福司柯林-诱导的发光量(积分值)，并可以计算其均值和标准差(SD)。当用实验受试者的血液样品处理过的细胞的福司柯林-诱导的发光量高于用正常个体群体的血液样品处理过的细胞的福司柯林-诱导的发光量(积分值)的均值+ nSD (例如，n = 1、2、3、4或5)时，可以确定实验受试者的甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的血清浓度高于正常个体的相应值。因而，所述实验受试者也可以被诊断为甲状腺功能减退。

或者，可以计算用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量(积分值) / 用正常个体的血液样品处理过的细胞所发出的发光量(积分值) × 100 (%) (在下文中，该计算的值被定义为计算的值C)。预先测量用正常个体的大群体和未处理的甲状腺功能减退患者的大群体(例如，50-100个体/群体)的各个血液样品引起的各自发光量(积分值)，并设定截止值，使得甲状腺功能减退的真阳性率和/或真阴性率(即，是正常个体)分别是，例如，80%或更高、90%或更高、92%或更高、94%或更高、96%或更高或98%或更高。当计算的值C高于截止值时，所述实验受试者也可以被诊断为甲状腺功能减退。根据目标群体的性质，诸如年龄和性别，可以适当地设置截止值，且可以设置为，例如，150%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%或900%。

此外，还可以使用具有已知浓度的抗体(TSBAb)标准品，可以连续地稀释它的浓度，以制备校正曲线。参照校正曲线，从用实验受试者的血液样品处理过的细胞中测得的钙敏感蛋白的福司柯林-诱导的发光量，计算抗体(TSBAb)的实际血清浓度。可以将该浓度与以前测量的每个正常个体的大群体和未治疗的格雷夫氏病患者的大群体 (例如，50-100个体/群体)中的抗体(TSBAb)血清浓度相对比，或与文献中报道的已知数据等相对比，以诊断实验受试者是否具有甲状腺功能减退。例如，当该浓度高于正常个体群体的(TSBAb)血清浓度的均值+ nSD (例如，n = 1、2、3、4或5)时，所述实验受试者可以被诊断为甲状腺功能减退。

为了测量发光量，优选地，测量给定时间的积分值。例如，可以测量5秒、10秒、15秒、20秒、30秒、40秒、50秒或1分钟的积分值。

此外，使用根据本发明的组合物，可以测定具有发生甲状腺疾病的高度危险的人，例如，具有发生格雷夫氏病或甲状腺功能减退的高度危险的人。

例如，当在医学检查中使用根据本发明的组合物测量的甲状腺刺激抗体的血清浓度低于格雷夫氏病患者的数值且高于正常个体的数值时，该人可以被确定为具有发生格雷夫氏病的高度危险的人。当甲状腺刺激阻断抗体的血清浓度低于甲状腺功能减退的数值且高于正常个体的数值时，该人可以被确定为具有发生甲状腺功能减退的高度危险的人。此外，当在医学检查中使用根据本发明的组合物测量的甲状腺刺激抗体的血清浓度随时间逐渐升高时，该人可以被确定为具有发生格雷夫氏病的高度危险的人。当甲状腺刺激阻断抗体的血清浓度随时间逐渐升高时，该人可以被确定为具有发生甲状腺功能减退的高度危险的人。

此外，使用根据本发明的组合物，也可以测定对于在甲状腺疾病治疗下的人（例如，在其治疗下的具有格雷夫氏病或甲状腺功能减退的人）的治疗有效性。

例如，使用根据本发明的组合物，可以测量在治疗之前和之后从相同个体收集的血液样品的甲状腺刺激抗体或甲状腺刺激阻断抗体的浓度以及所述浓度的时间-依赖性的变化，以测定治疗有效性存在与否。当使用根据本发明的组合物测量的甲状腺刺激抗体的血清浓度在治疗之后比治疗之前更低时，可以确定格雷夫氏病的治疗是有效的。当使用根据本发明的组合物测量的甲状腺刺激阻断抗体的血清浓度在治疗之前比治疗之后更低时，可以确定甲状腺功能减退的治疗是有效的。

本发明提供了一种试剂盒，其包含含有根据本发明的表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞的组合物，且可以另外包含至少一种选自下述的物质：用于细胞培养的培养基、检测溶液、钙敏感蛋白的发光底物或其水溶液、抗体分离溶液、细胞培养板或测测试管、TSH或其水溶液、抗-TSH抗体和正常人IgG对照血清。例如，单个地包装构成所述试剂盒和所述组合物的每种物质，且这些包装可以一起放在一个容器（诸如盒子）中，以制备试剂盒。

可以适当地制备根据本发明的表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞，并以例如3 × 10⁴细胞/ml至3 × 10⁶细胞/ml的浓度制备。根据本发明的细胞可以如下制备：例如，以3 × 10⁶细胞/ml的浓度，将它悬浮于水溶液中。当使用96-孔板作为细胞培养板时，可以以例如每个96-孔板的孔含有3 × 10³细胞至3 × 10⁵细胞的浓度，给平板接种细胞。

用于细胞培养的培养基没有限制，只要它可以维持根据本发明的细胞。用于细胞培养的培养基可以是没有Ca²⁺的或没有Ca²⁺/Mg²⁺的。

所述检测溶液可以含有CaCl₂、台盼蓝、能够造成水母发光蛋白发光且可以替代钙的阳离子(例如，镉离子或锶离子)、镁离子、锌离子、硫酸根离子和/或碳酸根离子。本领域技术人员可以适当地调节CaCl₂和台盼蓝的浓度。例如，CaCl₂的浓度是9-18 mM，台盼蓝的浓度是0.001-0.010%。所述检测溶液是，例如，含有9 mM CaCl₂和0.002% 台盼蓝的水溶液。当测量钙敏感蛋白的发光量时，CaCl₂的终浓度可以设定为3-6 mM。此外，所述检测溶液可以含有可以替代钙的阳离子、镁离子、锌离子、硫酸根离子和/或碳酸根离子，例如，通过将可以替代钙的阳离子、镁离子、锌离子、硫酸根离子和/或碳酸根离子溶解在检测溶液中。

钙敏感蛋白的发光底物包括腔肠荧光素（coelenterazine）或腔肠荧光素衍生物，其用作水母发光蛋白的发光底物。腔肠荧光素衍生物包ViviRen? (Promega Corp.)。可以适当地设置ViviRen的浓度，且是例如0.6-30 mM。钙敏感蛋白的发光底物的水溶液是，例如，4 mM ViviRen (Promega Corp.)的水溶液。当测量钙敏感蛋白的发光量时，可以将ViviRen的终浓度设定为0.24-12 μM。

所述抗体分离溶液没有限制，只要可以从血液样品收集甲状腺刺激抗体和甲状腺刺激阻断抗体。抗体分离溶液可以含有10-30% PEG6000。抗体分离溶液可以是，例如，含有30% PEG6000的水溶液。

细胞培养板的实例包括：允许使用光度计测量发光量的那些，例如，允许细胞培养的96-孔板。

所述测测试管没有特别限制，且可以由本领域技术人员适当地选择。例如，可以使用这样的测测试管：其适合用于测量从钙敏感蛋白发出的发光的装置。

TSH没有限制，只要它可以用作TSHR 激动剂。TSH可以用作阳性对照。TSH可以是，但不限于：牛TSH。本领域技术人员可以适当地制备TSH，并可以调节至0.01-100 mU/ml。例如，将牛TSH制备为1 mU/ml 水溶液。当测量钙敏感蛋白的发光量时，可以将牛TSH的终浓度设定为0.6 μU/ml-6 mU/ml。当测量钙敏感蛋白的发光量时，牛TSH的终浓度是例如100 μU/ml。此外，作为TSH的替代或除了TSH以外，可以使用TSAb。TSAb可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

正常人IgG对照血清可以用作阴性对照，并可以由本领域技术人员适当地制备。

所述抗-TSH抗体可以是多克隆抗体，或可以是单克隆抗体。所述抗-TSH抗体可以是从适当的哺乳动物衍生出的抗体，且包括小鼠抗-TSH抗体、大鼠抗-TSH抗体、兔抗-TSH抗体和山羊抗-TSH抗体。所述抗-TSH抗体可以被本领域技术人员适当地修饰。此外，也适当地选择用作抗原的TSH。用作抗原的TSH包括人TSH、小鼠TSH、大鼠TSH、兔TSH、猫TSH和犬TSH。在本发明的试剂盒中使用的抗-TSH抗体的实例包括山羊抗-人TSH 多克隆抗体。抗-TSH抗体的浓度可以由本领域技术人员适当地设置。例如，在试剂盒中包装的抗-TSH抗体溶液的浓度可以设定为0.01 μg/ml-100 μg/ml。当测量钙敏感蛋白的发光量时，抗-TSH 单克隆抗体的终浓度可以是，例如，0.05-5.48 μg/ml。

在甲状腺功能减退患者中，存在血液中TSH的量处于高值的患者。在该情况下，细胞中的钙敏感蛋白会因为TSH而发光。因而，该患者可以被诊断为格雷夫氏病，尽管他/她是甲状腺功能减退患者。但是，与根据本发明的细胞的抗-TSH抗体一起，加入源自具有大量TSH的甲状腺功能减退患者的血液样品，以中和源自该患者的TSH。因而，可以将该患者误诊为格雷夫氏病。此外，可以对比在下述两种情况下从钙敏感蛋白发出的发光量：将抗-TSH抗体与患者-衍生的血液样品一起加给本发明的细胞的情况，和不加入抗-TSH抗体、将患者-衍生的血液样品加给本发明的细胞的情况，从而可以得到关于患者血液的TSH的量的信息。通过组合该信息和患者的临床征状，医师可以更正确地诊断甲状腺疾病。

此外，本发明的试剂盒另外含有甲状腺疾病患者的血清，例如，格雷夫氏病患者的血清和/或甲状腺功能减退患者的血清。这样的血清可以用作浓度计算的对照或标准品，用于诊断甲状腺疾病，用于评估发生所述疾病的风险，或用于评估所述疾病的治疗的有效性。

此外，本发明的试剂盒可以含有活化腺苷酸环化酶的底物，例如，福司柯林。可以如下测定甲状腺刺激阻断抗体在源自实验受试者血液的样品中的存在与否：将样品与TSH 一起加给细胞，培养所述细胞指定的时间，然后向其中加入福司柯林。此外，也可以测量样品中甲状腺刺激阻断抗体的浓度。结果，可以诊断出甲状腺功能减退 (例如，桥本氏病)，可以确定具有发生甲状腺功能减退 (例如，桥本氏病)的风险的人，或可以确定对已经接受甲状腺功能减退 (例如，桥本氏病)治疗的患者的治疗效果。

