一种适宜弱再生基因型甘薯茎尖培养植株再生的方法

技术领域

本发明涉及一种组织培养改良技术，具体是一种适宜弱再生基因型甘薯茎尖培 养植株再生的方法。

背景技术

我国是世界第一甘薯生产大国，年种植面积3.69×106hm²，占世界种植总面 积的45.06％，年总产8.52×107t，占世界总产量的77.38％(FAO，2008)。因此， 我国甘薯产业的发展对世界甘薯生产起着举足轻重的作用。近年来，甘薯病毒病 危害日趋严重，已成为限制甘薯产量增加和导致品质下降的主要因素。对于病毒 病的防治，由于高抗病毒品种尚未培育成功，也无有效地防治药剂，目前生产上 为了减轻病毒病带来的危害，最有效的方法就是生产和推广脱毒苗(薯)，其增 产效果十分显著，一般增产幅度为20-40％，甚至更高。现世界各甘薯生产国， 多采用茎尖分生组织培养的方法脱除甘薯病毒、繁育和生产脱毒种薯和种苗，以 提高甘薯产量和品质。但是，基因型是决定植株再生的最主要因素，许多甘薯优 良品种在生产上推广应用，病毒侵染后，由于再生能力弱，很难通过茎尖培养获 得大量脱毒苗，严重制约了优良品种的推广应用和缩短了优良品种服务生产的年 限；同样，在其它作物，如棉花等，也存在由于部分品种难以再生或再生能力较 弱，限制了转基因技术对品种的遗传改良。

发明内容

本发明提供一种适宜弱再生基因型甘薯茎尖培养植株再生的方法，通过利用 这一再生方法，弱再生基因型甘薯可以一次诱导成苗，再生率获得显著提高，均 超过80.0％；并且植株再生的时间也大大缩短，普遍为20-30d天，植株长势好， 生长速度快。

本发明是通过如下技术方案实现的：一种适宜弱再生基因型甘薯茎尖培养植 株再生的方法，选取弱再生基因型甘薯品种心香为试验材料，选取薯块催生嫩芽 为试验材料，在显微镜下剥取茎尖分生组织接种于一次性诱导植株再生培养基； 茎尖分生组织接种于诱导培养基后，首先经过暗培养；然后，在温度28±1℃、 光照10小时/天条件下培养；待芽分化后，将其转入光照培养箱，在暗培养条 件下培养，促进植株再生及节间的伸长；然后将再生植株转入常规MS基本培养 基、正常光照条件下进行繁殖培养。

所述的在显微镜下剥取的茎尖分生组织是接种于一次性诱导植株再生培养 基，MS基本培养基+NAA 0.1mg/L+6-BA 2.0mg/L+TDZ 0.1-1.0mg/L+4-FA 0.1 mg/L+蔗糖30g/L+Phytagel 2.5g/L，灭菌前调PH：5.8-6.0；进行培养的，这一配 方是在发明人前期大量组培工作及经验基础上，积极引进新型细胞分裂素4-FA， 在同NAA、6-BA、TDZ协同作用下，能显著提高弱再生基因型甘薯的植株再生 率。

所述的接种于一次性诱导植株再生培养基的茎尖分生组织，首先是经过32 ℃暗培养4-8天；暗培养有助于剥离茎尖分生组织的自身修复及细胞分裂的启 动，再同该进一次性诱导培养基的互作，进一步提高植株再生的频率。

所述的茎尖分生组织接种于一次性诱导植株再生培养基培养，待芽分化后， 转入光照培养箱，在35℃下暗培养；芽分化后，前人的通常情况是更换培养基 (去除植物生长调节剂)、光照培养；但是通过本实验发现，芽分化后，将其转 入35℃的培养箱中、暗培养，可以促进节间的快速伸长，加快了植株再生的速 度。