根据本发明的组合物或试剂盒对于诊断辅助而言也是有用的，其帮助医师在考虑患者的临床征状和/或其它检查结果以后诊断出格雷夫氏病和/或甲状腺功能减退。例如，使用根据本发明的组合物或试剂盒测量表现出甲状腺功能亢进的患者的血液样品中的甲状腺刺激抗体(TSAb)的量，对于格雷夫氏病和有害的甲状腺功能亢进(例如，无痛的甲状腺炎或亚急性甲状腺炎)之间的鉴别诊断可以是有用的。

本发明还提供了用于诊断格雷夫氏病的方法，所述方法包括下述的步骤(A)至(C)：

(A) 制备混合物，所述混合物含有表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞、钙敏感蛋白的发光底物、不含有Ca²⁺的培养基和源自实验受试者血液的样品；

(B) 将含有Ca²⁺的溶液加入在(A)中制备的混合物中；和

(C) 测量从细胞发出的、钙敏感蛋白的发光。

在所述方法的步骤(A)中使用的不含有Ca²⁺的培养基可以由本领域技术人员适当地选择，且可以是不含有Ca²⁺/Mg²⁺的培养基。

在所述方法的步骤(B)中使用的含有Ca²⁺的溶液可以由本领域技术人员适当地选择，且可以是例如CaCl₂溶液。所述含有Ca²⁺的溶液可以另外含有可以替代钙的阳离子(例如，镉离子或锶离子)、镁离子、锌离子、硫酸根离子和/或碳酸根离子。

在所述方法的步骤(A)中制备的混合物可以另外含有抗-TSH抗体。在所述方法的步骤(A)中制备的混合物所含有的抗-TSH抗体，可以避免其血液中的TSH量处于高值的甲状腺功能减退患者被误诊为格雷夫氏病。

在所述方法的步骤(A)中描述的物质的加入次序， 可以由本领域技术人员适当地设置。

本发明提供了例如，用于诊断格雷夫氏病的方法，所述方法包括下述步骤：

(1) 在补充了钙敏感蛋白的发光底物的不含有Ca²⁺的培养基中，培养表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞；

(2) 将源自实验受试者血液的样品加给培养的细胞，将其进一步培养；和

(3) 将CaCl₂溶液加给培养的细胞，并测量从细胞发出的、钙敏感蛋白的发光。

在所述方法中，可以冷冻保存细胞。在该情况下，通过温和操作诸如温浴，可以解冻细胞。可以在补充了钙敏感蛋白的发光底物的不含有Ca²⁺/Mg²⁺的培养基中，培养解冻的细胞。钙敏感蛋白的发光底物包括腔肠荧光素和ViviRen?。

不含有Ca²⁺的培养基没有限制，只要可以维持细胞。例如，使用130 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM MgCl₂、4.8 mM NaHCO₃、5% PEG6000、pH 7.4。此外，所述不含有Ca²⁺的培养基可以是不含有Ca²⁺/Mg²⁺的培养基。可以以适当的浓度将细胞接种进适当的容器中，并以例如3-30 × 10⁴细胞/ml和90 μL/孔的浓度接种进与光度计相容的96-孔板中。在步骤(1)中的温育时间可以是任意时间，只要它等于或长于2小时。温育时间可以设定为2-8小时，且是例如3小时。一般而言，为了从由继代培养造成的损伤恢复，并增加钙敏感蛋白（诸如水母发光蛋白）的发光量，在接种细胞以后，通常培养细胞大约12-24小时。在本发明中，已经证实，即使将细胞培养大约2小时，也没有诱导添加剂造成的细胞死亡，且钙敏感蛋白表现出强发光。已经证实，甚至在细胞接种以后大约2小时，可以检测到来自钙敏感蛋白的强发光，例如，通过采用水母发光蛋白作为钙敏感蛋白，针对人密码子优化它的DNA序列，导入线粒体靶向信号，并进一步采用ViviRen?作为钙敏感蛋白的发光底物。

如下制备在步骤(2)中加入的血液-衍生的样品：将PEG水溶液加入实验受试者血液等中，并收集沉淀的级分。例如，使用30% PEG6000作为PEG水溶液。此外，在某些情况下，使用源自格雷夫氏病患者血液的样品作为阳性对照，和/或也可以使用源自正常个体的血液样品作为阴性对照，并将各自分别在步骤(2)中加给细胞。在步骤(2)中的温育时间没有限制，可以设定为30-60分钟，例如，30分钟。结果，在细胞中积累cAMP。因而，在加入CaCl₂溶液以后，可以立即测量到比在没有培养物存在下加入样品以后的发光更稳定的强发光。

只要在步骤(2)和(3)中的温育时间总共在大约4小时内，由于该时间较短，不需要进行无菌培养。

在步骤(2)中，可以另外将抗-TSH抗体加给培养的细胞。所述抗-TSH抗体可以是多克隆抗体，或可以是单克隆抗体。所述抗-TSH抗体可以是源自适当的哺乳动物的抗体，且包括小鼠抗-TSH抗体、大鼠抗-TSH抗体、兔抗-TSH抗体和山羊抗-TSH抗体。所述抗-TSH抗体可以被本领域技术人员适当地修饰。此外，也适当地选择用作抗原的TSH。用作抗原的TSH包括人TSH、小鼠TSH、大鼠TSH、兔TSH、猫TSH和犬TSH。在本发明的方法中使用的抗-TSH抗体的实例包括山羊抗-人TSH 多克隆抗体。

在步骤(3)中使用的含有CaCl₂的溶液可以另外含有可以替代钙的阳离子(例如，镉离子或锶离子)、镁离子、锌离子、硫酸根离子和/或碳酸根离子。本领域技术人员可以适当地设置在CaCl₂溶液中可以含有的Ca²⁺、可以替代钙的阳离子、镁离子、锌离子、硫酸根离子和碳酸根离子的浓度，使得所述细胞可以得到维持，且钙敏感蛋白（诸如水母发光蛋白）适当地发光。

在步骤(3)中，在加入CaCl₂溶液以后，钙敏感蛋白（诸如水母发光蛋白）立即发光，且可以通过本领域技术人员众所周知的方法进行测量。例如，使用能够自动地并连续地进行搅拌和测量的光度计(PerkinElmer Inc., ARVO-Sx)，并通过在搅拌后积分发光值15-30 秒，可以测量发光量。本领域技术人员可以适当地选择在发光量的测量中可以使用的装置。

作为进行所述方法的结果，当用源自实验受试者血液的样品处理过的细胞所发出的钙敏感蛋白(例如，水母发光蛋白)的发光量高于用源自正常个体血液的样品处理过的细胞所发出的值时，所述实验受试者可以被诊断为格雷夫氏病。此外，可以测定抗体的血清浓度，并与格雷夫氏病患者和/或正常个体的标准抗体浓度相对比，以诊断实验受试者是否为格雷夫氏病。

例如，测量用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量，和用与实验受试者的血液样品相同量的正常个体的血液样品(标准品)处理过的细胞所发出的发光量。当用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量高于用正常个体的血液样品(标准品)处理过的细胞所发出的发光量时，可以确定实验受试者的甲状腺刺激抗体(TSAb)的血清浓度高于正常个体的相应值。因而，所述实验受试者可以被诊断为格雷夫氏病。

此外，预先测量用正常个体的大群体（例如，50-100个正常个体）的血液样品处理过的细胞的各自发光量(积分值)，并可以计算其均值和标准差(SD)。当用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量高于用正常个体群体的血液样品处理过的细胞所发出的发光量(积分值)的均值+ nSD (例如，n = 1、2、3、4或5)时，可以确定实验受试者的甲状腺刺激抗体的血清浓度高于正常个体的相应值。因而，所述实验受试者可以被诊断为格雷夫氏病。

此外，可以计算用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量(积分值) / 用正常个体的血液样品处理过的细胞所发出的发光量(积分值) × 100 (%) (该计算的值被定义为计算的值D)。预先测量用正常个体的大群体和未治疗的格雷夫氏病患者的大群体（例如， 50-100个体/群体）的各个血液样品处理过的细胞所发出的各自发光量(积分值)，并设定截止值，使得格雷夫氏病的真阳性率和/或真阴性率(即，是正常个体)分别是，例如，80%或更高、90%或更高、92%或更高、94%或更高、96%或更高或98%或更高。当计算的值D高于截止值时，所述实验受试者也可以被诊断为格雷夫氏病。根据目标群体的性质，诸如年龄和性别，可以适当地设置截止值，且可以设置为，例如，120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%或200%。

此外，也使用抗体(TSAb)标准品(例如，NIBSC 90/672或65/122)，且可以连续地稀释它的浓度，以制备校正曲线。参照校正曲线，从用实验受试者的血液样品处理过的细胞发出的钙敏感蛋白的测量发光量，计算抗体(TSAb)的实际血清浓度。可以将该浓度与以前测量的每个正常个体的大群体和未治疗的格雷夫氏病患者的大群体 (例如，50-100个体/群体)中的抗体(TSAb)血清浓度相对比，或与文献中报道的已知数据等相对比，以诊断实验受试者是否具有格雷夫氏病。例如，当该浓度高于正常个体群体的(TSAb)血清浓度的均值+ nSD (例如，n = 1、2、3、4或5)时，所述实验受试者也可以被诊断为格雷夫氏病。

此外，作为进行所述方法的结果，当用源自实验受试者血液的样品处理过的细胞所发出的钙敏感蛋白(例如，水母发光蛋白)的发光量高于用源自正常个体血液的样品处理过的细胞所发出的值、且低于用源自格雷夫氏病患者的血液的样品处理过的细胞所发出的值时，所述实验受试者可以被诊断为具有发生格雷夫氏病的高度危险的人。或者，可以测定抗体的血清浓度，并与格雷夫氏病患者和/或正常个体的标准抗体浓度相对比，以诊断实验受试者是否为具有发生格雷夫氏病的高度危险的人。

此外，在步骤(2)中，加入在治疗之前和之后从相同格雷夫氏病患者采取的样品，作为源自实验受试者血液的样品。可以在样品之间对比所述细胞所发出的钙敏感蛋白(例如，水母发光蛋白)的发光量，以确定治疗有效性。作为实验的结果，当在治疗之后采取的样品中钙敏感蛋白（诸如水母发光蛋白）的发光量低于在治疗之前采取的样品中的值时，可以确定所述治疗是有效的。

本发明还提供了用于诊断甲状腺功能减退的方法，所述方法包括下述的步骤(A)至(C)：

(A) 制备混合物，所述混合物含有表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞、钙敏感蛋白的发光底物、不含有Ca²⁺的培养基、TSH或刺激性的TSAb单克隆抗体和源自实验受试者血液的样品；

(B) 将含有Ca²⁺的溶液加入在(A)中制备的混合物中；和

(C) 定量从细胞发出的、钙敏感蛋白的发光。

在所述方法的步骤(A)中使用的不含有Ca²⁺的培养基可以由本领域技术人员适当地选择，且可以是不含有Ca²⁺/Mg²⁺的培养基。

在所述方法的步骤(B)中使用的含有Ca²⁺的溶液可以由本领域技术人员适当地选择，且可以是例如CaCl₂溶液。此外，所述含有Ca²⁺的溶液可以另外含有可以替代钙的阳离子(例如，镉离子或锶离子)、镁离子、锌离子、硫酸根离子和/或碳酸根离子。

在所述方法的步骤(A)中描述的物质的加入次序， 可以由本领域技术人员适当地设置。

本发明提供了，例如，用于诊断甲状腺功能减退(例如，桥本氏病)的方法，所述方法包括下述步骤：

(1) 在补充了钙敏感蛋白的发光底物的不含有Ca²⁺的培养基中，培养表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞；

(2) 将源自实验受试者血液的样品与TSH一起加给培养的细胞，将其进一步培养；和

(3) 将CaCl₂溶液加给培养的细胞，并测量从细胞发出的、钙敏感蛋白的发光。

参照上述的用于诊断格雷夫氏病的方法，本领域技术人员可以适当地实现步骤(1)至(3)。

在某些情况下，在步骤(2)中，可以使用源自正常个体血液的样品作为阴性对照，和/或可以使用源自甲状腺功能减退患者的血液的样品作为阳性对照，并将它们各自分别加给细胞。此外，在步骤(2)中的温育时间没有限制，可以设定为30-120分钟，例如，30分钟。此外，在步骤(2)中， TSH可以是牛TSH。在某些情况下，作为TSH的替代或除了TSH以外，可以加入TSAb。TSAb可以是单克隆抗体。

作为进行所述方法的结果，当用源自实验受试者血液的样品处理过的细胞所发出的钙敏感蛋白(例如，水母发光蛋白)的发光量低于用源自正常个体血液的样品处理过的细胞所发出的值时，所述实验受试者可以被诊断为甲状腺功能减退。此外，可以测定抗体的血清浓度，并与甲状腺功能减退患者和/或正常个体的标准抗体浓度相对比，以诊断实验受试者是否为甲状腺功能减退。

例如，测量用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量，和用与实验受试者的血液样品相同量的正常个体的血液样品(标准品)处理过的细胞所发出的发光量。当用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量低于用正常个体的血液样品(标准品)处理过的细胞所发出的发光量时，可以确定实验受试者的甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的血清浓度高于正常个体的相应值。因而，所述实验受试者可以被诊断为甲状腺功能减退。

此外，预先测量用正常个体的大群体（例如，50-100个正常个体）的血液样品处理过的细胞中的钙敏感蛋白的各个TSH-诱导的发光量(积分值)，并可以计算其均值和标准差(SD)。当用实验受试者的血液样品处理过的细胞的TSH-诱导的发光量低于用正常个体群体的血液样品处理过的细胞TSH-诱导的发光量(积分值)的均值- nSD (例如，n = 1、2、3、4或5)时，可以确定实验受试者的甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的血清浓度高于正常个体的相应值。因而，所述实验受试者也可以被诊断为甲状腺功能减退。

此外，可以计算用实验受试者的血液样品处理过的细胞的发光量(积分值) / 用正常个体的血液样品处理过的细胞的发光量(积分值) × 100 (%)(在下文中，该计算的值被定义为计算的值E)。预先测量正常个体的大群体和未处理的甲状腺功能减退患者的大群体 (例如，50-100个体/群体)的各个血液样品引起的各自发光量(积分值)，并设定截止值，使得甲状腺功能减退的真阳性率和/或真阴性率(即，是正常个体)分别是，例如，80%或更高、90%或更高、92%或更高、94%或更高、96%或更高或98%或更高。当计算的值E低于截止值时，所述实验受试者也可以被诊断为甲状腺功能减退。根据目标群体的性质，诸如年龄和性别，可以适当地设置截止值，且可以设置为，例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。

此外，也使用具有已知浓度的抗体(TSBAb)标准品，且可以连续地稀释它的浓度，以制备校正曲线。参照校正曲线，从用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的测量发光量，计算抗体(TSBAb)的实际血清浓度。可以将该浓度与以前测量的每个正常个体的大群体和未处理的甲状腺功能减退患者的大群体 (例如，50-100个体/群体)的抗体(TSBAb)血清浓度相对比，或与文献中报道的已知数据等相对比，以诊断实验受试者是否具有甲状腺功能减退。例如，当该浓度高于正常个体群体的(TSBAb)血清浓度的均值+ nSD (例如，n = 1、2、3、4或5)时，所述实验受试者也可以被诊断为甲状腺功能减退。

此外，作为进行所述方法的结果，当用源自实验受试者血液的样品处理过的细胞所发出的钙敏感蛋白(例如，水母发光蛋白)的发光量低于用源自正常个体血液的样品处理过的细胞所发出的值、且高于用源自甲状腺功能减退患者的血液的样品处理过的细胞所发出的值时，所述实验受试者可以被诊断为具有发生甲状腺功能减退的高度危险的人。或者，可以测定抗体的血清浓度，并与甲状腺功能减退患者和/或正常个体的标准抗体浓度相对比，以确定实验受试者是否为具有发生甲状腺功能减退的高度危险的人。

此外，在步骤(2)中，加入在治疗之前和之后从相同甲状腺功能减退患者采取的样品，作为源自实验受试者血液的样品。可以在样品之间对比所述细胞所发出的钙敏感蛋白(例如，水母发光蛋白)的发光量，以确定治疗有效性。作为实验的结果，当在治疗之后采取的样品中钙敏感蛋白（诸如水母发光蛋白）的发光量高于在治疗之前采取的样品中的值时，可以确定所述治疗是有效的。

本发明另外提供了用于诊断甲状腺功能减退的方法，所述方法包括下述的步骤(A)至(C)：

(A) 制备混合物，所述混合物含有根据权利要求1-10中任一项所述的细胞、钙敏感蛋白的发光底物、含有Ca²⁺的培养基、TSH或刺激性的TSAb单克隆抗体和源自实验受试者血液的样品；

(B) 将福司柯林加入在(A)中制备的混合物中；和

(C) 定量从细胞发出的、钙敏感蛋白的发光。

在所述方法的步骤(A)中使用的含有Ca²⁺的培养基可以由本领域技术人员适当地选择，且可以是例如含有CaCl₂的培养基。此外，所述含有Ca²⁺的培养基可以另外含有可以替代钙的阳离子(例如，镉离子或锶离子)、镁离子、锌离子、硫酸根离子和/或碳酸根离子。本领域技术人员可以适当地设置在含有Ca²⁺的培养基中可以含有的Ca²⁺、可以替代钙的阳离子、镁离子、锌离子、硫酸根离子和碳酸根离子的浓度，使得所述细胞可以得到维持，且钙敏感蛋白（诸如水母发光蛋白）适当地发光。

在所述方法的步骤(A)中描述的物质的加入次序， 可以由本领域技术人员适当地设置。

本发明提供了，例如，用于诊断甲状腺功能减退(例如，桥本氏病)的方法，所述方法包括下述步骤：

(1) 在用钙敏感蛋白的发光底物处理过的含有Ca²⁺的培养基中，培养表达甲状腺刺激激素受体(TSHR)、cAMP依赖性的钙通道和钙敏感蛋白的细胞；

(2) 将源自实验受试者血液的样品与TSH一起加给培养的细胞，将其进一步培养；和

(3) 将福司柯林加给培养的细胞，并测量从细胞发出的、钙敏感蛋白的发光。

参照上述的用于诊断格雷夫氏病的方法，本领域技术人员可以适当地实现步骤(1)至(3)。

在某些情况下，在步骤(2)中，可以使用源自正常个体血液的样品作为阴性对照，和/或可以使用源自甲状腺功能减退患者的血液的样品作为阳性对照，并将它们各自分别加给细胞。此外，在步骤(2)中的温育时间没有限制，可以设定为10-120分钟，例如，10分钟。此外，在步骤(2)中， TSH可以是牛TSH。在某些情况下，作为TSH的替代或除了TSH以外，可以加入TSAb。TSAb可以是单克隆抗体。

在步骤(3)中，福司柯林的浓度可以由本领域技术人员适当地设置。

作为进行所述方法的结果，当用源自实验受试者血液的样品处理过的细胞所发出的钙敏感蛋白(例如，水母发光蛋白)的发光量高于用源自正常个体血液的样品处理过的细胞所发出的值时，所述实验受试者可以被诊断为甲状腺功能减退。此外，可以测定抗体的血清浓度，并与甲状腺功能减退患者和/或正常个体的标准抗体浓度相对比，以诊断实验受试者是否为甲状腺功能减退。

例如，测量用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量，和用与实验受试者的血液样品相同量的正常个体的血液样品(标准品)处理过的细胞所发出的发光量。当用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量高于用正常个体的血液样品(标准品)处理过的细胞所发出的发光量时，可以确定实验受试者的甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的血清浓度高于正常个体的相应值。因而，所述实验受试者可以被诊断为甲状腺功能减退。

此外，预先测量用正常个体的大群体（例如，50-100个正常个体）的血液样品处理过的细胞的各自发光量(积分值)，并可以计算其均值和标准差(SD)。当用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量高于用正常个体群体的血液样品处理过的细胞所发出的发光量(积分值)的均值+ nSD (例如，n = 1、2、3、4或5)时，可以确定实验受试者的甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的血清浓度高于正常个体的相应值。因而，所述实验受试者也可以被诊断为甲状腺功能减退。