本发明的有益效果是：通过利用这一再生方法，弱再生基因型甘薯可以一次 诱导成苗，再生率获得显著提高，均超过80.0％；并且植株再生的时间也大大缩 短，普遍为20-30d天，植株长势好，生长速度快；该方法可操作性强、重复性 好；这一再生技术的改进，将有助于甘薯优良品种的脱毒培养及脱毒种苗(薯) 的推广应用，提高甘薯产量和品质。该方法可操作性强、重复性好。

附图说明

图1是利用本发明的再生方法与文献1(2011年，江西农业学报，10期， 作者：周志林，唐君等)方法心香再生率的对比图片。

图2是心香芽分化后，光照培养的图片。

图3是心香芽分化后，35℃暗培养的图片。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的方法和效果，但不限制本发明的保护范 围。

实施例1

1.试验材料和方法

1.1试验材料：甘薯品种：心香。

1.2试验方法：所选材料均来自薯块的催生嫩芽；在超净工作台内，所选外植体 均放在50ml烧杯内，经70％酒精灭菌45s，无菌水冲洗3-4次，然后，加0.1％HgCl₂消毒5-6min，去除Hgcl2溶液后，用无菌水冲洗3-4次，边洗边摇。将灭菌后 的材料，在解剖镜下取带有1-2个叶原基的茎尖分生组织，接种于一次性诱导植 株再生培养基中(MS基本培养基+NAA 0.1mg/L+6-BA 2mg/L+TDZ 0-1.0 mg/L+4-FA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+Phytagel 2.5g/L；MS基本培养基+6-BA 2mg/+ 蔗糖30g/L+Phytagel 2.5g/L L为对照；PH：5.8-6.0)，接种后的茎尖分别32℃， 暗培养0day、4day、8day、12day；待芽分化后，转入35℃、暗培养，促进植 株再生；植株再生后转入常规繁殖培养基(MS基本培养基+蔗糖20g/L+琼脂粉 9.0g/L；PH：5.8-6.0)。接种的茎尖每个重复16个，共计3个重复。培养条件为： (28±1)℃，日光灯冷光源强度为2400Lux。

1.3调查及数据统计：接种在诱导培养基上30天，统计成活率、芽分化率、植株 再生率；同时转入繁殖培养基。

2.结果与分析

2.1不同诱导培养基对茎尖诱导及植株再生的影响

研究发现，在20天调查时，心香已有植株再生；具体结果见表1：与对照 相比，培养基中添加NAA0.1mg/L+6-BA2.0mg/L+TDZ 0.5mg/L+4-FA0.1mg/L， 心香的芽分化率及植株再生率都得到了显著的提高，芽分化率最高达81.25％， 植株再生率为75％(见表1)。

表1：不同诱导培养基配方对芽分化率及植株再生率的影响

2.2暗培养处理对茎尖培养的影响

对接种在MS基本培养基+NAA 0.1mg/L+6-BA 2mg/L+TDZ 0.5mg/L+4-FA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+Phytagel 2.5g/L培养基上得茎尖，在32℃，分别暗培养处 理0、4、6、8天；由2可知：暗培养处理4-8天对提高芽分化率及植株再生率 具有一定的促进效果，芽分化率和植株再生率分别最高可达93.5％和87.5％。

表2：不同暗处理时间对茎尖培养的影响

3.这一发明的再生方法对弱再生基因型金玉、广薯79的再生效果验证

选用一次性诱导植株再生培养基(MS基本培养基+NAA 0.1mg/L+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 0.5mg/L+4-FA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+Phytagel 2.5g/L；灭菌前调PH： 5.8-6.0)；在32℃下暗培养4-8天；然后在温度28±1℃、光照10小时/天条 件下培养；待芽分化后，将其在35℃、暗培养条件下培养，促进植株再生。

如表3所示，金玉和广79植株再生率均超过80％，分别为90％和85.5％。

表3：弱再生基因型金玉、广薯79再生效果验证