此外，可以计算用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的发光量(积分值) / 用正常个体的血液样品处理过的细胞所发出的发光量(积分值) × 100 (%) (在下文中，该计算的值被定义为计算的值F)。预先测量正常个体的大群体和未处理的甲状腺功能减退患者的大群体 (例如，50-100个体/群体)的各个血液样品引起的各自发光量(积分值)，并设定截止值，使得甲状腺功能减退的真阳性率和/或真阴性率(即，是正常个体)分别是，例如，80%或更高、90%或更高、92%或更高、94%或更高、96%或更高或98%或更高。当计算的值F高于截止值时，所述实验受试者也可以被诊断为甲状腺功能减退。根据目标群体的性质，诸如年龄和性别，可以适当地设置截止值，且可以设置为，例如，150%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%或900%。

此外，也使用具有已知浓度的抗体(TSBAb)标准品，且可以连续地稀释它的浓度，以制备校正曲线。参照校正曲线，从用实验受试者的血液样品处理过的细胞所发出的测量发光量，计算抗体(TSBAb)的实际血清浓度。可以将该浓度与以前测量的每个正常个体的大群体和未处理的甲状腺功能减退患者的大群体 (例如，50-100个体/群体)的抗体(TSBAb)血清浓度相对比，或与文献中报道的已知数据等相对比，以诊断实验受试者是否具有甲状腺功能减退。例如，当该浓度高于正常个体群体的(TSBAb)血清浓度的均值+ nSD (例如，n = 1、2、3、4或5)时，所述实验受试者也可以被诊断为甲状腺功能减退。

此外，作为进行所述方法的结果，当用源自实验受试者血液的样品处理过的细胞所发出的钙敏感蛋白(例如，水母发光蛋白)的发光量高于用源自正常个体血液的样品处理过的细胞所发出的值、且低于用源自甲状腺功能减退患者的血液的样品处理过的细胞所发出的值时，所述实验受试者可以被诊断为具有发生甲状腺功能减退的高度危险的人。或者，可以测定抗体的血清浓度，并与甲状腺功能减退患者和/或正常个体的标准抗体浓度相对比，以确定实验受试者是否为具有发生甲状腺功能减退的高度危险的人。

此外，在步骤(2)中，加入在治疗之前和之后从相同甲状腺功能减退患者采取的样品，作为源自实验受试者血液的样品。可以在样品之间对比所述细胞所发出的钙敏感蛋白(例如，水母发光蛋白)的发光量，以确定治疗有效性。作为实验的结果，当在治疗之后采取的样品中钙敏感蛋白（诸如水母发光蛋白）的发光量低于在治疗之前采取的样品中的值时，可以确定所述治疗是有效的。

在下文中，将参照实施例进一步描述本发明。但是，本发明不限于它们。

实施例

1.  用于构建冷冻细胞的方法的细节

通过PCR 方法，从人甲状腺-衍生的cDNA文库扩增人甲状腺刺激激素受体的cDNA序列(Genbank No. NM_000369) (SEQ ID NO: 5)，并克隆进pUC18中。用BamHI切割克隆进pUC18中的hTSHR cDNA，，并重新克隆进pZeoSV2载体 (Invitrogen Corp.)中，以制备pZeoSV2 hTSHR。

通过PCR 方法，从小鼠嗅觉上皮细胞-衍生的cDNA文库扩增环核苷酸依赖性的钙通道的cDNA序列(Genbank No. BC048775) (SEQ ID NO: 4)，并克隆进1994-碱基对表达载体 (pCMVSPORT, Invitrogen Corp.)中，以制备pmCNGα2 (图18)。此外，为了提高cAMP 选择性和对其的灵敏度，通过点突变PCR 方法，制备了表达修饰的环核苷酸依赖性的钙通道的构建体pmCNGα2MW (SEQ ID NO: 6)，其中第460位半胱氨酸(C)被色氨酸(W)置换，且第583位谷氨酸(E)被甲硫氨酸(M)置换。此外，用限制性酶KpnI和NheI处理合成的脱辅基水母发光蛋白cDNA序列 (676碱基对) (SEQ ID NO: 7)，该序列通过寡DNA 延伸方法进行了人密码子选择优化，并具有线粒体靶向信号，然后克隆进用KpnI和NheI处理过的pcDNA3.1 (Invitrogen Corp.)中，以制备脱辅基水母发光蛋白表达载体pcDNA mt sAEQ (图19)。

以1.0×10⁵细胞/ml的细胞浓度，将CHO细胞接种进10-cm² 培养皿中。次日，使用FuGENE6 (TM) (Roche Applied Science)，用1 μg pZeoSV2 hTSHR、2 μg pmCNGα2MW和2 μg pcDNA mt sAEQ转染每个培养皿的细胞。次日，通过向培养皿中加入400 μL Versene溶液 (EDTA)，从培养皿解离细胞，并悬浮于含有10 mL 5% cFCS的DMEM/F12 培养基中。在1000 rpm离心得到的悬浮液5分钟。然后，以2-5 × 10⁶细胞/mL的浓度，将沉淀物溶解在1 mLCELLBANKER中，并在-80℃保存。

2. 使用冷冻细胞得到的牛TSH (bTSH)的浓度依赖性的曲线和最低检测灵敏度

在温浴中融化在1中制备的1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL 样品缓冲液 (130 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM MgCl₂、4.8 mM NaHCO₃、5% PEG6000、pH 7.4)中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将10 mL样品缓冲液加入得到的沉淀物中，并向其中加入7.5 μL 4 mM ViviRen (Promega Corp.)。以90 μL/孔的浓度，将混合物接种进96-孔板中。在CO₂气氛中在37℃培养3小时以后，以10 μL/孔的浓度，向其中加入用PBS连续稀释的bTSH (n = 6)，并培养细胞30分钟。然后，以50 μL/孔的浓度，向其中加入3 mM CaCl₂溶液，并使用光度计 (PerkinElmer Inc., ARVO-Sx; 在下文中，在实施例中使用相同的型号)测量发光量。bTSH 浓度依赖性的曲线如图1所示。

如图2(低浓度范围的放大图)所示，bTSH的最低检出量是0.16 μU/mL，所以检测的值能够与通过空白值+ 3SD计算出的值明显地区分开。此外，由于水母发光蛋白进行发光反应，通过本发明的方法得到高信号与空白之比 (信噪比) (即，100 μU/mL bTSH，大约45倍(9000000/200000)的信噪比)。

如图2(低浓度范围的放大图)所示，bTSH的最低检出量是0.16 μU/mL，所以检测的值能够与通过空白值+ 3SD计算出的值明显地区分开。因而，该灵敏度是比可从YAMASA CORP得到的现有试剂盒的灵敏度更高的数量级：bTSH的最低检出量是1 μU/mL (Atsuo Nagata, 等人: CLINICAL ENDOCRINOLOGY, 41: 1023, 1993)。

此外，由于水母发光蛋白进行发光反应，通过本发明的方法得到的高信号与空白之比 (信噪比) (即，100 μU/mL bTSH，大约45倍(9000000/200000)的信噪比)远远优于YAMASA试剂盒(100 μU/mL bTSH, SN = 7)的相应值。

3. 再现性研究

人格雷夫氏病患者-衍生的TSAb标准品：用正常个体血清稀释MRC研究标准品B 1966 长效甲状腺刺激因子 (NIBSC: 国家生物标准和控制研究所，代码65/122)，以制备H (1.88 mU LAST/ml)、M (1.25 mU LAST/ml)和L (0.94 mU LAST/ml)对照样品。将150 μL 30% PEG6000加入50 μL每种制备的对照血清中，搅拌混合物，然后4℃静置5分钟。在3000 rpm在4℃离心20分钟以后，将得到的沉淀物分别溶解在400 μL样品缓冲液中，以制备样品溶液。在温浴中融化在1中制备的1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL 样品缓冲液中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将10 mL样品缓冲液加入得到的沉淀物中，并向其中加入7.5 μL 4 mM ViviRen。以80 μL/孔的浓度，将混合物接种进96-孔板中。在CO₂气氛中在37℃培养3小时以后，以20 μL/孔的浓度，向其中分别加入制备的样品 (n = 2)，并培养细胞30分钟。然后，以50 μL/孔的浓度，向其中加入9 mM CaCl₂溶液，并使用光度计测量发光量。对比下述情况：同时纯化和测定每6个L、M和H样品的情况(运行内再现性)，在不同的10天独立地纯化和测定L、M和H样品的情况(运行间再现性)，和在同一天纯化和测定不同生产批次的L、M和H样品的情况(批次之间再现性)。除了测定样品以外，将使用YAMASA试剂盒分别评分的H (576 TSAb%)、M (342 TSAb%)和L (197 TSAb%)加入平板中，并绘制校正曲线。将从得到的回归线测定的值定义为样品浓度 (基于YAMASA试剂盒的TSAb%) (YAMASA TSAb% =样品值/正常个体血清值× 100 (%))。

表1

。

本发明的方法被证实会产生高再现性，因为测定系统具有高灵敏度和高信噪比。此外，5-6% CV证实，本发明的方法具有高批次之间再现性。使用CHO细胞和优化的转染条件，可以构建在不同批次之间几乎没有差异的测定系统。

已经报道，可从YAMASA CORP.得到的现有的TSAb试剂盒的再现性的CV值是10-15%，这证实了本发明的方法的高再现性。

此外，由于通过冷冻猪组织-衍生的甲状腺细胞来生产现有试剂盒，它的问题是，由于组织的来源猪之间的个体差异，批次之间的变动较大(批次之间的CV: 10-19%)。相反，本发明的方法被证实甚至在不同批次之间具有高再现性。

4. 加入水母发光蛋白发光底物(ViviRen)以后的温育时间研究

在温浴中融化在1中制备的1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL 样品缓冲液中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将10 mL样品缓冲液加入得到的沉淀物中，并向其中加入7.5 μL 4 mM ViviRen。在加入以后30分钟或1、2、3、4、5、6、7或8小时，以90 μL/孔的浓度，将混合物接种进96-孔板中。以10 μL/孔的浓度，向其中加入用PBS连续稀释的bTSH，并培养细胞30分钟。然后，以50 μL/孔的浓度，向其中加入9 mM CaCl₂溶液，并使用光度计测量发光量。

经证实，在ViviRen加入以后2小时，发光量达到高台（plateau）(参见图3)。

5. 在转染中使用的受体质粒的量的研究

将10 mL CHO细胞（浓度为1 × 10⁵细胞/mL）接种进10-cm² 培养皿中，并培养1天。然后，混合3 μg pcDNA mt sAEQ、1 μg pmCNGα2MW和0-1 μg pZeoSV2 TSHR 质粒，并与600 μL DMEM/F12和18 μL FuGENE6 (Roche Applied Science)进一步混合，并进行转染。进一步过夜培养以后，取出培养基，用10 mL PBS洗涤细胞。然后，向其中加入800 μL Versene，在37℃培养细胞5分钟，然后悬浮于10 mL DMEM/F12 cFCS中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将沉淀物溶解于10 mL DMEM/F12 cFCS中，并向其中加入6.5 μL 4 mM ViviRen。在37℃培养3小时以后，用PBS替换培养基，并以90 μL/孔的浓度，将培养物溶液接种至96-孔板。加入bTSH的浓度系列以后30分钟，以50 μL/孔的浓度，向其中加入3 mM CaCl₂溶液，并使用光度计测量发光量。

经证实，为了得到最佳的发光量，需要在转染中使用1 ug/平板的量的受体质粒(参见图4)。

6. 细胞浓度的优化

在温浴中融化在1中制备的1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL 样品缓冲液中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将10 mL样品缓冲液加入得到的沉淀物中。制备细胞系列，将其细胞浓度调节至3 × 10³细胞/mL至3 × 10⁵细胞/mL的浓度。向其中加入7.5 μL 4 mM ViviRen，并以90 μL/孔的浓度，将混合物接种进96-孔板中。在CO₂气氛中在37℃培养3小时以后，以10 μL/孔的浓度，向其中加入用PBS连续稀释的bTSH，并培养细胞30分钟。然后，以50 μL/孔的浓度，向其中加入9 mM CaCl₂溶液，并使用光度计测量发光量。

如图5和6所示，发光量以细胞浓度依赖性的方式增加。经证实，3 × 10⁵细胞/mL是最佳浓度，这基于其中将每个空白值定义为1的相对值。

7.  加入的CaCl₂检测溶液的浓度的研究

在温浴中融化在1中制备的1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL 样品缓冲液中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将10 mL样品缓冲液加入得到的沉淀物中，并向其中加入7.5 μL 4 mM ViviRen。以90 μL/孔的浓度，将混合物接种进96-孔板中。在CO₂气氛中在37℃培养3小时以后，以10 μL/孔的浓度，向其中加入用PBS连续稀释的bTSH，并培养细胞30分钟。然后，以50 μL/孔的浓度，向其中加入CaCl₂检测溶液 (终浓度: 0-30 mM)，并使用光度计测量发光量。

经证实，最佳CaCl₂浓度是3-6 mM，此时低值是在背景(0)，并在样品中得到高发光量(参见图7)。

8. 使用刺激抗体对照血清对稀释线性的研究

在温浴中融化在1中制备的1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL 样品缓冲液中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将10 mL样品缓冲液加入得到的沉淀物中，并向其中加入7.5 μL 4 mM ViviRen。以80 μL/孔的浓度，将混合物接种进96-孔板中。在CO₂气氛中在37℃培养细胞3小时。对用30% PEG6000纯化和稀释的阳性对照血清系列的IgG 级分(附着于Roche NIBSC 90/672上；40 IU/mL、13 IU/mL、8 IU/mL和4 IU/mL)，分别用样品缓冲液进行1/2、1/4、1/8、1/16或1/32倍稀释，以20 μL/孔的浓度，向其中加入每种溶液。培养30分钟以后，以50 μL/孔的浓度，向其中加入9 mM CaCl₂溶液，并使用光度计测量发光量。

如图8所示，经证实发光量线性地增加。

9. 用于检测甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的方法的研究

在温浴中融化在1中制备的1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL 样品缓冲液中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将10 mL样品缓冲液加入得到的沉淀物中，并向其中加入7.5 μL 4 mM ViviRen。以90 μL/孔的浓度，将混合物接种进96-孔板中。在CO₂气氛中在37℃培养3小时以后，以10 μL/孔的浓度，向其中分别加入用30% PEG6000纯化的甲状腺功能减退患者-衍生的甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb) 级分和正常个体血清-衍生的IgG 级分。同时，以10 μL/孔的浓度，向其中另外加入bTSH (终浓度: 100 μU-2.5 μU/mL)。培养30分钟以后，以50 μL/孔的浓度，向其中加入9 mM CaCl₂溶液，并使用光度计测量发光量。

经证实，在有2.5-10 μU/mL bTSH 存在下，在甲状腺功能减退患者-衍生的抗体级分中抑制了90%或更高的发光(参见图9)。在有100 μU/mL bTSH存在下，观察到大约50%抑制，证实根据竞争性bTSH的浓度而发生竞争性抑制 (参见图9)。

当检测阻断抗体时，在有bTSH存在下通常观察到信号的减小。已知常规方法具有下述缺点：即信噪比低至5-10倍，且由于低信噪比，测量范围变窄。相反，本发明的方法具有宽测量范围，使得在有或没有bTSH存在下的信噪比是50倍。因而，可以以高灵敏度检测阻断抗体。

10. 通过细胞脱敏作用检测甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的方法的研究

在温浴中融化在1中制备的1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL 样品缓冲液中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将10 mL 含有钙的DMEM/F12 cFCS 培养基加入得到的沉淀物中，并向其中加入7.5 μL 4 mM ViviRen。以90 μL/孔的浓度，将混合物接种进96-孔板中。在CO₂气氛中在37℃培养3小时以后，以10 μL/孔的浓度，向其中分别加入用30% PEG6000纯化的甲状腺功能减退患者-衍生的甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb) 级分和正常个体血清-衍生的IgG 级分。同时，以10 μL/孔的浓度，另外加入bTSH (终浓度: 100 μU-2.5 μU/mL)。培养30分钟以后，以50 μL/孔的浓度，向其中加入10^-4 M 福司柯林溶液，并使用光度计测量发光量。

在图10中，在有5 μU或更低浓度的bTSH存在下，由于脱敏作用不足，没有观察到阻断抗体和正常个体样品之间的差异。但是，在有100 μU bTSH存在下，正常个体血清中的发光量减少，并在有阻断抗体存在下，观察到增加的发光量，这证实了根据本发明的方法，使用脱敏作用，可以检测阻断抗体的存在与否。

根据本发明的方法在有或没有阻断抗体存在下的发光机理

在该条件下，在向细胞添加bTSH时，钙存在于培养基中；因而，在没有阻断抗体存在下，在加入bTSH以后立即发生发光反应，如在正常个体血清中所看到的。相反，在有阻断抗体(TSBAb)存在下，TSBAb会抑制bTSH的作用，使得发光反应不会发生。在该状态，在随后加入活化腺苷酸环化酶的福司柯林以后，形成cAMP，以造成发光，无需TSH受体的介导。但是，在没有TSBAb存在下，经由bTSH活化的腺苷酸环化酶已经发生一次的发光反应已经使细胞脱敏。因而，即使另外加入福司柯林作为第二种刺激物，也不会发生发光。相反，在有TSBAb存在下，阻断抗体会阻止bTSH免于活化腺苷酸环化酶。因而，在随后加入福司柯林以后，形成cAMP，以造成发光反应。

讨论

使用相对于正常个体的抑制百分比，指示用于检测阻断抗体的常规方法。但是，使用抑制百分比进行指示的问题是，在90%或更高的高浓度范围内，缺少定量可靠性。

通过相对于正常个体的发光量的增加，可以指示本发明的使用细胞脱敏作用和福司柯林的方法。因而，没有确定上限，甚至在高浓度范围内可以线性地检测阻断抗体的存在与否。

11. 与使用刺激抗体标准品的现有试剂盒的灵敏度对比

在温浴中融化在1中制备的1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL 样品缓冲液中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将10 mL样品缓冲液加入得到的沉淀物中，并向其中加入7.5 μL 4 mM ViviRen。以90 μL/孔的浓度，将混合物接种进96-孔板中。用正常个体血清稀释MRC 参照标准品B 1966 (NIBSC 65/122)，以制备浓度系列。将150 μL 30% PEG6000加入在制备的系列中的50 μL每种对照样品，搅拌混合物，然后在4℃静置5分钟。在3000 rpm在4℃离心20分钟以后，将得到的沉淀物分别溶解在50 μL样品缓冲液中，以制备样品溶液。在CO₂气氛中在37℃培养3小时以后，以10 μL/孔的浓度，向其中分别加入样品溶液，并培养细胞30分钟。以50 μL/孔的浓度，向其中加入9 mM CaCl₂检测溶液，并使用光度计测量发光量。

还显示了使用猪甲状腺的现有的YAMASA试剂盒单独测量的值。现有的YAMASA试剂盒产生200 TSAb%（在0.94 mU LAST/mL），没有检测出低于该灵敏度阈值的浓度。相反，本发明的方法被证实能够检测刺激抗体，在0.94 mU LAST/mL时为2018 TSAb%，甚至在0.06 mU LAST/mL时为242 TSAb%，且能够以高灵敏度检测刺激抗体，所述灵敏度是现有试剂盒的灵敏度的约16倍(参见图11)。

12. 使用冷冻细胞的试剂盒对发光的时间-依赖性的变化的研究

在温浴中融化在1中制备的1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL 样品缓冲液(130 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM MgCl₂、4.8 mM NaHCO₃、5% PEG6000、pH 7.4) 中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将10 mL样品缓冲液加入得到的沉淀物中，并向其中加入7.5 μL 4 mM ViviRen (Promega Corp.)。以90 μL/孔的浓度，将混合物接种进96-孔板中。在CO₂气氛中在37℃培养3小时以后，以10 μL/孔的浓度，向其中分别加入用30% PEG6000纯化的H (高值)、M (中间值)和L (低值)样品 (n = 6)。培养30分钟以后，以50 μL/孔的浓度，向其中加入9 mM CaCl₂溶液，并搅拌3 秒。然后，使用光度计，测量在13 秒时间内的发光量。结果，如图12所示，一加入CaCl₂溶液，就观察到相对稳定的发光。

13. 甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的定量可靠性的研究

(1) 使用针对bTSH的竞争性抑制检测甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的方法

在温浴中融化在1中制备的1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL 样品缓冲液(130 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM MgCl₂、4.8 mM NaHCO₃、5% PEG6000、pH 7.4) 中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将10 mL样品缓冲液加入得到的沉淀物中，并向其中加入7.5 μL 4 mM ViviRen (Promega Corp.)。在CO₂气氛中在37℃培养3小时以后，将90 μL细胞溶液与10 μL每种样品相混合，所述样品在用30% PEG6000纯化的甲状腺功能减退患者-衍生的阻断抗体的稀释系列中，并培养30分钟。然后，以50 μL/孔的浓度，向其中加入9 mM CaCl₂溶液，并使用光度计测量发光量。

如图13所示，使用该冷冻细胞，定量地检测出甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)。

(2) 使用细胞脱敏作用检测甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的方法的浓度依赖性 

在温浴中融化在1中制备的1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL 样品缓冲液(3 mM CaCl₂、130 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM MgCl₂、4.8 mM NaHCO₃、5% PEG6000、pH 7.4) 中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将10 mL样品缓冲液加入得到的沉淀物中，并向其中加入7.5 μL 4 mM ViviRen (Promega Corp.)。以90 μL/孔的浓度，将混合物接种进96-孔板中。以10 μL/孔的浓度，向其中加入每个样品，所述样品在用30% PEG6000纯化的甲状腺功能减退患者-衍生的阻断抗体的稀释系列中，并另外，以10 μL/孔的浓度，向其中加入bTSH溶液 (终浓度: 100 μL/mL)。在CO₂气氛中在37℃培养30分钟以后，以50 μL/孔的浓度，向其中加入10^-4 M 福司柯林溶液，并使用光度计测量发光量。

如图14所示，使用该冷冻细胞，以浓度依赖性的方式检测出甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)。

14. 甲状腺刺激抗体(TSAb)或甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的作用持续时间(温育时间)的研究

(1) 用于检测刺激抗体(TSAb)的方法

在温浴中融化在1中制备的1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL 样品缓冲液(130 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM MgCl₂、4.8 mM NaHCO₃、5% PEG6000、pH 7.4) 中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将10 mL样品缓冲液加入得到的沉淀物中，并向其中加入7.5 μL 4 mM ViviRen (Promega Corp.)。以90 μL/孔的浓度，将混合物接种进96-孔板中。以10 μL/孔的浓度，向其中分别加入用30% PEG6000纯化的高值(H)、中间值(M)、低值(L)和正常个体(N)血清样品。培养30分钟至1.5小时以后，以50 μL/孔的浓度，向其中加入9 mM CaCl₂溶液，并使用光度计测量发光量。

如图15所示，在刺激抗体(TSAb)对根据本发明的细胞作用30分钟至1小时的持续时间以后，发光量达到高台。

(2) 使用针对bTSH的竞争性抑制检测甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的方法中的作用持续时间研究

在温浴中融化在1中制备的1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL 样品缓冲液(130 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM MgCl₂、4.8 mM NaHCO₃、5% PEG6000、pH 7.4) 中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将10 mL样品缓冲液加入得到的沉淀物中，并向其中加入7.5 μL 4 mM ViviRen (Promega Corp.)。以90 μL/孔的浓度，将混合物接种进96-孔板，并培养细胞3小时。以10 μL/孔的浓度，向其中分别加入用30% PEG6000纯化的甲状腺功能减退患者-衍生的血清样品和正常个体血清样品，并另外以10 μL/孔的浓度，向其中加入bTSH溶液 (终浓度: 10 μU/mL)。培养10分钟至2小时以后，以50 μL/孔的浓度，向其中加入9 mM CaCl₂溶液，并使用光度计测量发光量。

如图16所示，在bTSH (与阻断抗体(TSBAb)竞争)对根据本发明的细胞作用30分钟的持续时间以后，发光量达到高台。

(3) 使用细胞脱敏作用检测甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)的方法

在温浴中融化在1中制备的1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL无CO₂的培养基(目录号18045, Invitrogen Corp.)。在1000 rpm 离心5分钟以后，将10 mL无CO₂的培养基加入得到的沉淀物中，并向其中加入7.5 μL 4 mM ViviRen (Promega Corp.)。以90 μL/孔的浓度，将混合物接种进96-孔板，并培养细胞3小时。以10 μL/孔的浓度，向其中分别加入用30% PEG6000纯化的甲状腺功能减退患者-衍生的血清样品和正常个体血清样品，并另外以10 μL/孔的浓度，向其中加入bTSH溶液(终浓度: 100 μU/mL)。培养10分钟至2小时以后，以50 μL/孔的浓度，向其中加入10^-4 M 福司柯林溶液，并使用光度计测量发光量。

如图17所示，在bTSH (与阻断抗体(TSBAb)竞争)对根据本发明的细胞作用10分钟的持续时间以后，发光量达到高台。

15. 使用不同甲状腺疾病患者样品的测定法

使用在1中制备的冷冻细胞和本发明提供的下述的格雷夫氏病诊断试剂盒（其含有用于细胞培养的培养基、细胞洗涤溶液、ViviRen、钙溶液、山羊抗-hTSH抗体、对照血清和96-孔板），研究不同甲状腺疾病患者组中的血清TSAb活性。具体地，使用198个未治疗的格雷夫氏病患者、18个甲状腺功能减退患者、48个正常个体、2个普卢默病病例、6 个产后甲状腺炎病例、22个无痛的甲状腺炎病例和22 亚急性甲状腺炎病例（他们都在临床上确诊）的血清 (参见表2)。将150 μL 30% PEG6000 加入每个患者的50 μL血清中，搅拌混合物，然后在4℃静置5分钟。在3000 rpm在4℃离心20分钟以后，将得到的沉淀物分别溶解于400 μL用于细胞培养的培养基 (5% PEG6000、不依赖CO₂的培养基 (氯化钙、D-泛酸钙、L-谷氨酰胺、无酚红、Invitrogen Corp.)) 中，以制备样品溶液。以10 μL/孔的浓度，将样品溶液分别加入96-孔板中(n = 2)。在温浴中融化1 ml (3 × 10⁶细胞/ml)冷冻细胞，并悬浮于10 mL 细胞洗涤溶液 (无CO₂的培养基)中。在1000 rpm 离心5分钟以后，将12 mL 用于细胞培养的培养基加入得到的沉淀物中，以制备细胞溶液。将7.5 μL 4 mM ViviRen加入细胞溶液中，并以90 μL/孔的浓度，将混合物接种进96-孔板中。培养4小时以后，以100 μL/孔的浓度，向其中加入3 mM钙溶液，并使用光度计测量发光量。在甲状腺功能减退患者中，一位患者在血清中具有高hTSH 值。因而，为了中和hTSH的作用，将1.2 μL山羊抗-hTSH 多克隆抗体(Meridian Life Science, Inc.)加入用于细胞培养的培养基中，并在该条件下进行测定。基于单点校正曲线（其如下得到：通过将用正常个体血清稀释的含有NIBSC 65/122的对照血清的测量值(1.874 mU LAST/mL)定义为1800），计算每位患者的测量值。此外，使用现有试剂盒(TSAb kit, YAMASA CORP.)，根据在所述试剂盒中包含的说明书，测定上述相同患者的血清。

从正常个体的血清TSAb 值，设置TSAb 截止值。48个正常个体的血清TSAb 值的频率分布如图20所示。所述正常个体的值的平均值是124 ± 34，显示为正态分布。将截止值设定为平均值 + 3SD = 180。

每个甲状腺疾病的TSAb 值如图21所示。195/198的未治疗的格雷夫氏病病例显示为阳性(98%)。3 个甲状腺功能减退病例显示为阳性，每个无痛的甲状腺炎病例和产后甲状腺炎病例显示为阳性。在表3中，使用198个未治疗的格雷夫氏病患者，在现有试剂盒和本发明的试剂盒中，研究了格雷夫氏病的真阳性率。现有试剂盒的真阳性率是68%，本发明提供的试剂盒的真阳性率是98%，这证实了本发明的试剂盒在格雷夫氏病检测灵敏度方面远远优于现有试剂盒。

表2

。

表3

。

工业实用性

本发明可以提供用于测定TSH受体抗体的方法和试剂盒，它们是容易操作的，且是安全的。因而，可以诊断出甲状腺疾病。

本申请是基于日本专利申请号2009-155183并要求它的优先权，它的整个内容特此通过引用并入。

                         序列表

<110>  Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.

<120>  用于测量抗TSH受体的抗体的生物测定法和试剂盒以及用于它们的新颖的重组细胞

<130>  669763

<150>  JP 2009-155183

<151>  2009-06-30

<160>  7    

<170>  PatentIn version 3.2

<210>  1

<211>  764

<212>  PRT

<213>  人

<400>  1

Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro

1               5                   10                  15     

Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His

            20                  25                  30         

Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro

        35                  40                  45             

Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu

    50                  55                  60                 

Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg

65                  70                  75                  80 

Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser

                85                  90                  95     

Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg

            100                 105                 110        

Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu

        115                 120                 125            

Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu

    130                 135                 140                

Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp

145                 150                 155                 160

Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys

                165                 170                 175    

Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val

            180                 185                 190        

Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn

        195                 200                 205            

Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val

    210                 215                 220                

Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala

225                 230                 235                 240

Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn

                245                 250                 255    

Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu

            260                 265                 270        

Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn

        275                 280                 285            

Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser

    290                 295                 300                

Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser

305                 310                 315                 320

Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly

                325                 330                 335    

Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr

            340                 345                 350        

Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln

        355                 360                 365            

Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His

    370                 375                 380                

Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro

385                 390                 395                 400

Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe

                405                 410                 415    

Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn

            420                 425                 430        

Val Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Asn Val

        435                 440                 445            

Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly

    450                 455                 460                

Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu

465                 470                 475                 480

Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr

                485                 490                 495    

Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu

            500                 505                 510        

Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Arg

        515                 520                 525            

Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Cys Ala Ile Met Val Gly

    530                 535                 540                

Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile

545                 550                 555                 560

Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr

                565                 570                 575    

Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val

            580                 585                 590        

Ala Phe Val Ile Val Cys Cys Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val

        595                 600                 605            

Arg Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys

    610                 615                 620                

Arg Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Ile Cys Met Ala Pro Ile

625                 630                 635                 640

Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val

                645                 650                 655    

Ser Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys

            660                 665                 670        

Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp

        675                 680                 685            

Val Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln

    690                 695                 700                

Ala Tyr Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln

705                 710                 715                 720

Val Gln Lys Val Thr His Glu Met Arg Gln Gly Leu His Asn Met Glu

                725                 730                 735    

Asp Val Tyr Glu Leu Ile Glu Asn Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln

            740                 745                 750        

Gly Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val Leu

        755                 760                

<210>  2

<211>  664

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223> 修饰的CNG α2

<400>  2

Met Met Thr Glu Lys Ser Asn Gly Val Lys Ser Ser Pro Ala Asn Asn

1               5                   10                  15     

His Asn His His Pro Pro Pro Ser Ile Lys Ala Asn Gly Lys Asp Asp

            20                  25                  30         

His Arg Ala Gly Ser Arg Pro Gln Ser Val Ala Ala Asp Asp Asp Thr

        35                  40                  45             

Ser Ser Glu Leu Gln Arg Leu Ala Glu Met Asp Thr Pro Arg Arg Gly

    50                  55                  60                  

Arg Gly Gly Phe Arg Arg Ile Val Arg Leu Val Gly Ile Ile Arg Asp

65                  70                  75                  80 

Trp Ala Asn Lys Asn Phe Arg Glu Glu Glu Pro Arg Pro Asp Ser Phe

                85                  90                  95     

Leu Glu Arg Phe Arg Gly Pro Glu Leu Gln Thr Val Thr Thr His Gln

            100                 105                 110        

Gly Asp Gly Lys Gly Asp Lys Asp Gly Glu Gly Lys Gly Thr Lys Lys

        115                 120                 125            

Lys Phe Glu Leu Phe Val Leu Asp Pro Ala Gly Asp Trp Tyr Tyr Arg

    130                 135                 140                

Trp Leu Phe Val Ile Ala Met Pro Val Leu Tyr Asn Trp Cys Leu Leu

145                 150                 155                 160

Val Ala Arg Ala Cys Phe Ser Asp Leu Gln Arg Asn Tyr Phe Val Val

                165                 170                 175    

Trp Leu Val Leu Asp Tyr Phe Ser Asp Thr Val Tyr Ile Ala Asp Leu

            180                 185                 190        

Ile Ile Arg Leu Arg Thr Gly Phe Leu Glu Gln Gly Leu Leu Val Lys

        195                 200                 205            

Asp Pro Lys Lys Leu Arg Asp Asn Tyr Ile His Thr Leu Gln Phe Lys

    210                 215                 220                

Leu Asp Val Ala Ser Ile Ile Pro Thr Asp Leu Ile Tyr Phe Ala Val

225                 230                 235                 240

Gly Ile His Ser Pro Glu Val Arg Phe Asn Arg Leu Leu His Phe Ala

                245                 250                 255    

Arg Met Phe Glu Phe Phe Asp Arg Thr Glu Thr Arg Thr Ser Tyr Pro

            260                 265                 270        

Asn Ile Phe Arg Ile Ser Asn Leu Val Leu Tyr Ile Leu Val Ile Ile

        275                 280                 285            

His Trp Asn Ala Cys Ile Tyr Tyr Ala Ile Ser Lys Ser Ile Gly Phe

    290                 295                 300                

Gly Val Asp Thr Trp Val Tyr Pro Asn Ile Thr Asp Pro Glu Tyr Gly

305                 310                 315                 320

Tyr Leu Ala Arg Glu Tyr Ile Tyr Cys Leu Tyr Trp Ser Thr Leu Thr

                325                 330                 335    

Leu Thr Thr Ile Gly Glu Thr Pro Pro Pro Val Lys Asp Glu Glu Tyr

            340                 345                 350        

Leu Phe Val Ile Phe Asp Phe Leu Ile Gly Val Leu Ile Phe Ala Thr

        355                 360                 365            

Ile Val Gly Asn Val Gly Ser Met Ile Ser Asn Met Asn Ala Thr Arg

    370                 375                 380                

Ala Glu Phe Gln Ala Lys Ile Asp Ala Val Lys His Tyr Met Gln Phe

385                 390                 395                 400

Arg Lys Val Ser Lys Asp Met Glu Ala Lys Val Ile Lys Trp Phe Asp

                405                 410                 415    

Tyr Leu Trp Thr Asn Lys Lys Thr Val Asp Glu Arg Glu Val Leu Lys

            420                 425                 430        

Asn Leu Pro Ala Lys Leu Arg Ala Glu Ile Ala Ile Asn Val His Leu

        435                 440                 445            

Ser Thr Leu Lys Lys Val Arg Ile Phe Gln Asp Trp Glu Ala Gly Leu

    450                 455                 460                

Leu Val Glu Leu Val Leu Lys Leu Arg Pro Gln Val Phe Ser Pro Gly

465                 470                 475                 480

Asp Tyr Ile Cys Arg Lys Gly Asp Ile Gly Lys Glu Met Tyr Ile Ile

                485                 490                 495    

Lys Glu Gly Lys Leu Ala Val Val Ala Asp Asp Gly Val Thr Gln Tyr

            500                 505                 510        

Ala Leu Leu Ser Ala Gly Ser Cys Phe Gly Glu Ile Ser Ile Leu Asn

        515                 520                 525            

Ile Lys Gly Ser Lys Met Gly Asn Arg Arg Thr Ala Asn Ile Arg Ser

    530                 535                 540                

Leu Gly Tyr Ser Asp Leu Phe Cys Leu Ser Lys Asp Asp Leu Met Glu

545                 550                 555                 560

Ala Val Thr Glu Tyr Pro Asp Ala Lys Lys Val Leu Glu Glu Arg Gly

                565                 570                 575    

Arg Glu Ile Leu Met Lys Met Gly Leu Leu Asp Glu Asn Glu Val Ala

            580                 585                 590        

Ala Ser Met Glu Val Asp Val Gln Glu Lys Leu Glu Gln Leu Glu Thr

        595                 600                 605            

Asn Met Glu Thr Leu Tyr Thr Arg Phe Ala Arg Leu Leu Ala Glu Tyr

    610                 615                 620                

Thr Gly Ala Gln Gln Lys Leu Lys Gln Arg Ile Thr Val Leu Glu Thr

625                 630                 635                 640

Lys Met Lys Gln Asn His Glu Asp Asp Tyr Leu Ser Asp Gly Ile Asn

                645                 650                 655    

Thr Pro Glu Pro Ala Val Ala Glu

            660                

<210>  3

<211>  228

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223> 修饰的水母发光蛋白

<400>  3

Met Ser Val Leu Thr Pro Leu Leu Leu Arg Gly Leu Thr Gly Ser Ala

1               5                   10                  15     

Arg Arg Leu Pro Val Pro Arg Ala Lys Ile His Ser Leu Pro Pro Glu

            20                  25                  30         

Gly Lys Leu Gly Ile Met Lys Val Lys Leu Thr Ser Asp Phe Asp Asn

        35                  40                  45             

Pro Lys Trp Ile Gly Arg His Lys His Met Phe Asn Phe Leu Asp Val

    50                  55                  60                 

Asn His Asn Gly Arg Ile Ser Leu Asp Glu Met Val Tyr Lys Ala Ser

65                  70                  75                  80 

Asp Ile Val Ile Asn Asn Leu Gly Ala Thr Pro Glu Gln Ala Lys Arg

                85                  90                  95     

His Lys Asp Ala Val Glu Ala Phe Phe Gly Gly Ala Gly Met Lys Tyr

            100                 105                 110        

Gly Val Glu Thr Glu Trp Pro Glu Tyr Ile Glu Gly Trp Lys Arg Leu

        115                 120                 125            

Ala Thr Glu Glu Leu Glu Arg Tyr Ser Lys Asn Gln Ile Thr Leu Ile

    130                 135                 140                

Arg Leu Trp Gly Asp Ala Leu Phe Asp Ile Ile Asp Lys Asp Gln Asn

145                 150                 155                 160

Gly Ala Ile Thr Leu Asp Glu Trp Lys Ala Tyr Thr Lys Ser Ala Gly

                165                 170                 175    

Ile Ile Gln Ser Ser Glu Asp Cys Glu Glu Thr Phe Arg Val Cys Asp

            180                 185                 190        

Ile Asp Glu Ser Gly Gln Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His

        195                 200                 205            

Leu Gly Phe Trp Tyr Thr Met Asp Pro Ala Cys Glu Lys Leu Tyr Gly

    210                 215                 220                

Gly Ala Val Pro

225            

<210>  4

<211>  1995

<212>  DNA

<213>  小家鼠

<400>  4

atgatgaccg aaaaatccaa cggtgtgaag agctctccag ctaataacca taaccatcat     60

cctcctcctt ctatcaaggc caatggcaaa gatgaccaca gggcaggtag cagaccacag    120

tctgtggcag ctgatgatga cacttcctca gaactgcaaa ggttggcaga gatggatact    180

ccacgcaggg gaaggggtgg cttccgaagg attgtccgcc tggtggggat catcagagac    240

tgggccaaca aaaatttccg tgaggaggaa ccaagacctg actccttcct agagcgtttc    300

cgtgggcctg agctccagac tgtgacaacc catcaggggg atggcaaagg cgacaaggac    360

ggcgagggaa agggcaccaa aaagaaattt gaactgtttg ttttggaccc agctggagac    420

tggtattacc gttggttgtt tgtcattgcc atgcctgttc tttacaactg gtgtctgttg    480

gtagccagag cctgcttcag tgatctacag agaaactatt ttgtggtatg gctggtgctg    540

gattacttct cagacactgt ttatattgca gacctcatca ttcggctgcg cacaggcttc    600

ctagaacaag ggctcctggt caaagacccc aagaaattgc gagacaacta tatccacact    660

ttgcagttca aattggatgt ggcttctatc atccccactg acctcattta ttttgctgtg    720

ggtatccaca gccctgaggt acgctttaat cgtctgttac actttgcccg tatgtttgag    780

ttctttgacc gcactgagac acgtacaagc taccccaaca tcttccgaat cagcaacctg    840

gtcctctaca tcttggtcat catccactgg aatgcttgta tttactatgc tatctctaag    900

tccattggct ttggggttga cacctgggtt taccccaaca ttactgaccc tgaatatggc    960

tacctggcta gggagtacat ttactgcctt tactggtcca cactgaccct caccaccatt   1020

ggagagacac caccccctgt aaaggatgag gagtacctat ttgtcatctt tgacttcctg   1080

attggtgtcc tcatctttgc cactattgtg ggaaatgtgg gctccatgat ctccaacatg   1140

aatgccacac gagcagagtt ccaggccaag attgatgctg tcaaacacta catgcagttc   1200

cgaaaggtca gtaaagacat ggaagccaag gtcatcaaat ggtttgacta cttgtggacc   1260

aataagaaga cagtagatga acgagaagtc ctaaagaacc tgcctgcaaa gcttagggca   1320

gagatagcca ttaatgttca tttgtccact ctgaagaaag tgcgcatatt ccaggattgt   1380

gaagctggcc tgctggtgga actggtactg aagcttcgtc ctcaggtctt tagtcctgga   1440

gattatattt gccgtaaggg ggacattggc aaggaaatgt acatcatcaa ggagggcaaa   1500

ttggcagtgg tagctgatga tggtgtgact cagtatgcct tgctgtcagc tgggagctgc   1560

tttggtgaga ttagtatcct taacattaag ggtagcaaaa tgggcaatcg gcgcactgcc   1620

aatatccgta gtctgggcta ctcagatctc ttctgcttgt ccaaggatga tcttatggaa   1680

gctgtgactg agtatcctga tgccaagaaa gtcctggaag aacggggtag ggagatcctg   1740

atgaaggaag gtctactgga tgagaatgaa gtggcagcta gtatggaggt agatgttcag   1800

gagaagctgg agcagctgga gacaaacatg gagaccttgt acactcgttt tgcccgcctg   1860

ctggctgagt acactggagc ccagcagaag ctcaaacagc gcatcacagt gctggagacc   1920

aagatgaaac agaaccatga ggatgattac ctatcagatg ggataaacac ccctgagcca   1980

gctgttgctg aatag                                                    1995

<210>  5

<211>  2301

<212>  DNA

<213>  人

<400>  5

tggaaaatga ggccggcgga cttgctgcag ctggtgctgc tgctcgacct gcccagggac     60

ctgggcggaa tggggtgttc gtctccaccc tgcgagtgcc atcaggagga ggacttcaga    120

gtcacctgca aggatattca acgcatcccc agcttaccgc ccagtacgca gactctgaag    180

cttattgaga ctcacctgag aactattcca agtcatgcat tttctaatct gcccaatatt    240

tccagaatct acgtatctat agatgtgact ctgcagcagc tggaatcaca ctccttctac    300

aatttgagta aagtgactca catagaaatt cggaatacca ggaacttaac ttacatagac    360

cctgatgccc tcaaagagct ccccctccta aagttccttg gcattttcaa cactggactt    420

aaaatgttcc ctgacctgac caaagtttat tccactgata tattctttat acttgaaatt    480

acagacaacc cttacatgac gtcaatccct gtgaatgctt ttcagggact atgcaatgaa    540

accttgacac tgaagctgta caacaatggc tttacttcag tccaaggata tgctttcaat    600

gggacaaagc tggatgctgt ttacctaaac aagaataaat acctgacagt tattgacaaa    660

gatgcatttg gaggagtata cagtggacca agcttgctgg acgtgtctca aaccagtgtc    720

actgcccttc catccaaagg cctggagcac ctgaaggaac tgatagcaag aaacacctgg    780

actcttaaga aacttccact ttccttgagt ttccttcacc tcacacgggc tgacctttct    840

tacccaagcc actgctgtgc ttttaagaat cagaagaaaa tcagaggaat ccttgagtcc    900

ttgatgtgta atgagagcag tatgcagagc ttgcgccaga gaaaatctgt gaatgccttg    960

aatagccccc tccaccagga atatgaagag aatctgggtg acagcattgt tgggtacaag   1020

gaaaagtcca agttccagga tactcataac aacgctcatt attacgtctt ctttgaagaa   1080

caagaggatg agatcattgg ttttggccag gagctcaaaa acccccagga agagactcta   1140

caagcttttg acagccatta tgactacacc atatgtgggg acagtgaaga catggtgtgt   1200

acccccaagt ccgatgagtt caacccgtgt gaagacataa tgggctacaa gttcctgaga   1260

attgtggtgt ggttcgttag tctgctggct ctcctgggca atgtctttgt cctgcttatt   1320

ctcctcacca gccactacaa actgaacgtc ccccgctttc tcatgtgcaa cctggccttt   1380

gcggatttct gcatggggat gtacctgctc ctcatcgcct ctgtagacct ctacactcac   1440

tctgagtact acaaccatgc catcgactgg cagacaggcc ctgggtgcaa cacggctggt   1500

ttcttcactg tctttgcaag cgagttatcg gtgtatacgc tgacggtcat caccctggag   1560

cgctggtatg ccatcacctt cgccatgcgc ctggaccgga agatccgcct caggcacgca   1620

tgtgccatca tggttggggg ctgggtttgc tgcttccttc tcgccctgct tcctttggtg   1680

ggaataagta gctatgccaa agtcagtatc tgcctgccca tggacaccga gacccctctt   1740

gctctggcat atattgtttt tgttctgacg ctcaacatag ttgccttcgt catcgtctgc   1800

tgctgttatg tgaagatcta catcacagtc cgaaatccgc agtacaaccc aggggacaaa   1860

gataccaaaa ttgccaagag gatggctgtg ttgatcttca ccgacttcat atgcatggcc   1920

ccaatctcat tctatgctct gtcagcaatt ctgaacaagc ctctcatcac tgttagcaac   1980

tccaaaatct tgctggtact cttctatcca cttaactcct gtgccaatcc attcctctat   2040

gctattttca ccaaggcctt ccagagggat gtgttcatcc tactcagcaa gtttggcatc   2100

tgtaaacgcc aggctcaggc ataccggggg cagagggttc ctccaaagaa cagcactgat   2160

attcaggttc aaaaggttac ccacgagatg aggcagggtc tccacaacat ggaagatgtc   2220

tatgaactga ttgaaaactc ccatctaacc ccaaagaagc aaggccaaat ctcagaagag   2280

tatatgcaaa cggttttgta a                                             2301

<210>  6

<211>  1995

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223> 修饰的CNG α2

<400>  6

atgatgaccg aaaaatccaa cggtgtgaag agctctccag ctaataacca taaccatcat     60

cctcctcctt ctatcaaggc caatggcaaa gatgaccaca gggcaggtag cagaccacag    120

tctgtggcag ctgatgatga cacttcctca gaactgcaaa ggttggcaga gatggatact    180

ccacgcaggg gaaggggtgg cttccgaagg attgtccgcc tggtggggat catcagagac    240

tgggccaaca aaaatttccg tgaggaggaa ccaagacctg actccttcct agagcgtttc    300

cgtgggcctg agctccagac tgtgacaacc catcaggggg atggcaaagg cgacaaggac    360

ggcgagggaa agggcaccaa aaagaaattt gaactgtttg ttttggaccc agctggagac    420

tggtattacc gttggttgtt tgtcattgcc atgcctgttc tttacaactg gtgtctgttg    480

gtagccagag cctgcttcag tgatctacag agaaactatt ttgtggtatg gctggtgctg    540

gattacttct cagacactgt ttatattgca gacctcatca ttcggctgcg cacaggcttc    600

ctagaacaag ggctcctggt caaagacccc aagaaattgc gagacaacta tatccacact    660

ttgcagttca aattggatgt ggcttctatc atccccactg acctcattta ttttgctgtg    720

ggtatccaca gccctgaggt acgctttaat cgtctgttac actttgcccg tatgtttgag    780

ttctttgacc gcactgagac acgtacaagc taccccaaca tcttccgaat cagcaacctg    840

gtcctctaca tcttggtcat catccactgg aatgcttgta tttactatgc tatctctaag    900

tccattggct ttggggttga cacctgggtt taccccaaca ttactgaccc tgaatatggc    960

tacctggcta gggagtacat ttactgcctt tactggtcca cactgaccct caccaccatt   1020

ggagagacac caccccctgt aaaggatgag gagtacctat ttgtcatctt tgacttcctg   1080

attggtgtcc tcatctttgc cactattgtg ggaaatgtgg gctccatgat ctccaacatg   1140

aatgccacac gagcagagtt ccaggccaag attgatgctg tcaaacacta catgcagttc   1200

cgaaaggtca gtaaagacat ggaagccaag gtcatcaaat ggtttgacta cttgtggacc   1260

aataagaaga cagtagatga acgagaagtc ctaaagaacc tgcctgcaaa gcttagggca   1320

gagatagcca ttaatgttca tttgtccact ctgaagaaag tgcgcatatt ccaggattgg   1380

gaagctggcc tgctggtgga actggtactg aagcttcgtc ctcaggtctt tagtcctgga   1440

gattatattt gccgtaaggg ggacattggc aaggaaatgt acatcatcaa ggagggcaaa   1500

ttggcagtgg tagctgatga tggtgtgact cagtatgcct tgctgtcagc tgggagctgc   1560

tttggtgaga ttagtatcct taacattaag ggtagcaaaa tgggcaatcg gcgcactgcc   1620

aatatccgta gtctgggcta ctcagatctc ttctgcttgt ccaaggatga tcttatggaa   1680

gctgtgactg agtatcctga tgccaagaaa gtcctggaag aacggggtag ggagatcctg   1740

atgaagatgg gtctactgga tgagaatgaa gtggcagcta gtatggaggt agatgttcag   1800

gagaagctgg agcagctgga gacaaacatg gagaccttgt acactcgttt tgcccgcctg   1860

ctggctgagt acactggagc ccagcagaag ctcaaacagc gcatcacagt gctggagacc   1920

aagatgaaac agaaccatga ggatgattac ctatcagatg ggataaacac ccctgagcca   1980

gctgttgctg aatag                                                    1995

<210>  7

<211>  687

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223> 修饰的水母发光蛋白

<400>  7

atgagcgtgc tgacccccct gctgctgcgc ggcctgaccg gcagcgcccg ccgcctgccc     60

gtgccccgcg ccaagatcca cagcctgccc cccgagggca agctgggcat catgaaggtg    120

aagctgacca gcgacttcga caaccccaag tggatcggcc gccacaagca catgttcaac    180

ttcctggacg tgaaccacaa cggccgcatc agcctggacg agatggtgta caaggccagc    240

gacatcgtga tcaacaacct gggcgccacc cccgagcagg ccaagcgcca caaggacgcc    300

gtggaggcct tcttcggcgg cgccggcatg aagtacggcg tggagaccga gtggcccgag    360

tacatcgagg gctggaagcg cctggccacc gaggagctgg agcgctacag caagaaccag    420

atcaccctga tccgcctgtg gggcgacgcc ctgttcgaca tcatcgacaa ggaccagaac    480

ggcgccatca ccctggacga gtggaaggcc tacaccaaga gcgccggcat catccagagc    540

agcgaggact gcgaggagac cttccgcgtg tgcgacatcg acgagagcgg ccagctggac    600

gtggacgaga tgacccgcca gcacctgggc ttctggtaca ccatggaccc cgcctgcgag    660

aagctgtacg gcggcgccgt gccctaa                                        687